Abstract

A infiltração de células mielóides no microambiente do tumor é frequentemente associada com a angiogênese reforçada e progressão do tumor, resultando em mau prognóstico em muitos tipos de câncer. O polipéptido de quimiocina PK2 (BV8, PROK2) tem sido demonstrado que regulam a mobilização de células mielóides da medula óssea, levando à activação do processo angiogénico, bem como a acumulação de macrófagos e neutrófilos no local do tumor. Os anticorpos neutralizantes contra PK2 foram mostradas para exibir eficácia anti-tumoral potente, ilustrando o potencial de PK2-antagonistas como agentes terapêuticos para o tratamento de cancro. Neste estudo demonstrar a actividade anti-tumor de um antagonista de PK2 molécula pequena, PKRA7, no contexto de glioblastoma e modelos de tumor de xenoenxerto de cancro do pâncreas. Para o glioblastoma altamente vascularizado, PKRA7 foi associada com a diminuição da densidade dos vasos sanguíneos e aumento da área necrótica na massa tumoral. Consistente com a actividade anti-angiogênico do PKRA7

in vivo

, este composto reduzido eficazmente células endoteliais microvasculares induzida por PK2 ramificação

in vitro

. Para o cancro do pâncreas pouco vascularizado, o efeito anti-tumor primário de PKRA7 parece ser mediada pelo bloqueio da migração de células mielóides /infiltração. Ao nível molecular, PKRA7 inibe a expressão induzida por PK2 de certas quimiocinas pró-migratórias e receptores de quimiocinas nos macrófagos. Combinando o tratamento PKRA7 com agentes quimioterápicos padrão resultou em efeitos avançados em modelos de xenotransplante para ambos os tipos de tumor. Tomados em conjunto, os nossos resultados indicam que a actividade anti-tumoral de PKRA7 pode ser mediada por dois mecanismos distintos que são relevantes para as características patológicas do tipo específico de cancro. Este antagonista pequena molécula PK2 mantém a promessa de ser desenvolvido como um agente eficaz para terapia de câncer de combinações

Citation:. Curtis VF, Wang H, Yang P, McLendon RE, Li X, Zhou Q-Y, et al. (2013) A PK2 /BV8 /PROK2 Antagonista Suprime Processos tumorigenos por inibição da angiogénese em glioma e Bloqueio infiltração de células mielóides no cancro do pâncreas. PLoS ONE 8 (1): e54916. doi: 10.1371 /journal.pone.0054916

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão

Recebido: 25 de junho de 2011; Aceite: 17 de dezembro de 2012; Publicação: 23 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Curtis et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este foi suportado por CA151541 a XFW do Instituto Nacional do Câncer (www.cancer.gov) e pela MH67753 para QYZ de Institutos Nacionais de Saúde (www.nimh.nih.gov). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O microambiente do tumor complexo é um importante contribuinte para a tumorigênese. Nos últimos anos, aumentou o foco foi colocado no direccionamento das células estromais no microambiente do tumor que são responsáveis ​​por vários aspectos do processo tumorigénico. Osso células mielóides derivadas de medula, que são precursores de macrófagos, neutrófilos e células supressoras derivadas de mielóides, representam uma sub-população de células estromais que desempenham papéis importantes durante a progressão tumoral [1]. Em resposta a citocinas /quimiocinas secretadas por células tumorais, células mielóides podem ser mobilizadas a partir da medula óssea e se infiltrar em locais de tumores onde eles podem promover o crescimento, invasão e angiogénese de apoio à expansão tumoral e metástase [2]. Por exemplo, CSF3 (factor estimulador de colónias 3), também conhecido como G-CSF, produzido por células tumorais pode conduzir à diferenciação de CD11b

+ Gr1

+ células mielóides em neutrófilos, macrófagos, e células dendríticas, que têm sido mostrados para ser overproduced em doentes com cancro e ratos portadores de tumor [1], [3] – [4]. No local do tumor, estes CD11b

+ Gr1

+ células mielóides secretar uma variedade de fatores que podem contribuir directamente para o crescimento angiogênese e tumor [5] – [6].

Entre os fatores produzidos pela CD11b

+ Gr1

+ células mielóides é prokineticin 2 (PROK2), referido como PK2 neste documento, também conhecido como BV8. Como um de dois membros da família prokineticin, PK2 liga-se a dois receptores acoplados à proteína G altamente relacionados (GPCRs), PROKR1, referido como PKR1 e PROKR2, referido como PKR2, e afecta vários processos biológicos, incluindo a nocicepção, ritmo circadiano , motilidade gastrointestinal, neurogénese, a hematopoiese e a angiogénese [7]. produção PK2 por CD11b

+ Gr1

+ células mielóides pode levar à formação de um circuito fechado de realimentação positiva, com diferenciação aumentada dessas células precursoras mielóides em macrófagos, assim como o aumento na mobilização dessas células a partir da medula óssea em o fluxo de sangue [8]. Estes macrófagos diferenciados pode então infiltrar o microambiente tumoral e continuar a segregar mais PK2, levando ao aumento da proliferação e migração de células endoteliais que expressam PKR1 e PKR2, contribuindo assim para a angiogénese aumentada [8]. Além disso a estimulação de células endoteliais, PK2 foi mostrada para afectar a produção de citocinas em linfócitos de ratinho, aumentando citocinas pró-inflamatórias de IL-1b e IL-12 e decrescentes citocinas anti-inflamatórias de IL-4 e IL-10 [9] – [10] . receptores PK2 também são expressos em macrófagos do rato e em células endoteliais; consequentemente PK2 pode induzir a migração de macrófagos e estes afectam a formação de estruturas do tipo capilar das células endoteliais [10] – [13]

Devido aos papéis importantes de PK2 na criação de um tumor microambiente tumoral favorecendo. o crescimento e a progressão, PK2 tornou-se um alvo para o desenvolvimento de novas terapias de cancro. Um número de estudos foram convincentemente demonstrado que anticorpos neutralizantes contra PK2 pode exibir um efeito anti-tumoral potente em vários tipos de cancros humanos em modelos de ratinho [1], [6], [8]. Esses resultados positivos a partir do tipo de prova de princípio de experimentos têm lançado os alicerces para o desenvolvimento de agentes anti-PK2 em terapêutica. Neste estudo, relatamos nossas descobertas sobre a actividade anti-tumoral de uma pequena molécula sintética de antagonista PK2, PKRA7 que pode competir para a ligação de PK2 aos seus receptores PKR1 e PKR2, consequentemente, inibindo a capacidade de PK2 para activar percursos a jusante [ ,,,0],Zhou, manuscrito em preparação]. Escolhemos para testar PKRA7 em dois tipos de tumores, o glioblastoma e o cancro do pâncreas, que têm persistentemente exibiu o pior prognóstico entre todos os cancros, devido à falta de uma terapia eficaz. Os dois tipos de exibição câncer drasticamente diferentes características patológicas. O glioblastoma é altamente vascularizado e tem mostrado alguma sensibilidade à terapia anti-angiogénica, ao passo que o cancro do pâncreas é muitas vezes pouco vascularizado, mas altamente fibrótico com uma grande parte da massa tumoral consistindo em componentes do estroma, incluindo macrófagos infiltrados [14] – [16]. No entanto, uma característica comum de ambos glioblastoma e cancro pancreático é o envolvimento de células mielóides [17] – [20]. Esperávamos para determinar se PKRA7 poderia ter um impacto sobre o crescimento do tumor através do seu efeito inibitório sobre as células mielóides. Consistente com este postulado, os nossos resultados demonstram claramente que PKRA7 possui uma actividade anti-tumoral forte para ambos os tipos de cancros, embora por mecanismos diferentes. Além disso, nosso estudo indica que PKRA7 tem o potencial para se tornar um componente de terapias de combinação com o tratamento padrão usado atualmente na clínica e este composto tem a promessa de um maior desenvolvimento para o tratamento desses tipos de câncer que atualmente têm prognóstico muito pobre.

resultados de

PKRA7 suprime o crescimento de tumores em Nude (nu /nu) mouse Xenoenxerto Modelo de Glioblastoma através da inibição da angiogênese

Apesar de um anticorpo neutralizante anti-PK2 foi encontrado por estudos anteriores para mostrar anti- a actividade do tumor, exploramos a possibilidade de que as moléculas pequenas podem ser desenvolvidos para conseguir a mesma eficácia anti-tumor com custos mais baixos e mais fácil de entrega. Depois de definir bioquimicamente a natureza molecular das interacções entre PK2 e os seus receptores [21], determinámos a sequência de hexa-peptideo de aminoácidos AVTIGA no N-terminal de PK2 é completamente conversed entre as espécies de mamíferos e não mamíferos e é crítica para a activação PKR1 e PKR2 [22]. Mutações nesta região, incluindo a substituição de A1M (alanina para metionina) ou adição de metionina ao terminal N apresentou actividade antagonista forte na presença de ambos PKR1 PKR2 e expresso de forma estável em ovário de hamster chinês (CHO) [22]. Seguindo esta descoberta inicial, sintetizaram mais de 200 compostos de moléculas pequenas que mimetizam estruturalmente o PK2 região N-terminal péptidos mutantes e testaram a sua capacidade para inibir competitivamente a activação de receptores de PK2. A partir deste ecrã inicial, verificou-se mais de 60 compostos solúveis em água que apresentam efeito inibitório sobre a interacção do receptor com PK2 constante de ligação inferior a 20 nM (Zhou, manuscrito em preparação). Nós escolhemos composto PKRA7 para as nossas experiências, pois poderia potencialmente inibir receptores PK2, com valores de IC50 de 5,0 e 8,2 nM para PKR1 e PKR2, respectivamente (Figura S1), e, mais importante, que pode penetrar a barreira sangue-cérebro, uma característica que pode ser fundamental para o tratamento do glioblastoma.

para estudar o

in vivo

efeito de PKRA7 no crescimento do tumor glioblastoma, primeiro gerado xenoenxertos de tumor de glioblastoma humano por via subcutânea em ratinhos nus. 5 × 10

células de glioma 4 D456MG foram implantadas em dez ratinhos nus por via subcutânea, e os ratinhos foram divididos em dois grupos de tratamento de 14 dias após o implante. Os ratinhos no primeiro grupo recebeu uma injecção intraperitoneal (IP) de tratamento de PEG400 (polietileno glicol) controlo diluídos 1:10 em PBS, enquanto o segundo grupo de ratinhos receberam injecções IP de PKRA7 na mesma solução a uma dose de 20 mg /kg /dia. Os tamanhos dos tumores foram monitorizados a cada três dias e as curvas de crescimento foram gerados (Figura 1A). 30 dias após a implantação, os tumores foram isolados após os ratinhos foram sacrificados e pesados ​​(Figura 1B). Ratos tratados com PKRA7 mostrou uma diminuição clara tanto a taxa de crescimento do tumor D456MG e peso do tumor. Para determinar o mecanismo através do qual PKRA7 inibiu o crescimento tumoral de xenotransplante, medimos potenciais alterações na densidade dos vasos sanguíneos e o grau de necrose em tumores D456MG tratado ou não tratado com este composto. Como mostrado na Figura 1C-F, uma diminuição notável na densidade relativa do vaso sanguíneo e um aumento significativo nos domínios de regiões necróticas de tumores tratados com PKRA7 foram observadas em comparação com os controlos, sugerindo que PKRA7 podem suprimir a formação de tumores, principalmente através da inibição da angiogénese através PKR1 PKR2 e expresso em células endoteliais de uma forma semelhante à dos anticorpos-neutrolizing PK2 [8], [12] -. D456MG células [13]

(a) foram injectados SC em ratinhos nus, e controlo ( n = 5) ou PKRA7 (n = 5) o tratamento foi iniciado quando os tumores se tornarem visualmente detectável (dia 14). As medidas foram tomadas a cada 2-3 dias. (B) O peso médio do tumor de controle e tumores de ratos tratados PKRA7 após a remoção. coloração (C) IHC usando o marcador de células endoteliais CD34 em tumores D456MG SC de ratinhos tratados com o controle ou PKRA7. (D) de probabilidade cumulativa de navio densidade relativa, medida por coloração com CD34. densidade vascular de tumores diminuiu com o tratamento PKRA7. (E) imagens representativos de H E a coloração de secções de controlo e os tumores SC tratados com PKRA7 (F) Quantificação de regiões necróticas de 5 lâminas de cada tumor por grupo de tratamento, as percentagens de áreas necróticas foram medidos por ImageJ (* p≤0.05 ). (L) 1 × 10

4 D456MG células foram IC injectada em ratinhos nus e o tratamento foi iniciado 7 dias após a implantação do tumor. Os ratinhos do controlo (n = 8) ou o tratamento PKRA7 (n = 9) grupo foram sacrificados quando desenvolveram fenótipo neurológico grave indicativo do crescimento do tumor por via intracraniana.

Com base nestes resultados promissores com a supressão da subcutânea formação do tumor por PKRA7, foram empregados inoculação intracraniana de células de glioma para avaliar a capacidade de PKRA7 para inibir o crescimento do tumor em um ambiente patologicamente relevantes. Desta vez, o tratamento foi iniciado 7 dias após 1 × 10

4 D456MG inoculação de células de glioma com injecções IP diárias de PKRA7 ou controlo de veículo. Os ratinhos foram sacrificados quando os sinais neurológicos da carga tumoral em crescimento tornou-se evidente e as datas foram registadas para gerar uma curva de Kaplan-Meier (Figura 1G). Neste ensaio, o tratamento com PKRA7 prolongada sensivelmente o aparecimento dos sinais neurológicos de carga tumoral (sobrevivência de 38,4 dias versus 34,1 dias para PKRA7 e de controlo, respectivamente, p £ 0,05 significar), indicando que PKRA7 foi eficaz na inibição do crescimento do tumor no ambiente intracraniana. Foram obtidos resultados semelhantes com outra linha de células de glioma como para as células D456G (dados não mostrados).

PKRA7 suprime o crescimento do tumor in nude (nu /nu) Rato Modelo de Xenoenxerto de Cancro do pâncreas através da inibição da infiltração do macrófago

a seguir, testaram se PKRA7 poderia ter um impacto sobre o crescimento do xenoenxerto de células cancerosas pancreáticas humanas devido ao papel bem estabelecido de células mielóides na formação de câncer de pâncreas. 5 × 10

5 células ASPC-1 foram inoculadas subcutaneamente em ratinhos nus e o tratamento foi iniciado 7 dias após o implante seguindo o mesmo procedimento como com as células de glioma D456MG. Como mostrado na Figura 2A, a taxa de crescimento das células do ASPC-1 foi suprimida por PKRA7, resultando numa redução significativa no peso médio dos tumores (Figura 2B). Resultados semelhantes foram obtidos quando uma linha diferente pancreático humano de células de cancro, CFPAC-1, foi usada no lugar de ASPC-1 (Figura células S2).

(A) células ASPC-1 foram injectados SC em ratinhos nus e controle (n = 4) ou PKRA7 (n = 5) o tratamento foi iniciado quando os tumores se tornarem visualmente detectável (dia 9). As medidas foram tomadas a cada 2-3 dias. (B) O peso médio do tumor de controle e tumores de ratos tratados PKRA7 após a remoção (* p≤0,05). (C) Representante H E desliza de controle e tumores PKRA7 tratada. (D) Quantificação de regiões necróticas de 5 lâminas de cada tumor por grupo de tratamento, porcentagens de áreas de necrose foram medidos por ImageJ (p = 0,205719). coloração (E) IHC utilizando F4 /80 rato macrófagos marcador da ASPC-1 tumores SC tratados com controlo ou PKRA7. (F) Quantificação de infiltração de macrófagos média de ASPC-1 tumores tratados com controlo (n = 4) ou PKRA7 (n = 5), 5 slides de cada tumor por grupo de tratamento (* p £ 0,05).

para determinar o mecanismo potencial subjacente à redução significativa no crescimento do tumor devido ao tratamento PKRA7, examinámos secções de tumores quanto a sinais de alterações na angiogénese e necrose. Não houve diferença na densidade de vasos sanguíneos embora houvesse menos vasos por campo de observação em comparação com a das secções de glioblastoma (dados não mostrados) e foram observados níveis semelhantes de necrose dos tumores derivados de tratados e ratinhos de controlo (Figura 2C, D). Em contraste, houve uma diminuição significativa no número de macrófagos infiltrados em tumores isoladas a partir de ratinhos tratados com PKRA7 como medido por coloração intensidade do rato macrófagos marcador F4 /80 (Figura 2E, F). Estes resultados sugerem fortemente que PKRA7 poderia inibir o crescimento do tumor pancreático através de um mecanismo diferente, bloqueando PKR1- e macrófagos que expressam PKR2-se infiltre no microambiente do tumor em vez de suprimir a angiogénese, uma observação consistente com as características fenotípicas do cancro pancreático humano como pouco vascularizado, mas exibindo fibrose desmoplastic abundante e contendo grande número de células mielóides infiltrados incluindo macrófagos [10], [15].

PKRA7 Inibe células endoteliais capilares Ramificação e mielóide migração celular

os resultados do

in vivo

estudos de xenoenxertos de glioma de humano e células de cancro do pâncreas apoiou fortemente a noção de que a actividade anti-tumoral de PKRA7 poderia ser mediada através de dois mecanismos muito diferentes. Para investigar ainda mais este, ao nível celular, foi realizada em>

ensaios para avaliar o impacto de PKRA7 sobre a actividade angiogénica das células endoteliais, assim como a capacidade migratória das células mielóides. células para determinar se PKRA7 afeta a capacidade das células endoteliais para formar rede de tubo, capilar como um importante indicador da angiogênese [23], foram empregados imortalizadas humanas microvasculares endoteliais (IHMVECs). As células foram tratadas com 200 ng /ml PK2 recombinante sozinho ou PK2 mais 1 ug /mL PKRA7 e plaqueadas sobre uma camada fina de Matrigel. Esta concentração de PKRA7 foi utilizado em nossos

in vitro

experimentos porque é perto da concentração de PKRA7 na circulação dos ratos do nosso

in vivo

experiências enquanto restantes não-tóxico para as células em de cultura de tecidos (dados não apresentados). Como mostrado na Figura 3A, PKRA7 eficazmente inibida capilar induzida por PK2 ramificação tal como medido pelo número de conexões entre as células, mas não teve efeito sobre capilar induzida por VEGFA ramificação (quantificação apresentada na Figura 3B). Resultados idênticos foram obtidos usando duas linhas de células endoteliais adicionais: rato embrionários células endoteliais e células endoteliais microvasculares humanas primárias (dados não mostrados). A especificidade da actividade anti-PK2 neste ensaio foi ainda confirmada pela demonstração de um efeito semelhante ao do anti-soro policlonal anti-PK2 (Figura S3 e dados não mostrados). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que PKRA7 podem inibir especificamente o efeito angiogénico de PK2 em células endoteliais.

IHMVECs (A) foram semeadas em Matrigel em grupos de tratamento indicados. Fotografias representativas que foram tomadas a 8 horas após o plaqueamento. (B) Número médio de conexões entre as células foram contadas e analisadas. Os resultados são dados normalizados a partir de 3 experiências independentes. A adição de PKRA7 bloqueia significativamente capilar ramificação (* p £ 0,05) PK2-induzida. (C) 1 × 10

5 células THP-1 na câmara superior de transwells foram deixadas migrar durante 4 horas. As células foram fixadas, coradas e o número de células por campo de visão contadas. Os resultados são a média normalizada de 3 experiências independentes. A adição de PKRA7 bloqueou significativamente a migração de monócitos induzida por PK2 (* p £ 0,05). (D) 7,5 x 10

4 RAW264.7 células na câmara de topo de transwells foram deixadas migrar durante 18 horas. As células foram fixadas, coradas e o número de células por campo de visão contadas. Os resultados são a média normalizada de 3 experiências independentes. A adição de PKRA7 bloqueou significativamente a migração dos macrófagos induzida PK2 (* p £ 0,05). (E) luminescência médio medido do local do tumor após injecção IP de células RAW marcado com luciferase em controle (n = 4) ou PKRA7 (n = 4) murganhos tratados com SC ASPC-1 tumores 30 dias após a implantação. A média total das contagens de luciferase foram mais baixos nos ratos tratados com PKRA7 em comparação com o controlo (p £ 0,05 *). ensaio (F) qPCR para medir o efeito de PKRA7 sobre a expressão das quimiocinas e receptores de quimiocinas que foram identificadas para ser induzida por tratamento PK2. Os dados sobre as mudanças de nível de mRNA foram mostrados como log2 das alterações de valor Ct. PKRA7 inibe a regulação positiva de CCL27, CCR10, CCR4, CCR5 e CCR6 (* p≤0,05).

Para determinar o efeito da PKRA7 sobre a migração induzida por PK2 de células mielóides, empregamos a monócitos humanos a linha celular THP-1 utilizando um ensaio de migração Transwell. Como mostrado na Figura 3C, 1 ug /ml PKRA7 auditivos eficazmente a migração induzida por PK2 de células THP-1, mas não a migração destas células no sentido de CCL2 ou monócito, proteína quimiotática 1 (MCP-1), um quimioatractivo conhecido de THP -1 [24] – [25]. Quase resultados idênticos foram obtidos com a linha celular de macrófagos de rato, com RAW264.7 PKRA7 bloquear especificamente a migração induzida por PK2 mas não migração induzida por CXCL12, aqui referido como o SDF-1α (Figura 3D). Portanto, PKRA7 inibe especificamente a migração induzida por PK2 de células mielóides de ambas as origens humanas e de murino.

Para avaliar o impacto da PKRA7 sobre a migração /infiltração de macrófagos de camundongos no microambiente de tumores xenoenxerto formado por células cancerosas pancreáticas humanas , medimos acumulação nos tumores de células RAW264.7 de macrófagos marcados com luciferase 24 horas após a sua injecção IP em ratinhos nu 30 dias após a implantação subcutânea de células cancerosas ASPC-1. Como se mostra na Figura 3E, uma diminuição significativa no sinal luminescente emitida pelas células de macrófagos de ratinho foi observada em camundongos tratados com PKRA7 em comparação com a dos ratinhos de controlo. Estes resultados indicam que PKRA7 é capaz de bloquear a migração de macrófagos /infiltração no local do tumor em um

In vivo

configuração, inibindo, assim, a capacidade dos macrófagos para contribuir positivamente para o crescimento de tumores de xenoenxerto.

para examinar melhor o mecanismo pelo qual os blocos PKRA7 PK2 induzida migração de macrófagos, foi realizada uma série de citocinas usando o tempo quantitativa real PCR em células THP-1 que foram induzidas a se diferenciarem em células de macrófagos. Entre um conjunto de ligandos de quimiocina 95 /citocina humanos e seus receptores, cinco exibida uma indução significativa da sua expressão após tratamento com PK2 incluindo CCL27, CCR10, CCR4, CCR5, CCR6 e (Figura S4). Importante, pelo menos quatro destas moléculas induzidas são conhecidas por estarem envolvidas no aumento da migração de células mielóides e de toda a sua indução por PK2 foi tornado rombo por PKRA7 (Figura 3F), sugerindo fortemente que a supressão da produção induzida por PK2 destas quimiocinas e receptores subjaz o principal mecanismo da actividade anti-tumoral de PKRA7 no contexto do câncer de pâncreas.

PKRA7 aumenta a eficácia da standard terapias para Glioblastoma e cancro do pâncreas em modelos de xenotransplante

Embora PKRA7 exibidos fortes actividades anti-tumor em ambos os contextos de glioblastoma e o cancro do pâncreas, é pouco provável que seja desenvolvido em um agente terapêutico utilizado sozinho. Para testar se PKRA7 poderia aumentar a eficácia do tratamento quimioterapêutico padrão para o glioblastoma, examinámos o efeito do presente composto em combinação com temozolomida, que é actualmente utilizado na clínica para esta doença [26] – [27]. Seguindo um procedimento experimental criado para avaliar o efeito da terapia combinatória em modelos de murganho de xenoenxerto de [28] – [29], 1 × 10

4 células D456MG foram implantadas intracranialmente e seguido por tratamento com 10 mg /temozolomida kg durante cinco dias, e, em seguida, com ou sem administração PKRA7 durante os restantes dias dos experimentos. Como mostrado na Figura 4A, o tratamento com ambos temozolomida e PKRA7 prolongou o aparecimento dos sinais neurológicos da carga tumoral em comparação com os ratinhos que receberam controlo, temozolomida ou PKRA7 sozinho, indicando um efeito melhorado de terapia combinatória com os agentes para inibir o crescimento de glioma intracraniano em ratos nus (sobrevivência média de 49,8 dias para PKRA7 mais temozolomida vs 44,6 dias para ambos os temozolomida ou PKRA7 sozinho vs 38,6 dias para o controle).

(A) curva de Kaplan-Meier de ratinhos nus após temozolomida e tratamento PKRA7 após a injecção IC 1 × 10

células 4 D456MG. O tratamento com 10 mg /kg ou temozolomida controlo iniciado 3 dias após a injecção de IC para um total de 5 tratamentos diários consecutivos. O tratamento com PKRA7 ou controle começaram 7 dias após a injecção de IC e continuou durante todo o período de experiência. 5 ratos por condição. (B) AsPC-1 foram injectados SC em ratinhos nus, e de controlo (n = 10) ou PKRA7 (n = 10) o tratamento foi iniciado quando os tumores eram visíveis (7 dias). O tratamento com 100 mg /kg de gemcitabina (n = 10) ou de controlo (n = 10) foi iniciado 7 dias após a implantação do tumor e foi administrada a cada 4 dias durante duas semanas para um total de 4 tratamentos (#). As medidas foram tomadas a cada 3 dias. 5 ratos por condição. (C) Peso médio do tumor de controle, gemcitabina, PKRA7 e gemcitabina com tumores de ratos tratados com PKRA7 após a sua remoção (* p≤0,05).

Para o câncer de pâncreas, gemcitabina é um dos quimioterápicos principal fármacos actualmente utilizados na clínica e foi testado anteriormente em estudos com terapêutica associada envolvendo células ASPC-1 [30]. Nas nossas experiências, 5 x 10

5 células ASPC-1 foram implantados subcutaneamente em ratinhos nus que foram tratados com PKRA7 e gemcitabina (100 mg /kg) 7 dias mais tarde. Como mostrado na Figura 4B, é evidente que os tumores de ratinhos recebeu tanto a gemcitabina e PKRA7 foram significativamente menores do que os de ratinhos tratados apenas com gemcitabina ou PKRA7. Estes resultados sugerem que a terapia combinatória com gemcitabina e PKRA7 poderia ter um efeito anti-tumoral mais forte do que a terapia convencional para reduzir o crescimento do tumor pancreático de xenoenxerto de cancro no nosso modelo.

Discussão

Tumorigênese é um complexo processo que envolve muito mais do que as células em proliferação do tumor. As células tumorais são auxiliados e suportado por o microambiente circundante do tumor estromal que é rico com uma mistura heterogénea de células, tais como fibroblastos, células endoteliais e células do sistema imune [31]. Estas células respondem aos sinais do tumor em expansão por fatores próprios que podem perpetuar o sinal de crescimento, remodelar a matriz extracelular, contribuem para a angiogênese e reorientar o papel das células do sistema imunológico secretoras. A angiogénese tem sido entendida para ser uma parte importante de tumorigénese e muitos estudos têm sido feito para bloquear este processo [32]. Enquanto fatores angiogênicos importantes foram identificados como o VEGF, terapêutica contra a via de sinalização VEGF não ter sido provada a ser universalmente bem sucedido. De facto, muitos cancros são resistentes à terapia anti-VEGF ou tornam-se refractários a administração destas terapias, resultando na recorrência que é, por vezes, mais agressivo do que o tumor primário [14], [16], [33] – [38].

Há uma necessidade de identificar e atingir as vias de sinalização adicionais que podem contribuir para a angiogénese ou outros processos que têm sido mostrados como sendo importantes para a progressão do tumor, tais como a infiltração de macrófagos. PK2 e os seus receptores são parte de uma via de sinalização envolvidos na mobilização de células mielóides [8]. Vários estudos têm mostrado que o CD11b

+ Gr1

+ células precursoras mielóides podem contribuir para a angiogénese e tumorigénese em uma variedade de tipos de cancro [8], [37], [39]. Os macrófagos derivados dessas células precursoras no microambiente do tumor também podem segregar citoquinas que afectam directamente o crescimento de células tumorais. Em estudos recentes, a eficácia anti-tumor de um anticorpo anti-PK2 foi comparado com o tratamento com um anticorpo anti-VEGF e verificou-se ser quase tão eficaz na prevenção da progressão da doença, de um modelo de ratinho transgénico de tumorigénese de células β pancreática, enquanto a combinação dos dois anticorpos mostrou um efeito ainda mais pronunciado na inibição do crescimento de diferentes linhas subcutânea de células de cancro humanas (cancro do cólon, rabdomiossarcoma) e células de tumor de rato (mastocitoma, linfoma) [8], [39]. tratamento com anticorpo anti-PK2 também reduzido o número de circular e CD11b infiltrantes do tumor

+ Gr1

+ células mielóides, incluindo macrófagos derivados de medula óssea, que foram mostrados para mediar a refractariedade para terapias anti-VEGF em vários rato modelos de tumor de xenoenxerto de [8], [37]. Esses estudos têm indicado PK2 como um alvo legítimo para a terapia do cancro.

terapias baseadas em anticorpos representam uma parcela significativa de opções de tratamento do câncer em clínicas de hoje. No entanto, os estudos com pacientes e modelos de ratinho de glioblastoma e o cancro do pâncreas têm mostrado que estes tipos de cancro podem ser resistentes ou refractários para terapias de sinalização anti-VEGF [14], [16], [33], [35] – [37] . Outros estudos têm mostrado que esta resposta resistentes podem ser comuns a tipos adicionais de cancro tal como cancro da mama e cancro do cólon [34], [40] – [41]. Os pacientes podem beneficiar de terapias adicionais que têm como alvo vias alternativas em combinação com terapias anti-VEGF de sinalização para evitar respostas refratários. Assim, os inibidores de moléculas pequenas oferecer uma abordagem terapêutica alternativa, porque ainda pode ser mais específico para os seus alvos sendo mais rentável de fabricar. Além disso, algumas terapias de droga são obrigados a atravessar a barreira sangue-cérebro para o tratamento de doenças, tais como inibidores de glioblastoma e de pequenas moléculas são bons candidatos para este propósito. A este respeito, a demonstração de que PKRA7 é capaz de penetrar a barreira sangue-cérebro do rato e actua de modo a inibir a formação de tumores de xenoenxerto intracraniana por células de glioma apresenta uma estratégia alternativa para inibir a angiogénese do tumor através de um mecanismo distinto do que de anti-VEGF desde PK2 aumenta a angiogênese através de suas vias de receptores activados acoplados à proteína G [7].

estroma desmoplásico é uma característica definidora de câncer pancreático e podem conter níveis elevados de macrófagos associados a tumores (TAMs), especialmente na frente invasiva de câncer pancreático [15], [18]. Essa infiltração de macrófagos é pensado para contribuir para a progressão da doença e está associado com prognóstico pobre [18]. Estudos recentes relatam que as células imunossupressores incluindo TAM, células supressoras derivadas mielóides (MDSCs) e células T reguladoras (T

reg) foram encontrados em níveis elevados no início ou em estágios tardios da progredindo cancro, em comparação com o tecido normal em um modelo de mouse pré-invasivos e invasivos ductal pancreático adenocarcinoma [42]. PK2 pode desempenhar um papel crítico na relação complexa e dinâmica entre as células de cancro do pâncreas e essas células estromais por meio da regulamentação do recrutamento e da atividade de células mielóides. Com efeito, verificou-se que PK2 induz a produção de quimiocinas e receptores envolvidos na migração de células mielóides e PKRA7 poderia bloquear esta indução (Figura 3F). Os receptores de quimiocina, CCR10 e CCR4, conhecidas por responderem a quimio-atractores CCL27, MCP-1, e CCL22, demonstraram ser críticos na indução de mobilização e homing de células mielóides e de leucócitos para o local do tumor [43]. O receptor de quimiocina e o seu CCR6 CCL20 ligando têm sido implicados na migração de células dendrítica e parecem ser importantes para a manutenção de um nível normal da população de macrófagos desde CCR6

– /- ratos mostraram um decréscimo no número de células de macrófagos [44]. Os nossos estudos mostraram que os tumores pancreáticos são pouco vascularizado e contêm relativamente poucas células endoteliais nos ratinhos não tratados e confirmou que as alterações na densidade vascular devido a inibição de PKR por PKRA7 nos ratinhos tratados provavelmente seria muito pequeno e difícil de detectar.