Abstract

Fundo

gene- dirigido terapia pró-fármaco enzima (GDEPT) é um protocolo de tratamento em duas fases para tumores sólidos que envolve a transferência de um gene que codifica uma enzima activadora de pró-fármaco seguido da administração do pró-fármaco inactivo que é subsequentemente activado pela enzima para a sua forma tóxica do tumor. No entanto, o estabelecimento de tais regimes romance de tratamento para combater o câncer de pâncreas requer definidos e robustos sistemas de modelo animal.

Métodos

Aqui, nós abrangente comparação seis linhas celulares de cancro pancreático humano (PACA-44, PANC-1, Mia PaCa-2, HS-766T, Capan-2, e BxPC-3) em modelos subcutâneos e orthotopical de ratinho, bem como na sua susceptibilidade a diferentes GDEPTs.

resultados

captação tumoral foi de 83% a 100% no modelo subcutâneo e 60% a 100% no modelo de rato orthotopical, excepto para as células Hs-766T, que não crescem ortotopicamente. fisiopatológicos análises dos modelos orthotopical revelaram um crescimento infiltrante de quase todos os tumores para o pâncreas; No entanto, as diferentes linhas de células deu origem a tumores com diferentes características morfológicas. Todos os tumores resultantes foram positivas para MUC-1 coloração indicando a sua origem a partir do epitélio glandular ou ductal, mas revelou coloração pan-citoqueratina dispersa. Transferência do gene suicida citocromo P450 e desaminase de citosina, respectivamente, nas linhas celulares de cancro pancreático utilizando tecnologia de vector retroviral revelou infectibility elevado nível de estas linhas celulares e permitiu a análise da sensibilidade destas células aos fármacos quimioterapêuticos ifosfamida e 5-fluorocitosina , respectivamente.

Conclusão

Estes dados qualificar as linhas celulares como parte de valiosos

in vitro

In vivo

modelos e para o uso em pré-clínico definido estudos para a terapia de tumores do pâncreas

Citation:. Hlavaty J, Petznek H, Holzmüller H, Url A, Jandl G, Berger A, et al. (2012) Avaliação de um Gene-Directed Therapy Enzyme-produto (GDEPT) em células de tumor pancreático humano e sua utilização como modelos in vivo para o cancro do pâncreas. PLoS ONE 7 (7): e40611. doi: 10.1371 /journal.pone.0040611

editor: Hiroyasu Nakano, da Escola de Medicina da Universidade de Juntendo, Japão

Recebido: 07 de março de 2012; Aceito: 11 de junho de 2012; Publicação: 16 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Hlavaty et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado em parte pelo programa Fundo de Promoção industrial Research austríaco, bem como pela Doppler Laboratório Christian para gene terapêutico Vector Desenvolvimento. Os financiadores não tiveram nenhum papel no no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os co-autores BS e WHG declarar filiação à empresa Austrianova Singapore PTE LTD. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas sobre a partilha de dados e materiais. Não há outras declarações relevantes em matéria de emprego, consultoria, patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados etc. existe. Autores JH, HP, HH, AU, GJ, AB, MR declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

Apesar de extensos esforços científicos e acumular conhecimento sobre a biologia do câncer de pâncreas, as taxas de mortalidade de desta doença fatal, na maior parte não foram significativamente reduzido durante os últimos 30 anos. Além disso, a incidência mundial de esta doença está a aumentar [1], [2]. Quando viável, o actual nível de cuidados envolve a ressecção cirúrgica com ou sem quimioterapia pós-operatória ou quimioterapia /radioterapia (para revisão ver [3]). Até recentemente, o agente quimioterapêutico mais comum utilizado para o tratamento do cancro do pâncreas é 5-fluorouracilo (5-FU), administrado isoladamente ou em combinação com outras drogas e /ou radioterapia quimioterapêuticos [4], [5], [6]. No entanto, outro análogo de nucleótido, a gemcitabina (Gemzar), introduzidos mercado em 1997 principalmente pelos seus efeitos paliativos, em vez de para melhorar a sobrevivência, tornou-se rapidamente o tratamento quimioterapêutico de escolha para o cancro pancreático, devido ao seu potencial terapêutico sozinho ou em combinação [7] [8], [9].

No entanto, novas opções de tratamento são urgentemente necessárias, e durante as últimas décadas, um número de investigadores começaram a avaliar estratégias novas e não convencionais para o tratamento de câncer de pâncreas. Isto inclui novas estratégias imunológicos que empregam anticorpos monoclonais e vacinas terapêuticas, bem como abordagens baseadas em genes tais como os ácidos nucleicos anti-sentido, a expressão de mutantes de oncogenes dominantes-negativas, a expressão de genes supressores de tumor ou terapia de enzima prfmaco dirigida ao gene da (GDEPT; para avaliação veja [10], [11]). No GDEPT, também conhecida como terapia de gene suicida, um gene específico, heteróloga é introduzida nas células de tumor [12]. Quando expressa, o respectivo produto de gene é capaz de localmente converter um pró-f ármaco não tóxico sistemicamente administrados na sua forma de células-tóxico activo, exercer o efeito terapêutico nas células tumorais, bem como em células circundantes devido a um efeito espectador chamado mediada por difusão dos metabolitos tóxicos.

o vírus herpes simplex timidina cinase (tk do HSV), citosina-desaminase (CD) e citocromo P450 (CYP) são genes suicidas que anteriormente demonstraram ser eficazes em diferentes sistemas de modelo de tumor ( revisto em [13]). Os vectores virais baseados em retrovírus, como o vírus da leucemia murina (MLV), ganharam popularidade significativa para a expressão do gene eficiente e estável destes genes suicidas em células tumorais, os vectores retrovirais, portanto, vários estudos utilizados para a entrega de genes terapêuticos em células tumorais pancreáticas (para revisão ver [14]).

Como um primeiro passo para avaliar novas ideias e conceitos de tratamento, experimentos envolvendo linhas celulares de tumores pancreáticos humanos disponíveis são muitas vezes executadas. Apesar da importância do

in vitro

experimentos, a interpretação dos resultados e as conclusões devem ser avaliados de forma crítica, uma vez que os modelos utilizados muitas vezes representam um sistema artificial que não pode refletir com precisão o

in vivo

situação. A ausência de modelos de rato recapitulando elementos críticos da doença tem dificultado estudos não clínicos [15], incluindo aqueles de abordagens GDEPT. Portanto, ainda mais avaliação não clínica das novas modalidades de tratamento requer a presença de um modelo animal apropriado de cancro pancreático humano. Anteriormente, o desenvolvimento de in vivo em modelos de tumor pancreático foi descrito por Mohammad e colegas, que gerado um modelo de murganho de xenoenxerto (por implantação de material tumoral humana primária) e em modelos animais, utilizando células primárias paciente, bem como linhas de células [16], [ ,,,0],17], [18]. Recentemente, vários modelos de cancro do pâncreas com base em animais geneticamente modificados foram estabelecidas (para revisão ver [19]).

No presente estudo, o objetivo foi analisar e comparar seis linhas celulares de tumores pancreáticos humanos diferentes no subcutâneo e ortotópicos modelos de tumor de rato, bem como para avaliar a adequação destes modelos para estudos não clínicos de GDEPT. Os tumores subcutâneos foram formados em ratinhos SCID /beige, utilizando cada uma das linhas celulares. No modelo ortotópico, cinco das seis linhas celulares deu origem a tumores e a maioria destes infiltrados no pâncreas com a excepção da linha de células Capan-2. Além disso, temos sido capazes de mostrar que a expressão mediada por retrovírus de genes suicidas que codificam citosina-desaminase ou citocromo P450 2B1 confere a sensibilidade das células transduzidas para o respectivo pró-fármaco (5-fluorocitosina, ifosfamida) em concentrações clinicamente relevantes. Os dados aqui apresentados podem ser de importância para outros pesquisadores que diz respeito à escolha de um modelo animal adequado de câncer pancreático humano.

Resultados e Discussão

Neste estudo, comparou-se um painel de linhas de células de carcinoma pancreático humano PANC-1, a paca-44, Capan-2, BxPC-3, MIA PaCa-2 e Hs-766T em termos de adequação para um

in vivo

modelo do rato para câncer de pâncreas. BxPC-3, Panc-1, Capan-2 linhas celulares PaCa-44 e foram derivadas de adenocarcinomas ductais de pâncreas, ao passo que MIA células PaCa-2 originam a partir de carcinomas do corpo pâncreas [20], [21], [22], [23], [24]. A linha de células HS-766T foi derivada da metástase de nódulo linfático carcinoma de pâncreas [25]. Todas as linhas celulares foram

In vitro

crescidas como culturas de monocamada aderentes com epitelial (PANC-1, Mia PaCa-2, HS-766T, BxPC-3) ou rodada para poligonal (Capan-2, PaCa-44) morfologia. Uma vez que as integridades genéticas da p53 marcadores tumorais, K-ras, p16 e Smad4 (também conhecido como DPC) são associados com o grau de tumorigenicidade [26], foram comparadas as linhas celulares utilizadas no que diz respeito ao seu genótipo para estes marcadores (Tabela 1). Nenhuma consistência clara nas alterações genéticas dos genes examinados das respectivas linhas de células é óbvia e os resultados são muitas vezes dependente do tipo de análise aplicada (para revisão ver [27], [28]). Quase todas as linhas celulares tinham mutações na célula ciclo-regulação supressores de tumores p53 e p16. As mutações dentro do carcinoma pancreático associado supressor de tumor Smad4, que está envolvida na transformação do factor de crescimento beta (TGF-p) de sinalização, foi encontrado auditivos apenas nas linhas de células HS-766T e BxPC-3 [27]. De todas as linhas celulares utilizadas neste estudo, apenas BxPC-3 é descrita a ter um intactas oncogene K-ras [27].

subcutânea e formação de tumor Ortotópico

Após a injecção subcutânea das várias linhas de células de cancro do pâncreas, todos os animais apresentaram a formação de tumor (salvo um ratinho no grupo PANC-1). tumores PaCa-44 derivadas mostrou o crescimento mais rápido, mas não homogénea. Sete dias após a injeção de células desses tumores eram mensuráveis ​​com um paquímetro e o primeiro animal teve que ser sacrificado após 18 dias, como o tamanho do tumor tornou-se maior de 1900 mm

3, tendo demonstrado, assim, uma taxa de crescimento de mais de 1600 milímetros

3 dentro de quatro dias (Fig. 1). A segunda taxa de crescimento de tumor mais pronunciada foi observada a partir PANC-1 de tumores, seguindo-se células Capan-2, BxPC-3 e HS-766T, que exibia um crescimento do tumor mais moderada. Semelhante a PaCa-44, MIA PACA-2 tumores eram mensuráveis ​​no prazo de sete dias após a injecção, mas, em contrapartida, eles mantiveram o seu tamanho por 28 dias antes de continuar crescendo (Fig. 1).

5 × 10

6 células de cada linha de células de pâncreas foram injectados subcutaneamente no flanco esquerdo do CB-17 /IcrHsd-

Prkcd

scid Lyst

bg

ratos no dia 0. tumores visíveis foram medidos duas vezes por semana com um compasso de calibre e tamanho foi calculada pela fórmula “comprimento x largura x largura /2”.

Para determinar o comportamento orthotopical dos tumores do pâncreas gerados, pedaços de os tumores foram transplantados subcutaneamente formado em estreita proximidade com o pâncreas do CB-17 /IcrHsd-

Prkcd

SCID lyst

bg

ratos. PaCa-44, PANC-1, BxPC-3 Capan-2 e células cresceram por via intraperitoneal (i.p.) em todos os animais. o crescimento de tumores MIA PaCa-2 foi encontrado i.p. em três dos cinco animais (Tabela 2). Embora peças tumorais HS-766T foram implantadas ip repetidamente, não se observou a formação de tumor (Tabela 2), apesar de re-análise dos pedaços implantados confirmou a viabilidade das células do tumor (dados não apresentados).

Nos dois terceiro de PACA-44, PANC-1, MIA PaCa-2 e BxPC-3 tumores infiltraram no pâncreas. No entanto, os tumores residuais tinham uma conexão com a parede abdominal, em vez de para o pâncreas (Tabela 2). A partir dos Capan-2 tumores, apenas um infiltrado no pâncreas, ao passo que os outros foram ligados ao baço ou a parede abdominal sem mostrar penetração (Tabela 2). Em contraste com o outro tipo de célula, tumores derivados Hs-766T não foram anexados a qualquer órgão em tudo e foram encontrados localizado frouxamente no abdômen.

Tumor Patologia

Os tumores de todos os ortotopicamente linhas de células em crescimento, bem como a linha de células crescendo subcutaneamente-Hs 766T foram analisados ​​histologicamente. Análise de quase todos os modelos de tumores ortotópicos revelado invasão focal do pâncreas autochtonic por um carcinoma anaplásico sólida excepto o modelo de tumor BxPC-3, que mostrou disseminada diferenciação tubular e Capan-2 células que cresceram como um adenocarcinoma ductal. PANC-1, BxPC-3 e Capan-2 tumores mostrou pouca pleomorfismo celular e nuclear e foram compostos por grandes células com citoplasma abundante pálido e grandes núcleos (PANC-1, Capan-2) ou, pequenas células redondas com núcleos densos ( BxPC-3). Paca-44 e MIA PaCa-2 tumores, em contraste, teve pleomorphisms celulares e nucleares proeminentes. MIA PaCa-2 tumores consistia principalmente de pequeno e redondo de células fusiformes com núcleos densos, além de grandes células revelando zonas citoplasmáticos hiper-eosinofílica típicos para células acinares, enquanto PaCa-44 tumores revelou células grandes e ricas em citoplasma com grandes núcleos. Além Capan-2 e BxPC-3 células tumorais que tinham apenas uma moderada taxa de mitose, células de todos os outros tumores mostrou altamente aumento da atividade mitótica indicando a alta malignidade destes tumores. Além disso, em PANC-1, Mia PaCa-2 e tumores BxPC3 grandes áreas submetidas a necrose pode ser observado – uma outra característica de tumores altamente malignas. Tomados em conjunto, quase todos os tumores revelou um elevado grau de desdiferenciação, com apenas Capan-2 tumores, bem como em algumas áreas do BxPC-3 tumores residuais características típicas da origem glandular dos tumores são detectáveis.

Apenas pouco linfocítica e infiltração neutrofílica do tecido tumoral adjacente, tal como adiposo e tecido fibroso e o pâncreas autochtonic, foi detectado no PANC-1, PaCa-44, BxPC-3, MIA PaCa-2, e Capan-2 modelos com infiltração linfocítica adicional no próprio tecido tumoral PaCa-44 (Fig. 2A). Além disso, foi observada difusa invasão neutrofílica moderado de todo o MIA PaCa-2 tumores derivados com áreas focais de colliquation (Fig. 2A). Como o implante orthotopical de peças tumorais HS-766T não resultou no crescimento do tumor, o modelo subcutâneo análogo foi histologicamente analisadas revelando um carcinoma anaplásico sólido com pleomorphisms celulares e nucleares proeminentes, que consiste principalmente de pequenas, redondas de células fusiformes com núcleos densos, uma alta actividade mitótica, e grandes áreas de tecido necrótico tumoral (Fig. 2A). ramos largos de tecido fibroso eram detectáveis ​​na periferia dos tumores, mas também divulgados adjacentes a grupos de células de tumor em BxPC-3, Capan-2 e PaCa-44 tumores; em PaCa-44 tumores foi acompanhada por fibrose infiltrados leucocitários imaturos.

(2A) Secções de tumores pancreáticos derivadas das linhas de células pancreáticas indicados foram coradas com hematoxilina e eosina. O espécime-Hs 766T foi dissecado a partir de um tumor subcutâneo; todas as outras amostras foram tomadas a partir de tumores cultivados ortotopicamente. (2B) diferentes secções de um tumor BxPC-3-derivados foram submetidos a análise imuno-histológica com anticorpos contra A mucina-1 (MUC-1), Pan-citoqueratina (Pan-CK), e actina de músculo liso-α (SMA). A barra preta representa um comprimento de 53 mm, com exceção de-MUC-1 anti coloração (27 mm).

PAS coloração foi realizada para identificar as estruturas de tumor provenientes de condutas e /ou ácinos. Em Capan-2 e BxPC-3 tumores de 40% e 25% das células tumorais foram positivas para PAS, respectivamente. Todos os outros tumores, com exceção de MIA PaCa-2 e PANC-1, que permaneceu completamente negativo, revelou apenas um número marginal de células PAS-Manchado – provavelmente devido ao seu estatuto mais desdiferenciado (dados não mostrados)

.

imuno-histoquímica (IHC) coloração de MUC-1 de proteína, que é expresso pela maioria das células epiteliais glandulares e ductais, conduziu à rotulagem discreta de quase toda a massa tumoral em PACA-44, PANC-1, BxPC-3 (Fig . 2B) e Capan-2 modelos tumorais ortotópico e de cerca de 75% de PACA-2 tumor MIA. Em comparação com os sinais imunológicas observadas no pâncreas humanos normais, no qual a rotulagem acastanhado foi encontrado no citoplasma das células epiteliais e ácinos ductais, os perfis de expressão são aqueles tumores indicativo para a sua acinar e ductal origem. Embora histomorfologia só raramente se assemelha ao tecido pâncreas autochtonic, de acordo com os perfis de coloração mencionadas acima, os tumores são identificáveis ​​como adenocarcinoma ductal da origem, que é responsável por 85% a 90% de todos os tumores pancreáticos [29], [30]. No entanto, de acordo com a classificação da OMS, que reconhece várias variantes além do adenocarcinoma ductal tubuloglandular clássico [30], quase todos os tumores ortotópicos correspondem a variante do carcinoma anaplásico. Curiosamente, IHC detecção de citoqueratinas (CK) 1-8, 10, 14-16 und 19 utilizando um anticorpo pan-CK resultou na marcação imunológica de todo o tumor estabelecido com PaCa-44, BxPC-3 e células Capan-2, mas em apenas 60% e 40% de células coradas em MIA PaCa-2 e PANC-1 tumores, respectivamente. Como Pan-CK tubular principalmente manchado /estruturas ductal do pâncreas humanos normais, a diminuição da imunomarcação em MIA PaCa-2 e PANC-1 em comparação com os outros tumores podem ser sugestivo de uma origem mais acinar destes tumores, ou, principalmente no caso de MIA PaCa-2, que também expressa MUC-1 em apenas 75% das células tumorais, o padrão de expressão pode ser indicativo de um maior grau de malignidade, o qual é suportado pela aparência histológica deste tumor com grandes áreas de necrose, colliquation neutrofílica e um elevado índice mitótico. Os sinais obtidos através da análise da capacidade de anticorpos pan-CK e MUC-1 de se ligarem a linhas celulares eram não homogéneo e inconsistente, o que complica a interpretação destes dados.

Em resumo, de acordo com o seu aspecto histológico, o padrão PAS-coloração e os perfis de expressão de MUC-1 e Pan-CK, MIA PaCa-2 e PANC-1 linhas de células deu origem aos tumores mais indiferenciadas deste estudo; No entanto, a semelhança inequívoca de pâncreas humano saudável foi dada em nenhum dos tumores, como, com a excepção da pequena zona tubular em Capan-2, mesmo os tumores não-anaplásicas mostrou um padrão de crescimento sólido, não-glandular.

Usando anti-SMA, numerosos citoplasma colorida células estromais ricos profundamente acastanhadas adjacentes às células tumorais foram encontrados ao longo dos tumores de todas as linhas de células; pâncreas normal permaneceu negativa (Fig. 2). fibrose distinta, acompanhada de unidade de atendimento, mais obviamente na BxPC-3, Capan-2 e PaCa-44 tumores. GFAP coloração revelou imunocoloração positiva em apenas MIA PaCa-2 tumores, que representa os processos de células estreladas marcados em torno da ácinos pancreáticos. Assim, como unidades activados são conhecidos por serem as células efectoras principais em fibrose, que é uma característica patológica consistente no cancro pancreático humano [31], [32], [33], e perturbar o estroma tumoral desmoplásica aumenta a distribuição e eficácia de anti -tumor drogas [33]. células BxPC-3, Capan-2 e Paca-4 representam os modelos de tumor mais promissores para os estudos de inibição da fibrogênese em câncer pancreático humano.

Nossos dados indicam que, através do emprego de diferentes linhas de células pancreáticas em um configuração ortotópico, poderia ser estabelecido um amplo espectro de tipos de tumor pancreático heterólogos que serve como modelo para diferentes aplicações terapêuticas na terapia de tumores do pâncreas. Estudos anteriores em ratos SCID revelou que s.c. tumores implantados apenas raramente mostram a metástase [16]. Em nosso estudo, os ratos foram mantidos por até 18 semanas após o início do aparecimento Capan-2 e BxPC-3 tumor, 13 e 10 semanas após MIA PaCa-2 e PANC-1 aparecimento do tumor, respectivamente, e 4 semanas após PaCa-44 tumor e análises brutas de órgãos de rato indicam que nenhuma das células de tumor levou a metástases locais ou distais, quer depois de SC ou transplante ortotópico. Em contraste, Tseng e colegas descobriram recentemente metástases hepáticas em B6 /129 ratos por 6 a 8 semanas após a implantação de linhas de células de metástases do fígado obtidas a partir de K-ras (G12D /+), LSL-Trp53 (R172H /+) e PDX-1 camundongos -Cre [34]. Tal como nos seres humanos, a maioria se não todos os carcinomas do pâncreas mostram metástase local e distai ao longo do tempo, a falta de tendência metastático tem de ser tomada em conta aquando do estabelecimento de um ensaio de eficácia da droga com as linhas de células de tumor.

Além modelos in vivo que transportam xenoenxertos de células humanas, recentemente, modelos de ratos geneticamente modificadas de câncer de pâncreas foram estabelecidas (para revisão ver [19], [35]). Uma vez que estes sistemas modelo são baseados em modificações genéticas individuais, eles são ferramentas valiosas para estudar a influência de tais alterações genéticas ou de vias de sinalização individuais no desenvolvimento do tumor [19]. No entanto, eles são menos adequados para avaliar novos conceitos terapêuticos para o tratamento do câncer pancreático. Em vez disso, sistemas modelo como ortotopicamente crescendo tumores humanos xenotransplantes são muito mais adequado como eles se assemelham, devido à origem de tumores pancreáticos humanos, a situação atual e a heterogeneidade da doença humana.

Sensibilidade citosina desaminase mediada por humanos linhas célula pancreática Rumo

5-fluorocitosina

estudar comparativamente o potencial de matar do sistema /5-FC citosina deaminase em nossos modelos de câncer de pâncreas, cada uma das seis linhas de células tumorais foi estavelmente infectadas

in vitro

com o vector de retrovírus PCCDWmCMVpuro, que alberga o gene de levedura de citosina-desaminase (CD) sob o controlo transcricional do promotor de citomegalovírus murino ubíqua (CMV) [36]. O CD levedura permite a conversão do não-tóxico prfmaco 5-fluorocitosina (5-FC) para o altamente tóxico agente quimioterapêutico 5-fluorouracilo (5-FU) e, assim, após a integração nas células de cancro do pâncreas, a sua expressão deve permitir tumoral preferencial a depleção de células após a administração de 5-FC.

Para confirmar a transcrição CD após transdução retroviral, RT-PCR foi realizada a partir de lisados ​​de células transduzidas, assim como a partir de células não transduzidas. O fragmento do gene CD ~480 pb foi claramente detectado em células transduzidas com o vector PCCDWmCMVpuro (Fig. 3), mas estava ausente em células não infectadas. Estes dados indicam integração vector de expressão adequado e comparável do CD de transgene em todas as linhas celulares (Fig. 3).

O ARN celular total foi isolado a partir de linhas celulares indicadas e mRNA foi transcrito de forma inversa utilizando iniciadores oligo (dT). CD, assim como fragmentos de genes específicos de GAPH foram amplificados utilizando iniciadores específicos e separados num gel de agarose que mostra os tamanhos esperados de ~480 pb para CD e ~350 pb para GAPDH. A quantidade de ADNc utilizadas para amplificação por PCR foi ajustado para originar níveis comparáveis ​​de o fragmento do gene de GAPDH.

Para avaliar esta estratégia de GDEPT para o tratamento de células de cancro do pâncreas e

In vitro

, determinamos LD

50 após a administração do pró-fármaco 5-FC a linhas celulares de tumor pancreático humano previamente transduzidas com PCCDWmCMVpuro. Em comparação com as células não transduzidas, que não respondiam a 5-FC ( 1000 ng /mL), o LD

50 foi reduzida em 16 vezes, em média, em todas as linhas de células (Tabela 3). Este aumento da sensibilidade eminente 5-FC, indica que a expressão de CD estabelecida com sucesso a conversão do pró-fármaco 5-FC a 5-FU tóxico em todas as linhas de células de tumor de pâncreas transduzidas. Curiosamente, o CD linha celular que expressa BxPC-3 foi de até 30 vezes mais sensíveis ao 5-FC comparativamente com as células Hs-766T transduzidas. Para analisar se esta diferença de sensibilidade é independente da expressão de CD, ambas as linhas de células pancreáticas não tratadas e transduzidas foram directamente incubadas com tóxicos de 5-FU. Como esperado, a susceptibilidade de todas as linhas de células a 5-FU foi independente de transdução com o vector de PCCDWmCMVpuro. No entanto, de acordo com a 5-FC resultados do tratamento, as células BxPC-3 foram cerca de 30 vezes mais sensíveis ao 5-FU do que as células Hs-766T (Tabela 3), sugerindo que as linhas de células pancreáticas testados têm uma susceptibilidade diferencial ao tóxico droga

per se

. De acordo com estudos clínicos que empregam 5-FC, as concentrações de plasma em pacientes estão a atingir níveis de 50-125 ug /ml 5-FC, após a administração oral de 150 mg de 5-FC por kg de peso do corpo [37], [38], [39] . No entanto, as concentrações no plasma acima de 100 ng /ml são muitas vezes considerados como tóxicos para o paciente [39]. A este respeito, o tratamento com PCCDWmCMVpuro vector permitiu quatro de seis linhas celulares testadas para responder a 5-FC concentrações abaixo de 100 ug /mL, sugerindo que GDEPT pode permitir um tratamento de tumor eficaz em doses de pró-fármaco abaixo dos níveis de toxicidade não específica.

Killing mediado pelo citocromo P450 de pancreático humano Lines tumor de células

o uso da ifosfamida agente quimioterapêutico para o tratamento de câncer de pâncreas tem sido descrita em vários estudos [40], [ ,,,0],41], [42], [43], [44]. A ifosfamida pró-fármaco é convertido em fosforamida de mostarda pelo citocromo P450. mostarda fosforamida torna DNA de células que se dividem disfuncionais através de alquilação, a qual é a base para a sua selectividade para as células em divisão tal como incluído no tumores de crescimento rápido. Infelizmente, como o citocromo P450 é produzida predominantemente no fígado, a toxicidade da ifosfamida metabolito é bastante sistémica e não específico para o tumor. Para aumentar a toxicidade específica do tumor no nosso modelo de tumor de pâncreas comparativa, utilizou-se o vector retroviral PCCWmCMV albergando o gene P450 2B1 (CYP2B1) citocromo rato para a transdução estável das linhas de células pancreáticas.

Para monitorar a expressão de CYP2B1 depois transdução, análises de Western blot foram realizadas com os lisados ​​de proteína das células transduzidas e não transduzidas. expressão CYP2B1 foi apenas detectada em células previamente transduzidas com o vector retroviral (Fig. 4). A linha celular BxPC-3 apenas revelaram níveis de expressão menores de CYP2B1. Para avaliar a sensibilidade das linhas celulares de tumor pancreático que expressam CYP2B1 BxPC-3, MIA PACA-2, HS-766T, PACA-44 e PANC-1 em direcção a ifosfamida, o LD

50 foi determinada em comparação com células não transduzidas. A toxicidade não específica da ifosfamida pró-fármaco em linhas de células não transduzidas variou significativamente e estava na gama de 0,18 (células Hs-766T) mm até mM (células PANC-1) LD 2

50 valores (Tabela 4). Expressão do transgene CYP2B1 levou a um máximo de 13 vezes maior susceptibilidade a ifosfamida em quatro das cinco linhas de células testadas (Tabela. 4). Apenas as células Hs-766T, que eram mais sensíveis à ifosfamida

per se

, não mostrou maior susceptibilidade a ifosfamida, apesar da expressão do gene CYP2B1.

Total de lisados ​​celulares de 8 × 10

5 células foram separados num gel de poliacrilamida a 10% sob condições desnaturantes. Após a secagem, a proteína CYP2B1 foi detectado com um anticorpo específico para o CYP.

Os estudos sobre a viabilidade de in vivo GDEPT para câncer de pâncreas já foram realizados anteriormente [44], [45], [46], [47], [48]. Mostrámos que as células encapsuladas geneticamente modificados para expressar o gene do citocromo P450 suicídio implantado em ratinhos na vizinhança de tumores derivados de PaCa 44 células são capazes de causar a redução do tumor, quando o pró-fármaco apropriado que é activado pelo citocrómio P450 é dado [45] , [46]. Além disso, temos utilizado estas células encapsuladas em um ensaio clínico em pacientes com câncer de pâncreas e foram capazes de mostrar que a sobrevivência mediana de este grupo de doentes foi duplicada [44], [47].

Em conjunto, estes dados sugerem que tais abordagens GDEPT para o tratamento de cancro pancreático são promissores. No entanto, estas novas terapias precisa ser testada em mais do que um sistema de modelo animal relevante assemelhando-se a característica dos respectivos tumores, tanto quanto possível. Isto indica claramente uma necessidade urgente para melhor caracterização de modelos animais de escolha, como temos demonstrado neste estudo.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os animais foram manipulados em estrita conformidade com as boas práticas animal. animal de trabalho foi aprovado pelo Comité Consultivo para a Experimentação Animal do Ministério Federal de Educação, Ciência e Cultura de acordo com a lei federal austríaca de Experimentação Animal (BGBl No. 501/1988, BGBl I No. 169/1999 e BGBl I n . 136/2001) e uma licença para a experimentação animal foi emitido especificamente para este estudo (GZ 68,205 /177-BRGT /2003). Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal. As cirurgias foram realizadas sob anestesia geral. Os animais foram mortos antes de o tumor atingiu um tamanho palpável de 1500 mm

3.

Os plasmídeos

A sequência de codificação do gene de citosina-desaminase (CD, GenBank n. U55193, pos. 183-659) a partir de

Saccharomyces cerevisiae foi amplificado por PCR a partir de DNA genómico de levedura (Sigma) e subsequentemente introduzida no vector de clonagem pCR-XL-TOPO (Invitrogen), resultando no plasmídeo PYCD. Em seguida, o cDNA de citosina-desaminase foi libertado a partir do plasmídeo por meio de um PYCD

EcoR I

digestão de restrição e ligou-se com os 7,7 kb

EcoR I-fragmento de plasmídeo que codifica pPCEWmCMVpuro um vector retroviral baseado em MLV [ ,,,0],36]. O plasmídeo resultante foi denominado pPCCDWmCMVpuro. A sequência de codificação do gene do citocromo P450 2B1 de rato (CYP2B1) foi amplificado por PCR a partir do plasmídeo PC3 /2B1 [47], utilizando iniciadores Idade-CYP (5′-GCGTACCGGTCCACCATGGAGCCCAGTATCTTGC-3 ‘) e CYP-Não (5′-AAGCGGCCGCTATCACCGAGCTGAGAAGCAG-3’ ) abrigando

Idade

I e

Não

I específica sítios de restrição, respectivamente, e clonado no grande

Idade

I-

Não

I fragmento do plasmídeo vector retroviral pPCEmCMV [36]. O plasmídeo resultante foi denominado pPCCmCMV. Para gerar o plasmídeo pPCCWmCMV, a marmota vírus da hepatite elemento regulador pós-transcricional (WPRE) foi lançado a partir do plasmídeo pPCEWmCMV por restrição digerir com

Não

I e inserido no

not * I-linearizado vector pPCCmCMV [36 ].

linhas celulares

anfotrópico células de empacotamento retroviral baseado na linha celular de rim embrionário humano HEK293 [49], as linhas celulares de tumor pancreático humano PANC-1 (ATCC CRL-1469), PaCa- 44 [22], MIA PaCa-2 (ATCC CRL-1420), e HS-766T (ATCC HTB-134) foram cultivadas em Dulbeccos modificado meio de Eagles (DMEM /Glutamax; Life Technologies) suplementado com soro de vitelo fetal a 10% (FCS , Life Technologies). linhas celulares de tumor pancreático humano BxPC-3 (ATCC CRL-1687) e Capan-2 (ATCC HTB-80) foram cultivadas em meio RPMI (Life Technologies) suplementado com 10% FCS e glutamina e meio McCoys (Life Technologies) suplementado com 10 % de FCS, respectivamente. células NIH3T3 (ATCC CRL-1658) foram mantidas em DMEM /Glutamax suplementado com 5% de FCS.

produção de vírus e Geração de células infectadas de modo estável

O método de co-precipitação com fosfato de cálcio foi usada para estabelecer células estavelmente produzir vírus [50]. Resumidamente, 7 × 10

5 de células de empacotamento retrovirais baseados HEK293 [49] foram transfectadas em uma placa de 6 poços com 3,0 ug do plasmídeo pPCCDWmCMVpuro e pPCCWmCMV, respectivamente. 24 horas mais tarde, as células foram tripsinizadas e seleccionadas em DMEM contendo quer 0,6 ug /ml de puromicina (Sigma) para células transfectadas pPCCDWmCMVpuro ou 400 ug /mL de geneticina (Gibco) para células transfectadas pPCCWmCMV até que colónias individuais de células foram formados.