Abstract

Fundo e Objective

The Sims prognóstico variou entre os pacientes com a mesmo palco, portanto, houve uma necessidade de novos fatores prognósticos e preditivos. O objetivo deste estudo foi avaliar a relação dos marcadores biológicos relacionados com a apoptose, tais como p53, bcl-2, bax, e c-myc e características clínico-patológicas e seu valor prognóstico.

Métodos

de 1996 a 2007, 4426 pacientes foram submetidos a gastrectomia curativa D2 para câncer gástrico na Universidade Fudan Shanghai cancer Center. Entre 501 pacientes, os níveis de expressão de p53, Bcl-2, Bax, e c-myc foram analisados ​​por imuno-histoquímica. O valor prognóstico dos marcadores biológicos ea correlação entre os marcadores biológicos e outros fatores clínico-patológicos foram investigados.

Resultados

Havia 339 homens e 162 mulheres, com uma idade média de 57. As porcentagens de positivo expressão de p53, Bcl-2, Bax, e c-myc foram 65%, 22%, 43%, e 58%, respectivamente. Houve uma forte correlação entre p53, Bax e expressão de c-myc (

P

= 0,00). Houve associação significativa entre bcl-2, e expressão Bax (

P Art 0,05). expressão da p53 correlacionados com grau histológico (

P

= 0,01); Bcl-2 com o estádio patológico (

P

= 0,00); expressão Bax com masculino (

P

= 0,02), grau histológico (

P

= 0,01), tipo Borrmann (

P

= 0,01), localização do tumor (

P

= 0,00), metástase ganglionar (

P

= 0,03), e estágio patológico (

P

= 0,03); expressão de c-myc com o tipo de Borrmann (

P

= 0,00). Bcl-2 foi relacionada com boa sobrevida na análise univariada (

P

= 0,01). A análise multivariada mostrou que a proteína Bcl-2 expressão e estágio patológico foram definidos como fatores prognósticos independentes. Houve diferenças significativas de taxas de sobrevida global em 5 anos de acordo com a Bcl-2 expressão ou não em fase IIB (

P

= 0,03).

Conclusão

A expressão de Bcl-2 foi um fator prognóstico independente para pacientes com câncer gástrico; que poderia ser um candidato para o sistema de estadiamento do câncer gástrico

Citation:. Liu X, Cai H, Huang H, Long Z, Shi Y, Wang Y (2011) o significado prognóstico da apoptose relacionada Marcadores Biológicos em chineses gástricas pacientes com câncer. PLoS ONE 6 (12): e29670. doi: 10.1371 /journal.pone.0029670

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão

Recebido: 29 de junho de 2011; Aceito: 02 de dezembro de 2011; Publicação: 28 de dezembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Embora a incidência de câncer gástrico foi substancialmente em declínio. por várias décadas, ainda era o quarto câncer mais comum ea segunda causa mais frequente de morte por câncer [1], [2]. Era muito importante para predizer com precisão o risco de mau prognóstico a fim de maximizar o efeito terapêutico e minimizar os efeitos adversos no tratamento de doentes com cancro. Entre os fatores prognósticos agora disponíveis para o câncer gástrico, o fator prognóstico mais preciso e importante foi o palco UICC TNM. Como resultado da variabilidade de prognóstico dentro da mesma fase de cancro gástrico, não foi possível prever com precisão o prognóstico através dos procedimentos de preparação convencionais. Portanto, era essencial para procurar os outros fatores específicos para identificar subgrupos de pacientes com curso mais agressivo da doença. Recentemente, alguns estudos têm mostrado que outros fatores patológicos, tais como o número de linfonodos positivos, a presença de comprometimento dos linfonodos extracapsular, eo tamanho do tumor tinha valor prognóstico adicional [3] – [5]. Tendo em conta que alguns marcadores biológicos, tais como oncogenes, genes supressores de tumores, reguladores do ciclo celular, e genes de reparo de DNA, foram relacionados à gênese do tumor, crescimento, invasão e metástase, muitos cientistas foram dedicados à busca de novos fatores prognósticos com estes marcadores moleculares. Apesar do facto de que alguns dos estudos avaliaram o significado prognóstico dos marcadores, tais como p53, Bcl-2, Bax, e c-myc em cancro gástrico, os resultados foram controversos [6] – [11]. Além disso, esses estudos anteriores foram realizados para investigar o valor prognóstico adicional dos marcadores para a 6ª etapa UICC TNM, era urgente para elucidar a relação entre estes fabricantes e da 7ª fase UICC TNM. Por fim, não houve estudos que avaliaram a expressão destes significado prognóstico moleculares em pacientes com câncer gástrico na China. Portanto, avaliou-se a expressão de marcadores biológicos, tais como p53, Bcl-2, Bax, e c-myc no presente estudo.

proteínas p53 foram os produtos dos genes supressores de tumores, que funcionou por modulação da proliferação celular através do controlo do checkpoint paragem em G1 do ciclo celular [12], [13]. Bcl-2 e Bax pertencia à família Bcl-2, e o segundo foi uma das classes mais importantes de moléculas reguladoras da apoptose. A família Bcl-2 foram classificados em duas subfamílias: proteínas anti-apoptose (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, BFL-1, gabar-1, e Mcl-1) e as proteínas pró-apoptose (Bax, Bak , Bcl-Xs, mau, lance e HRK) [14]. Demonstrou-se que o Bax para Bcl-2 pode afectar a sensibilidade relativa ou resistência de células apoptóticas para o estímulo [15]. proteína de c-myc era um tipo de factor de transcrição. Um estudo anterior demonstrou a expressão de c-myc foi ligada à proliferação de células [16].

Neste estudo, avaliou-se a expressão de marcadores biológicos, tais como p53, Bcl-2, Bax, e c-myc, correlacionados a sua expressão com as características clínico-patológicas e avaliou seu valor prognóstico.

Materiais e Métodos

Os pacientes

Durante janeiro de 1996 e dezembro de 2007, 4426 pacientes com diagnóstico histológico de submetidos adenocarcinoma gástrico primário gastrectomia D2 curativo no Departamento de câncer de estômago e de Tecidos Moles Sarcoma na Universidade Fudan Shanghai Cancer Center. Destes pacientes, foram selecionados 501 casos, como suas amostras foram coradas por imunohistoquímica após a operação com o exame histológico de rotina. Os dados foram obtidos a partir de relatórios operacionais e patológicos dos pacientes e dados de acompanhamento foram obtidos por telefone, carta, e o banco de dados clínico ambulatorial. O estudo incluiu 339 homens e 162 mulheres com idades entre 22 e 82 anos, com idade média de 57 anos. O estadiamento foi realizado de acordo com o estadiamento classificação UICC TNM para o carcinoma do estômago (Sétima Edição, 2010). A follow-up de todos os pacientes foi realizada de acordo com nosso protocolo padrão (a cada três meses para, pelo menos, 2 anos, a cada seis meses para os próximos 3 anos, e depois de 5 anos a cada 12 meses para a vida). Os itens de check-up incluiu exame físico, exame tumor-marcador, ultra-sonografia, radiografia de tórax, tomografia computadorizada e exame endoscópico. O tempo médio de acompanhamento foi de 44,6 meses no momento da análise. O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes, e este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Shanghai Cancer Center da Universidade de Fudan. O estudo foi retrospectivo.

imuno coloração

p53, Bcl-2, bax, e c-myc foram detectados pelo método de imuno-histoquímica. Todos os anticorpos primários e anticorpos monoclonais de ratinho foram adquiridos da Dako (Hamburgo. Alemanha). coloração imuno-histoquímica foi realizada por meio do sistema de polímero melhorar marcado método (ELPS), com 10%, de materiais embebidos em parafina e fixados em formalina. Série 5 mm de parafina foram deparaffinised com xileno e hidratados com ehanol /água deionizada. As secções foram então incubadas com metanol /0,3% de H

2O

2 durante 10 min e bloqueadas com coloração não específica reagente de bloqueio. Após incubação durante a noite a 4 ° C com anti-p53, Bcl-2, Bax, e o anticorpo de c-myc (diluído 1:100, 1:100, 1:100, 1:100, respectivamente), as secções foram tratadas de acordo com a norma imunoperoxidase métodos utilizando um kit de biotina estreptavidina peroxidase complexo (LSAB + kit /HRP; Dako). A reacção de peroxidase foi em seguida desenvolvida com diaminobenzidina (Dako). secções de controlo negativo foram submetidos ao mesmo procedimento, excepto que o primeiro anticorpo foi substituído por PBS. Nenhuma coloração positiva foi observada nos controlos. A posição de coloração era predominantemente no citoplasma da célula por bax e c-myc, citoplasma e cytomembrane para Bcl-2, o núcleo para a p53.

coloração imuno-histoquímica de pontuação

Todos os cortes foram avaliados por dois patologistas sem conhecimento do resultado clínico. A percentagem de células e as intensidades de coloração imuno-reactivo foram avaliados em cada amostra. A percentagem de células imunorreactivas foi graduada numa escala de 0 a 4: sem coloração é pontuada como 0, 1-10% de células coradas pontuado como 1, 11-50%, como 2, 51-80%, como 3, e 81- 100% como 4. As intensidades de coloração foi classificada de 0 a 3: 0 é definido como negativo, como um fraco, moderado como 2, 3 e tão forte, respectivamente. Os dados brutos foram convertidos para o marcador imuno-histoquímico (IHS), multiplicando as pontuações quantidade e intensidade. Uma pontuação IHS de 9-12 foi considerado como forte imunorreatividade (+++), 5-8 como moderada (++), 1-4 como fraco (+), e 0 como negativo (-). Em última análise, os casos tiveram uma pontuação inferior a 1 foram considerados como negativos, e ≥1 foi considerado como positivo.

A análise estatística

A associação entre fatores clínico-patológicos e de marcadores biológicos foi avaliada pelo teste do qui-quadrado. taxa de sobrevivência de cinco anos foi calculada pelo método de Kaplan-Meier, e as diferenças entre as curvas de sobrevida foram examinados com o teste de log-rank. Todas as variáveis ​​significativas observadas na análise univariada foram incluídos na análise de sobrevida multivariada Cox modelo de riscos proporcionais. O nível aceito de significância foi de

P Art 0,05. análises e gráficos estatísticos foram realizados com o pacote estatístico SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL).

Resultados

características clínicopatológicos

Foram 339 machos e 162 do sexo feminino (2,09: 1), com uma idade média de 57 anos. Houve 57 (11,4%) cancros gástricos precoces e 444 (88,6%) cancros gástricos avançados. De acordo com o tipo histológico, foram observados tumores bem diferenciados em 9 (1,8%) pacientes, moderadamente diferenciado em 164 (32,7%) pacientes e tumores pouco diferenciados em permanecer 328 (65,5%) pacientes. De acordo com o tipo de Borrmann, 57 (10,4%) eram do tipo 0, 36 (7,2%) tipo I, 15 (3,0%) do tipo II, 371 (74,0%) do tipo III, 22 (4,4%) do tipo IV. Dos 501 pacientes, 159 (31,7%) tinham tumores localizados no terço superior, 72 (14,4%) tinham tumores no terço médio, 244 (48,7%) tinham tumores no terço inferior do estômago, e 26 (5,2%) tumores ocuparam dois terços ou mais do estômago. Metástase linfática foi observada em 356 pacientes, a taxa de metástases foi de 71,1%. A distribuição de estágio patológico foi a seguinte: 35 (7,0%) pacientes pertenciam ao estágio IA, 52 (10,4%) IB, 60 (12,0%) IIA, 83 (16,5%) IIB, 88 (17,6%) IIIA, 83 ( 16,5%) IIIB, e 100 (20,0%) IIIC.

expressão da p53

expressão da p53 foi positiva em 64,9% de todos os tecidos com câncer gástrico. p53 foi observada no núcleo de células de carcinoma (Figura 1). a expressão de p53 foi associada com Bax e c-myc (Tabela 1). histologia correlacionada com a expressão de p53 bem diferenciado. Não houve correlação com o sexo, idade, tipo de Borrmann, localização do tumor, metástases linfonodais e estágio patológico (Tabela 2).

A) A expressão positiva da p53. B) A expressão positiva de bcl-2. C) A expressão positiva de Bax. D) A expressão positiva do c-myc. (Ampliação original: todos × 100).

Bcl-2 expressão

expressão de Bcl-2 foi positiva em 22,2% de todos os tecidos com câncer gástrico. Bcl-2 coloração foi observada no citoplasma e cytomembrane de células de carcinoma (Figura 1). Bcl-2 foi associada com Bax (Tabela 1). Houve correlação com o estágio patológico, mas nenhuma correlação com o sexo, idade, tipo histológico, tipo de Borrmann, localização do tumor, metástases em linfonodos, e (Tabela 2).

expressão Bax

expressão Bax foi positivo em 42,9% de todos os tecidos de cancro gástrico. Bax coloração foi observada no citoplasma das células de carcinoma (Figura 1). expressão do Bax foi associado com p53, Bcl-2 e c-myc (Tabela 1). sexo feminino, moderadamente diferenciadas, Borrmann II, terceiro local superior e metástases em linfonodos correlacionada com a expressão Bax. À medida que a fase de aumento patológico, a expressão do Bax se tornaram mais frequentes. Não houve correlação com a idade (Tabela 2).

expressão de c-myc

c-myc foi positiva em 58,1% de todos os tecidos com câncer gástrico. coloração de c-myc foi observada no citoplasma das células de carcinoma (Figura 1). a expressão de c-myc foi associada com a p53 e Bax (Tabela 1). Borrmann III correlacionada com a expressão de c-myc. Não houve correlação com o sexo, idade, tipo histológico, localização do tumor, metástases linfonodais e estágio patológico (Tabela 2). Além disso, os dados brutos sobre as características clínicas e avaliações imunorreatividade para 501 casos de câncer gástrico foi mostrado como um quadro suplementar em formato Excel (Tabela S1).

A análise univariada

O excesso de todos os cinco taxa de sobrevivência year foi de 53,7% para todos os 501 pacientes. taxa de sobrevivência de cinco anos foi de 64,9% e 50,5% em 2 Bcl-pacientes Bcl-2 positivos e negativos, respectivamente, e esta diferença foi estatisticamente significativa (Fig. 2). Exceto para Bcl-2 expressão, os fatores prognósticos significativos incluídos: local do tumor, tipo de Borrmann, estado dos gânglios linfáticos, e estágio patológico. Tabela 3 mostrou resultados na análise univariada para fatores prognósticos.

Houve diferenças significativas entre bcl-2 + e Bcl-2 (

P

= 0,005).

análise multivariada

a análise multivariada, incluindo todos os fatores prognósticos significativos mencionados na análise univariada, foi realizada para determinar os fatores prognósticos independentes para câncer gástrico. A análise multivariada Cox modelo de riscos proporcionais mostrou que Bcl-2 expressão e estágio patológico foram fatores prognósticos independentes (Tabela 4).

Comparação de sobrevivência de acordo com marcadores biológicos no mesmo palco

de acordo com a 7ª Staging System UICC TNM, câncer gástrico foi dividido em 7 etapas: estágio IA, IB estágio, IIA palco, IIB, IIIA, IIIB, IIIC. Baseando-se na expressão de Bcl-2, cada fase foi dividida em grupo negativo Bcl-2 e Bcl-positiva 2. Houve diferenças significativas de sobrevivência sobre-tudo de 5 anos entre o grupo negativo Bcl-2 positivo e Bcl-2 de acordo com a fase IIB (

P

= 0,003). Além disso, descobrimos que havia diferenças significativas de sobre-tudo sobrevida de 5 anos entre bcl-2 grupo negativo positivo e Bcl-2 de acordo com Borrmann III (

P

= 0,002); Nenhuma diferença significativa de acordo com a fase II e fase III (Figura 3).

A) Houve diferença significativa entre bcl-2 + e grupo Bcl-2 de acordo com Borrmann III (

P

= 0,002). B) Não houve diferenças significativas de acordo com a fase II. C) Não houve diferenças significativas de acordo com a fase III.

Discussão

A identificação de fatores prognósticos em câncer gástrico foi essencial para prever a sobrevida dos pacientes e determinar estratégias terapêuticas ideais. Muitos estudos têm indicado que a profundidade de invasão e metástase ganglionar foram os fatores prognósticos mais importantes no câncer gástrico [17], [18]. Como resultado da variabilidade de prognóstico dentro mesma fase patológica de cancro gástrico, tem havido uma série de pesquisas de marcadores biológicos específicos para identificar pacientes com prognóstico pobre [19] – [21]. Enquanto isso, a expressão de p53, Bcl-2, Bax, e c-myc foram conhecida por estar relacionada com tumorig�ese. Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar se esses marcadores biológicos podem ser usados ​​como fatores prognósticos adicionais para estágio tradicional TNM no câncer gástrico. Neste estudo, a expressão destas proteínas foi investigada em 501 casos de cânceres gástricos humanos primários ressecados.

As taxas de expressão imuno-histoquímica de p53, Bcl-2, Bax, e c-myc foram 64,9%, 22,2% , 42,9%, 58,1%, respectivamente, e estes resultados foram consistentes com as taxas de expressão de outros estudos relatados como 17-84,1%, 12,7-67%, 42,4-58,0%, 23,5-72,9%, respectivamente, [9], [12 ], [22] – [26]. p53 desempenhou um papel importante na apoptose. É alterado com mais freqüência no câncer humano. proteína p53 de tipo selvagem induziu a paragem do crescimento na fase G1 /S de ciclo celular em resposta a danos no ADN, impedindo assim a proliferação de células. -Tipo silenciado p53 perdeu a função, e permitiu células com o ADN danificado para proliferar. Neste estudo, uma correlação inversa entre p53 e tipo histológico foi encontrado, o que demonstrou que a desregulamentação de p53 pode resultar na proliferação descontrolada no câncer gástrico. Foi consistente com um estudo anterior [22]. Foi controvérsia quanto ao valor prognóstico da p53, alguns estudos têm relatado que a p53 foi associada com mau prognóstico [27], [28], enquanto outros relataram que p53 não tem nenhuma influência sobre o prognóstico [29], [30]. Nossa pesquisa mostrou que p53 não estava relacionado com o prognóstico do câncer gástrico. bax agiu como um acelerador da apoptose na vida da célula. Um estudo anterior sugeriu que a proporção de Bax para Bcl-2 desempenhou um papel crítico na regulação da propensão para a apoptose [31]. No presente estudo, a expressão do Bax foi associada com a de Bcl-2 e Bax superexpressão significativamente correlacionada com algumas características clínico-patológicas, tais como sexo, tipo histológico, tipo de Borrmann, localização do tumor, e metástases em linfonodos. Descobrimos que os pacientes com expressão positiva da bax eram propensos a apresentar metástase ganglionar, e Bax não foi um fator prognóstico independente. Este resultado era diferente de uma pesquisa anterior. Anagnostopoulos et ai. [24] relataram que a expressão Bax negativa na gástrica foi associado a metástases em linfonodos e pior prognóstico clínico. As razões para os resultados conflitantes não eram claros. Era possível que as diferenças genéticas entre povos ocidentais e orientais pessoas contribuíram para isso. O proto-oncogene c-myc foi o principal regulador da proliferação e transformação celular através de meios de transcrição e nontranscriptional, e era frequentemente desregulado em malignidades humanas. Ninomiya et ai. [26] relatou que o excesso de reatividade ao produto c-myc ocorreram com maior frequência em cancros invasivos do que em cancros localizados, e expressão da produção c-myc em tecido de cancro bem correlacionada com a disseminação peritoneal, e os pacientes com expressão positiva c-myc teve pior prognóstico do que aqueles com expressão negativa de c-myc. No presente estudo, não encontrou qualquer relação entre a expressão de c-myc e comportamento invasivo e prognóstico diferente do tipo de Borrmann. Descobrimos que a expressão de c-myc foi mais associado com Borrmann III.

O gene Bcl-2 foi primeiramente descrita como um oncogene em linfoma folicular. Foi bem conhecido para inibir a apoptose [32], mas alguns estudos relataram que a sobre-expressão de Bcl-2 suprimiu a proliferação celular e foi associada com um comportamento menos agressivo biológica [33], [34]. Bcl-2 tem sido relatada numa variedade de tumores malignos epiteliais humanos, incluindo carcinoma gástrico. No entanto, o papel exacto e o significado clínico da Bcl-2 manteve-se a ser elucidados. Estudos anteriores demonstraram que a expressão de Bcl-2 foi associada a um melhor prognóstico no cancro do pulmão de células não pequenas e o cancro gástrico [35], [36]. Pietenpol et ai. [37] relataram que a sobre-expressão de Bcl-2 inibiu o crescimento de várias linhas celulares de tumores sólidos. Saegusa et al. [33] demonstraram que a maioria dos 2 Bcl-+ células cancerosas estava em um estado não proliferativa, ea expressão média de Ki-67 índice de marcação e índice de marcação apoptótica em Bcl-2 focos + foram significativamente menores do que no Bcl-2 focos. Aizawa et ai. [36] demonstraram que a expressão de Bcl-2 no cancro gástrico avançado foi associada com um menor índice apoptótico e um prognóstico melhor. Todos estes estudos sugeriram que a actividade proliferativa celular Bcl-2 não só inibiu a apoptose, mas também suprimiu. No presente estudo, foi caracterizado pela primeira vez a expressão de Bcl-2-proteínas em pacientes com câncer gástrico chineses. Nossos dados mostraram que Bcl-2 foi significativamente correlacionada com melhor sobrevida.

A identificação de fatores prognósticos em câncer gástrico foi essencial para prever a sobrevida dos pacientes e determinar estratégias terapêuticas ideais. Sabia-se que a profundidade de invasão e a presença ou ausência de linfonodo metástases eram os factores de prognóstico mais importantes no cancro gástrico. No entanto, não foi possível prever com precisão o prognóstico através dos procedimentos de preparação convencionais, como resultado da variabilidade de prognóstico dentro da mesma fase do cancro gástrico. Liu et al. [5] descobriu que havia diferenças significativas entre o grupo de tumor de tamanho maior e o grupo de tumor de tamanho pequeno de acordo com a fase III-B e IV. Portanto, era essencial para procurar os outros fatores específicos para identificar subgrupos de pacientes com curso mais agressivo da doença, especialmente na 7ª as edições do sistema Staging UICC TNM. De acordo com a 7ª classificação UICC TNM, cada estágio do câncer gástrico foi dividido em grupo negativo Bcl-2 positivo e Bcl-2. Os nossos dados mostraram que a expressão de Bcl-2 grandemente influenciado prognóstico no estádio IIB. Os resultados indicaram que a expressão de Bcl-2 poderia fornecer informação prognóstica adicional nos pacientes com câncer gástrico.

Algumas limitações deste estudo devem ser reconhecidas. Em primeiro lugar, não foi descrito o estado do Helicobacter pylori. Como um carcinogéneo crucial do cancro gástrico, Helicobacter pylori pode ser ligado a alguns outros parâmetros, tais como Bcl-2. Em segundo lugar, a relação entre a recorrência do tumor e Bcl-2 não foi investigada.

Em conclusão, a expressão de Bcl-2 pode servir como um indicador útil para prever o prognóstico dos doentes com cancro gástrico. Portanto, pode ser um candidato para o sistema de estadiamento além de fatores convencionais.

Informações de Apoio

Tabela S1. dados

crus em características clínicas e avaliações imunorreatividade para 501 casos de câncer gástrico

doi: 10.1371. /journal.pone.0029670.s001

(XLS)