Abstract

O cancro do pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. Os progressos recentes no diagnóstico e tratamento do cancro do pulmão foi alcançado devido a uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares da doença e a identificação de biomarcadores que permitem tratamentos de câncer mais específicas. Um dos exemplos melhor conhecidos de terapia personalizada é a utilização de inibidores de quinase tirosina, tais como gefitinib e erlotinib, para o tratamento bem sucedido de pacientes com cancro do pulmão de não-pequenas células seleccionadas com base na específica

EGFR in

mutações. Portanto, a detecção fiável de mutações é crítica para a aplicação da terapia apropriada. Neste estudo, testou-se uma estratégia de detecção de mutação de duas camadas, utilizando ensaios de PCR em tempo real como um método de grande sensibilidade bem validado e MLPA (MLPA) -based ensaio EGFRmut + como uma segunda camada de padrão de sensibilidade Método. Uma vantagem adicional do método MLPA aplicada é que ele permite a detecção simultânea de mutações EGFR e alterações no número de cópias (ou seja, amplificações) em

EGFR, MET

e

ERBB2

. Nossa análise mostrou alta concordância entre estes dois métodos. Com o uso desta estratégia de duas camadas, que determinado de forma confiável a frequência de

EGFR

mutações e

EGFR, MET

e

ERBB2

amplificações em mais de 200 amostras de câncer de pulmão. Além disso, aproveitando número de cópia simultânea e pequena mutação análises, que mostrou uma correlação muito forte entre as mutações EGFR e amplificações de EGFR e uma exclusividade mútua de mutações EGFR /amplificações com MET e amplificações ERBB2. Os resultados comprovaram a confiabilidade e utilidade da estratégia de ensaio EGFR de duas camadas

Citation:. Lewandowska MA, CZUBAK K, Klonowska K, Jozwicki W, Kowalewski J, Kozlowski P (2015) O uso de um período de dois Estratégia camadas de teste para a detecção simultânea de pequeno

EGFR

mutações e

EGFR

Amplification no câncer pulmonar. PLoS ONE 10 (2): e0117983. doi: 10.1371 /journal.pone.0117983

Editor do Academic: Rafael Rosell, Instituto Catalão de Oncologia, ESPANHA

Recebido: 16 de maio de 2014; Aceito: 05 de janeiro de 2015; Publicação: 26 de fevereiro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Lewandowska et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela bolsa de pesquisa 2011/01 /B /NZ5 /02.773 do Centro Nacional de Ciência (https://www.ncn.gov.pl /). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. O tratamento de cancro do pulmão é tradicionalmente com base numa avaliação histopatológica que distingue dois tipos principais de cancro do pulmão: o cancro das células pequenas do pulmão (SCLC) e cancro do pulmão de células não pequenas, (NSCLC), o último dos quais pode ser subdividida em escamosas carcinoma, carcinoma de grandes células, adenocarcinoma e cancros com histologia mista. recentes progressos substanciais no tratamento do cancro do pulmão (especialmente adenocarcinomas) foi conseguida por avanços no conhecimento da sua patologia; as opções de tratamento actuais incluem agentes especializados com base na presença ou ausência de marcadores genéticos específicos ( “terapia personalizada”), tais como mutações no receptor do factor de crescimento epidérmico (

EGFR

) [1] ou ganhar-de- translocações de função ou inversões que envolvem o receptor tirosina-quinase do linfoma anaplástico (

ALK

) [2].

foi demonstrado que certas mutações somáticas dentro do domínio da cinase de

EGFR

sensibilizar cancros ao tratamento com

EGFR

espec�icos inibidores de tirosina-cinase (TKI), tais como gefitinib ou erlotinib (revisto em [3]). Entre o sensibilizante mais comum

EGFR

mutações são L858R no exão 21 e eliminações em-frame no exão 19, que juntos respondem por mais de 80-85% de todos os

EGFR

mutações. No entanto, a ocorrência da mutação secundária T790M no exão 20 faz com a resistência adquirida a inibidores da tirosina quinase e faz com que a progressão de cancros tratados com TKI [4,5]. Portanto, a detecção confiável de

EGFR

mutações é um fator importante que permite o tratamento personalizado de doentes com cancro do pulmão.

Nos últimos 10 anos, têm sido utilizados vários métodos com diferentes sensibilidades e especificidades para detectar

EGFR

mutações em amostras de câncer. Estes métodos incluem seqüenciamento Sanger, polimorfismo único fio conformação (SSCP) [6], co-amplificação com menor desnaturação temperatura-PCR (COLD PCR) [7], imuno-histoquímica com

EGFR anticorpos específicos

-mutation [8] , ácido nucleico de péptido bloqueado-ácido nucleico (PNA-LNA) ensaios de fixação de PCR, PCR em tempo real (RT-PCR) [9] e sequenciação próxima geração [10]. No entanto, nenhum dos métodos que têm sido utilizados até agora são ideais, e cada um destes métodos tem as limitações que na maior parte se relacionam com as seguintes características de amostras de cancro: (i) diversificada tipos de amostras de tumor disponíveis para análise (cirúrgicos, biopsiados), (ii) a contaminação com células normais, (iii) a heterogeneidade genética dos tumores, (v) a frequência de baixa frequência das mutações analisadas, (iv) a degradação de ADN, e (v) dano ou modificação de ADN [os dois últimos fatores também se aplicam a, amostras fixadas em formalina e embebidos em parafina (FFPE), que são as amostras mais frequentemente disponíveis]. Os problemas mais graves resultantes das limitações da análise de amostras de tumor são falsos erros positivos e negativos falsos que podem levar à má classificação e tratamento inadequado de câncer. Portanto, para reduzir a fração de amostras classificadas incorretamente, foi recentemente proposta na diretriz baseada em evidências de três sociedades profissionais (College of American Pathologists, associações internacionais para o estudo do cancro do pulmão, e Association for Molecular Pathology) que, se possível,

EGFR

testes de mutação deve ser realizada com dois métodos (uma estratégia de teste de duas camadas). Esta orientação representa testes de câncer de pulmão state-of-the-art molecular e foi publicado conjuntamente em três revistas [11-13]. Para simplificar, vamos posteriormente se referem apenas à [11]. Este método de dois níveis devem ser baseados em diferentes princípios de detecção de mutação e deve cobrir diferentes gamas de sensibilidade, que consiste em métodos-padrão de sensibilidade e de alta sensibilidade.

Neste estudo, testamos mais de 200 amostras de NSCLC com o utilização de dois métodos complementares, um ensaio de RT-PCR comercial rotineiramente utilizado (um método de alta sensibilidade) [9] e uma nova multiplex de amplificação da sonda dependente de ligação (MLPA) baseados EGFRmut + de ensaio (um padrão da sensibilidade, método segundo nível ) [14]. Nossa análise mostrou uma alta concordância entre estes dois métodos e assim provou a confiabilidade e utilidade da EGFRmut + ensaio como um método de segunda linha para o

EGFR

testes de mutação. Com o uso desses métodos, caracterizamos e estima a frequência de

EGFR

mutações somáticas em um conjunto de amostras de cancro do pulmão do centro de Poland. Uma vantagem adicional do ensaio EGFRmut + é que ele permite que uma mutação e análise de determinação do número de cópias relativa (isto é, a detecção de amplificação) em paralelo. Nós usamos esta abordagem para encontrar uma correlação muito forte entre o

EGFR

amplificação e a ocorrência de

EGFR

mutações e determinar a frequência aproximada de alelos mutantes em nossas amostras analisadas.

Materiais e Métodos

Selecção e tratamento de amostras de NSCLC para análise molecular

Foram analisados ​​retrospectivamente uma coorte de 239 pacientes com diagnóstico histopatológico confirmado NSCLC diagnosticados de 2011 para 2012, no Centro de Oncologia Franciszek Lukaszczyk em Bydgoszcz (região central da Polônia). A idade dos pacientes variou de 35 a 81. Um total de 239 espécimes que passou as etapas de controle de qualidade (análise microscópica e conteúdo de qualificação do tumor, bem como análise de DNA qualitativa e quantitativa) foram obtidos após 143 cirurgias, 91 aspirativa por agulha fina ( FNA) procedimentos e 5 de ultra-som endobrônquica com guiado transbrônquica aspiração de agulha () procedimentos de EBUS-TBNA ou amostragens de líquido pleural. As amostras foram coradas com hematoxilina e eosina para a análise qualitativa e quantitativa das células tumorais no material analisado (incluindo macrodissection em amostras marcados fora). A qualificação de material biológico para análise molecular foi baseado nas escalas qualitativos e quantitativos descritos anteriormente para citológico [9] e histológica [15] do material. consentimento informado por escrito para testes genéticos, aprovado pelo Centro de Oncologia F. Lukaszczyk em Bydgoszcz foi obtido de todos os pacientes eo estudo foi aprovado pelo nosso comitê de ética local, Comissão de Bioética da Ludwig Rydygier Collegium Medicum em Bydgoszcz, Universidade Nicolaus Copernicus, em Torun . Os dados foram analisados ​​de forma anónima.

isolamento de ADN

isolamento de ADN foi realizada após a macrodissection de uma região indicada pela pathomorphologist. O ADN genómico foi isolado a partir de tecido FFPE adenocarcinoma ou esfregaços citológicos utilizando um QIAamp FFPE Mini Kit (QIAGEN) de acordo com as instruções do fabricante, com as seguintes modificações. Nós ressuspensas o sedimento em 180 ul de tampão de lise do tecido com 20 ul de proteinase K, e, em seguida, agitadas continuamente e sacudiu o sedimento de células em intervalos curtos durante uma incubação durante a noite a 56 ° C. A quantidade e qualidade de DNA foram avaliados por análise NanoDrop absorção e eletroforese em gel de agarose.

A análise da mutação por PCR em Tempo Real

O método RT-PCR utiliza sondas específicas de mutação para avaliar 29 mutações pontuais , incluindo a mutação T790M (EGFR-RT52; Entrogen, Inc., Tarzana, CA). Uma quantidade de ADN de 200-650 ng era adequado para a detecção de mutações em 29 das amostras de interesse; O controlo interno sondas e fluorescentes VIC

EGFR

sondas fluorescentes foram FAM dye-rotulados. As curvas de amplificação foram avaliados de acordo com as recomendações do fabricante.

A mutação e análise de amplificação por MLPA

análise

MLPA foi realizada com o uso de um EGFRmut design personalizado + ensaio, que tem sido anteriormente descrito em maior detalhe [14]. Este ensaio permite, simultaneamente, a detecção de

EGFR

mutações oncogênicas e uma análise do número de cópia (detecção de amplificação) da

EGFR

,

TEM

, e

ERBB2

. Todos os reagentes, exceto o mix sonda EGFRmut + foram comprados forma MRC-Holland Amsterdão, Países Baixos (www.mlpa.com). As reacções MLPA foram executados de acordo com as recomendações gerais do fabricante (MRC-Holland), como descrito anteriormente em [16,17]. Resumidamente, 5 ul de ADN genómico (com uma concentração de aproximadamente 20 ng /nl) foi incubada a 98 ° C durante 5 min, arrefecida até à temperatura ambiente e misturou-se com 1,5 mL de EGFRmut sondas + misturar e 1,5 ul de tampão de hibridação de salsa. A reacção foi então desnaturado a 95 ° C durante 2 minutos e hibridou-se a 60 ° C durante 16 h. As sondas hibridizadas foram ligados a 54 ° C durante 15 min pela adição de 32 ul de mistura de ligação. Após inactivação pelo calor, a reacção de ligação foi arrefecida até à temperatura ambiente, misturada com 10 ul de mistura de PCR (polimerase, dNTP e os iniciadores universais, uma das quais foi marcado com fluoresceína) e sujeitos a amplificação por PCR durante 35 ciclos. Os produtos foram subsequentemente diluída MLPA 20x em formamida contendo Hidi GS Liz600, o qual foi utilizado como um padrão de dimensionamento de ADN, e separados por meio de electroforese capilar (polímero POP7) num aparelho ABI Prism 3130XL (Applied Biosystems). Os eletroferogramas obtidos foram analisados ​​usando v1.91 software GeneMarker (2.4.0). As intensidades de sinal (alturas de pico) foram recuperados e transferidos para planilhas de Excel preparados (disponíveis mediante solicitação). Para cada amostra individual, a intensidade do sinal de cada sonda foi dividida pela intensidade média do sinal das sondas de controlo para normalizar os valores obtidos e para equalizar prazo para execução variação, e o valor normalizado para cada pico foi depois dividido por um correspondente valor nas amostras de referência e multiplicada por 2. o resultado final MLPA de cada amostra é apresentada na barra-trama, em que as barras indicam o valor do número de cópias relativa das sondas subsequentes.

EGFR número de cópias por análise PCR quantitativa (qPCR) e PCR digital de gotícula (ddPCR)

a análise qPCR foi realizado com a utilização da MESA VERDE qPCR MasterMix Plus para SYBR Ensaio (Eurogentec, Seraing, Bélgica), de acordo com as recomendações gerais do fabricante. ddPCR foi realizada com a utilização do sistema e QX200 EvaGreen Supermix (Bio-Rad, CA, EUA) de acordo com as recomendações gerais do fabricante, tal como descrito antes [18,19]. A análise foi realizada ddPCR num formato multiplex com a co-amplificação de controlo-amplicão e um dos amplicões de ensaio em uma reacção. Para conseguir a separação adequada dos tipos de gotas, a intensidade do sinal de teste e controle foi diferenciada por ‘comprimento e primers’ amplicons concentrações. Para ambos os métodos o mesmo conjunto de iniciadores de PCR foi utilizado: (i) test-amplicon para

EGFR

exão 2: frente GCAGTTGGGCACTTTTGAAG primer, o iniciador inverso TTCCAAATTCCCAAGGACCA (concentração em qPCR-300 nM, concentração no ddPCR e 100 nm , comprimento do amplicon 83 bp); (Ii) test-amplicon para EGFR exão 18: frente TTGTGGAGCCTCTTACACCC primer, reverter CCTTCAAGATCCTCAAGAGAGC primário (concentração em qPCR-300 nM, concentração no ddPCR e 100 nm, comprimento amplicon 64 pb); (Iii) o controle-amplicon: GCTGACCTGTTGGCTGAAAA iniciador directo, inverta GAATCGCTGTGGCCTTGATG primário (concentração em qPCR-300 nM, concentração no ddPCR-200 nm; comprimento amplicon 113 pb). Os amplicons quer sobrepostos, ou foram localizado perto as seguintes sondas MLPA: EGFR_e2, EGFR_e18 e ctrl_1, respectivamente. A temperatura de recozimento otimizado foi fixada em 59 ° C e 58 ° C, em qPCR e ddPCR, respectivamente

Resultados

Todas as 239 amostras foram analisadas como amostras cegas por dois métodos:. (I) um ensaio de RT-PCR comercial (EGFR-RT52; Entrogen Inc.), que abrange 29 das mutações oncogênicas mais comuns nos exons 18, 19, 20 e 21 da

EGFR

(para mais detalhes, consulte a página da web fabricantes; https://www.entrogen.com/web2/egfr-mutation-analysis-kit) e (ii) um ensaio de MPLA, feito à medida (EGFRmut +) que permite simultaneamente a detecção de amplificações e pequenas mutações em

EGFR

(para detalhes, ver [14]) (Fig. 1). Resumidamente, para além das sondas padrão sensível à dosagem (DS), o ensaio é também EGFRmut + composto por dois tipos de sondas sensível à mutação. MS- () sondas sensíveis à mutação são tipos de sondas de DS que são específicas para a sequência de tipo selvagem, mas se sobrepõem com os sítios das seguintes mutações: G719A /S /C (G719X) no exão 18 (sonda E18), in- eliminações quadro no exão 19 (sonda e19), S768I e inserções em-frame no exão 20 (sonda e20-1), T790M no exão 20 (sonda e20-2) e L858R no exão 21 (sonda e21). A ocorrência de uma destas mutações em uma amostra analisada provoca uma diminuição do sinal da sonda MS correspondente. O ensaio EGFRmut + também contém três sondas de mutação sensível-MS (+) que são específicos para as sequências mutantes. Os sinais a partir destas sondas ocorrer apenas se o correspondente mutação está presente. Duas dessas sondas reconhecer as sequências das

EGFR

mutações mais comuns (a eliminação mais comum em-frame no exão 19, c.2235_2249del15 (sonda e19 +) e L858R (sonda e21 +)), eo terceiro reconhece a mutação T790M, que está associada com a resistência TKI (sonda e20-2 +). Além disso, EGFRmut + contém um DS algumas sondas que são específicas tanto para

TEM

ou

ERBB2

que permitem amplificações destes genes a ser detectado.

A) Map of the

gene EGFR

com as posições dos amplicons de RT-PCR (EGFR-RT52) e sondas MLPA (EGFRmut ensaio +) indicado (linhas verticais sob o mapa). Os EGFRmut + sondas sensíveis à mutação são indicados em vermelho. Os cargos de oncogênico

EGFR

mutações são indicadas sobre o mapa. B) Os resultados de RT-PCR que representam (a partir do topo) (i) a amostra de referência (uma amostra sem mutações ou amplificação), (ii) uma amostra com a deleção mais comum em grelha no exão 19 (c.2235_2249del15) , (iii) uma amostra com ambos L858R no exão 21 e T790M no exão 20, e (iv) uma amostra com uma deleção em enquadramento no exão 19 (c.2235_2249del15) e

EGFR

amplificação. Em cada gráfico, os resultados sobrepostos das reacções 8 de RT-PCR que cobrem 29

EGFR

mutações são mostradas. As linhas vermelhas indicam a amplificação-curvas positivas de específico

EGFR

mutações (indicado no gráfico), e da linha de base verde representa o sinal não amplificado devido à falta da mutação avaliadas na amostra analisada. C) eletroferogramas MLPA de amostras analisadas por RT-PCR (painel B). Os IDs de sonda são indicadas sob as eletroferogramas. Os asteriscos indicam as sondas de controlo; as pontas de seta cor de rosa indicam menor sinal de MS- sondas e aumento de sinal de sondas MS +, respectivamente; e as setas pretas indicam sinais de

EGFR

sondas espec�icos amplificados. parcelas D) barra correspondente para os electroferogramas mostrados no painel C e que representa o valor normalizado número de cópias (eixo y) de cada sonda de (eixo x). As pontas de seta cor de rosa indicam um valor de número cópia reduzida das sondas MS- e um aumento do valor do número de cópias dos MS + sondas, respectivamente.

Características das mutações detectadas

No total, detectamos 30 mutações em 29 dos 239 amostras (12,1%). Ambos L858R e T790M foram encontrados em uma amostra. Entre as mutações identificadas eram 16 deleções em-quadro no exão 19 (53%), 9 substituições L858R (30%), 2 substituições L861Q (7%), uma substituição G719X, uma inserção em grelha no exão 20 e uma substituição de T790M (S1 Tabela; resumidos na Tabela 1). As mutações eram muito mais frequente nas mulheres do que nos homens 22/68 7/142 (24,4% versus 4,7%, respectivamente; p 0,0001). A estratificação da frequência de mutação por idade [ 55 (13%), 55 (11,9%)] e o tipo de amostra [FFPE (11,9%), as amostras citológicas (12,5%)] não apresentaram influências significativas destes factores na frequência de mutação (Tabela 1). Nós também não observamos uma diminuição na frequência de mutação em amostras com uma menor percentagem de células tumorais (PTC). Note, no entanto, que apenas uma pequena fração (aproximadamente 5%) das amostras analisadas tiveram PTC≤30%.

Comparação de métodos de detecção de mutação de RT-PCR e MLPA

Há nenhum método padrão-ouro para detecção de mutações em amostras de câncer, onde uma mutação em particular podem ser responsáveis ​​por uma muito baixa fração do DNA analisado. Por isso, para avaliar a qualidade do ensaio baseado EGFRmut +-MLPA, comparou-se que com o método de RT-PCR rotineiramente utilizados e bem validada. Uma comparação directa dos resultados de RT-PCR e MLPA mostrou uma muito elevada concordância entre estes dois métodos (98,7% resultados concordantes), bem como 100% de especificidade (falsos positivos) e 90% de sensibilidade (27 de 30 mutações detectadas) do teste EGFRmut +. Entre as 3 mutações que não foram detectadas pelo ensaio de EGFRmut + eram dois casos, com a substituição L861Q, que não é coberta pelas sondas EGFRmut + (Fig. 1A), e uma mutação G719X em uma amostra com uma baixa PTC (15%). Além disso, entre as amostras analisadas pelo MLPA foram 4 duplicados cegos com 3 mutações diferentes. Em todos os casos, os resultados das amostras em duplicado eram concordantes. Além disso, deve-se notar que as sondas MS + (ocorrência de sinal) detectar mutações mais facilmente e com uma confiança maior do que MS- sondas (diminuição de sinal). As sondas MS + permitiu a detecção de mutações confiante, mesmo quando essas mutações responsáveis ​​por uma fracção muito pequena do DNA analisado (~ 10%) em amostras com PTC≤30%. Por exemplo, a mutação L858R, que é coberto por ambos os sondas MS + e MS-, em três amostras, não poderia ser detectado por uma diminuição do sinal da sonda de MS, mas foi facilmente detectada pela ocorrência de um sinal de baixa mas clara da sonda MS +. A menor sensibilidade das sondas MS- resulta principalmente da variação relativamente alta de sinal das sondas DS em amostras de câncer. A maior variação do sinal MLPA em amostras de câncer tem sido observado anteriormente, e resulta principalmente da heterogeneidade genética de amostras de câncer [20] e a qualidade inferior e degradação frequente de amostras de DNA isoladas a partir de tecidos FFPE [21-25].

a amplificação de EGFR, MET e ErbB2 e sua relação com a frequência de mutação

a vantagem adicional do ensaio MLPA é que, além de detecção de mutações, ele também fornece informações sobre um número de cópias relativa de todas as sequências /sondas analisadas . Ele permite que uma estimativa grosseira da fração de mutações detectadas em amostras analisadas e permite a detecção de alterações no número de cópias (ampliações) nos genes analisados:

EGFR

,

TEM

e

ERBB2

. Definindo número de cópias relativamente 3-4 como um “ganho”, e ≥4 como “amplificação”, que identificou 12 (5%), 17 (7%) e, 2 (1%) amostras com ganhos e 7 (3%) , 11 (5%) e, 3 (1%) amostras com amplificações de

EGFR

,

MET

, e

ERBB2

, respectivamente (S1 Tabela e Fig. 2 ). A distribuição do número de cópias amplitude foi semelhante para todos os 3 genes, com os maiores amplificações superior a 10 cópias. Como no caso das mutações, observou-se uma frequência muito maior de

EGFR

ganhos /amplificações em mulheres do que em homens (18% versus 2%, respectivamente; p 0,0001). Uma tendência semelhante não foi observado para

MET

(13% versus 11%, respectivamente), e uma revertida, mas foi observada não tendência significativa para

ERBB2

(1% versus 3%).

A) Exemplos de

EGFR

(amostras v-vi),

TEM

(amostras vii-viii) e

ERBB2

(amostras ix-x) amplificação detectados pelo ensaio EGFRmut +. B) Características das amostras com

EGFR

,

MET Comprar e

ERBB2

ganhos /amplificações. As amostras mostradas na Fig. 1D (ii-iii), e Fig. 2A (VI-X) estão indicados na primeira coluna. O sexo e

EGFR

estado de mutação de cada amostra estão indicadas na segunda e terceira colunas, respectivamente. Colunas 4-6 mostram os valores do número de cópia de

EGFR

,

MET

e

ERBB2

, respectivamente. As células azuis escuros indicam amplificações (número de cópias ≥4), e as células luz azul indicam ganhos (cópia número 3-4). C) Frequência de

EGFR

mutações em amostras com

EGFR

amplificação,

EGFR

ganho e normal

EGFR

número de cópias.

Como se mostra na Fig. 2, os ganhos e amplificações de

EGFR

,

MET

e

ERBB2

eram mutuamente exclusivas. No entanto, observou-se forte associação entre a ocorrência de

EGFR

mutações e

EGFR

amplificação (teste do qui-quadrado para tendência; p 0,0001). Todos, mas uma amostra do câncer (90%) com o

EGFR

amplificação e 7 de 12 amostras (58%) com

EGFR

ganho teve um

EGFR

mutação.

Um exame cuidadoso dos resultados MLPA com

EGFR

amplificações (ver exemplos na Fig. 1 e Fig. 2) indicam que a diminuição do sinal a partir das sondas MS- e o aumento do sinal das sondas + MS (fração de cópias mutadas) é aproximadamente a mesma ou até maior do que o aumento no

EGFR

número de cópias. Este resultado sugere que todas as cópias amplificadas de

EGFR

nas amostras mutantes contêm a mutação (isto é, que apenas o alelo mutante é submetido a amplificação) e mutações que ocorrem como um evento desencadeador precoce, tornando

EGFR

amplificação benéfica para o câncer. Note-se que todas as amostras contêm uma certa quantidade de DNA normal, o que pode achatar o número de cópias mudanças observadas e mascarar o efeito em amostras com um menor nível de amplificação.

Esta observação levou-nos a sequenciar exons 18-21 (que codifica o domínio da tirosina quinase) em amostras com

EGFR

ganhos /amplificações em que nenhum conhecidos

EGFR

mutação foi encontrada. A análise de sequenciação não revelou quaisquer novas variantes de sequências que podem ser mutações oncogênicas ou gatilho

EGFR

amplificação.

Replicação de análise de número de cópias do EGFR (detecção de amplificação) com o uso de qPCR e ddPCR

Para confirmar os resultados de

EGFR

copiar análise do número de nós reanalisados ​​um painel de amostras de cancro, incluindo todas as amostras com

EGFR

amplificação, com o uso de qPCR e ddPCR. Ambos os métodos são baseados em princípios completamente diferentes do que MLPA. A qPCR é um método que utiliza a quantificação em tempo real do produto de PCR, mais comumente utilizado para a verificação do número de cópias, variantes identificadas em ambos normal (não-cancro) e amostras de cancro (por exemplo, [26,27]). O ddPCR é um novo método de quantificação, com base na contagem absoluta de ADN de referência testadas e moléculas amplificado por clonagem, em milhares de água-em-óleo de gotículas reacções (emulsão de PCR). A utilidade de ddPCR com o corante EvaGreen dsDNA vinculativo para precisas estimativa copy-número foi recentemente demonstrado em vários estudos [18,19,28]. Com a utilização de ambos qPCR e ddPCR, os sinais de dois test-amplicões, localizada no exão 2 e o exão 18 de

EGFR

, foram analisados ​​em relação ao sinal de controlo-amplicão (correspondente à sonda MLPA ctrl_1). A análise realizada mostrou que os resultados de ambos qPCR e ddPCR se correlacionam muito bem com os valores de número de cópias relativos, determinada com a utilização de MLPA (coeficiente de correlação R = 0,941 e P = 0,927, respectivamente), e que os sinais de amostras com

EGFR

amplificação foram bem separados a partir de sinais de amostras sem amplificação (S1 Fig.). É de notar, contudo, que não se pode excluir que algumas amostras com valores de número de cópias limítrofe pode ser erroneamente classificados. Algumas discrepâncias nos valores de sinal absolutos, determinados por MLPA, e os métodos de referência pode resultar de diferentes conjuntos de regiões de controlo utilizado para normalização e do facto de MPLA, é um método de multiplexagem e mede o número de cópias em vários pontos num gene de interesse. Resultados semelhantes foram obtidos para

MET

e

ERBB2

(dados não mostrados).

Discussão

É bem conhecido que a frequência de

EGFR

mutações difere substancialmente entre as populações humanas. A frequência de mutação é maior nos asiáticos (45-52%); inferior em europeus (24%), afro-americanos (20%) e hispânicos (17%); e menor na australianos brancos (7%) ([11,29] e referências dentro). Também entre os europeus, freqüências diferentes de

foram relatados EGFR

mutações: por exemplo, 17% em Espanha [30] e 10% no Sul da Alemanha [31]. Neste estudo, com base numa análise exaustiva de um número significativo de amostras de adenocarcinoma de pulmão, caracterizada e determinada a frequência de

EGFR

mutações em pacientes poloneses (12,1%). Nossa análise mostrou uma frequência muito mais alta (4,8x) de

EGFR

mutações em mulheres do que em homens (24% contra 5%, respectivamente). Observou-se uma tendência semelhante para

EGFR

ganhos /amplificações, que mostrou ainda maior sobre-representação (9x) em mulheres do que em homens (18% vs. 2%, respectivamente). Embora a maior frequência de

EGFR

mutações em mulheres do que em homens tem sido observado muitas vezes antes, a sobre-representação de

EGFR

mutações em mulheres observadas em nosso estudo é, de acordo com nosso conhecimento, um do mais elevado registado até agora (excluindo os estudos com um número muito pequeno de amostras /mutações) ([11,29] e as referências dentro). As informações sobre a frequência característica e específicos de população de mutações são fatores epidemiológicos importantes que podem influenciar a implementação de procedimentos de diagnóstico e tratamento adequados ideais para determinada população.

diagnosticadores Molecular Cancer abordar material de tumor heterogêneo diversificada em uma base diária. DNA é isolado a partir de tumores cirurgicamente ressecados (frescos ou FFPE) e de agulha fina e as células aspirado de agulha de ultra-som transbrônquicas endobrônquica. Cada uma destas amostras histológicas ou citológicas pode ter diferentes e por vezes muito baixo PTC, e que muitas vezes mostram um nível substancial de degradação do DNA (especialmente as amostras FFPE). Além disso, a fixação de formalina podem danificar o DNA e levar a modificações da sequência. Todos esses fatores fazem com que diferentes tipos de artefatos que podem levar a ambos os resultados falso-positivos e falso-negativos.

Neste estudo, nós testamos um ensaio EGFRmut + MLPA (um método padrão da sensibilidade) como uma segunda método camada e comparados os resultados com os de um ensaio de RT-PCR comercial bem validado (um método de elevada sensibilidade). Estes dois métodos são baseados em princípios completamente diferentes. Em RT-PCR, a detecção de mutações é baseado na hibridação de sondas específicas para o TaqMan mutação, mas em MLPA, a detecção de mutações é baseado na ligação e subsequente amplificação de tipo selvagem ou sondas específicas de mutação. Os nossos resultados indicam que EGFRmut + é um ensaio robusto que exibe uma elevada reprodutibilidade, a especificidade e sensibilidade. Um pequeno número de mutações não detectados, ou não foram cobertas pelas sondas MLPA (n = 2) ou que tenha ocorrido uma amostra com uma baixa PTC (n = 1). O ensaio EGFRmut + nos permitiu detectar mutações em todos os tipos de amostras (histológicos e citológicos; fresco congelado e FFPA) e nos permitiu detectar mutações em amostras com diferentes PTCs (20-90%). No entanto, deve notar-se que as sondas MS + permitir a detecção de mutações mais robusta do que as sondas MS- fazer e que a qualidade dos resultados MLPA é geralmente inferior para amostras de cancro do que para as amostras de ADN de linha germinal. A qualidade mais baixa de câncer resultados MLPA é devido às características acima mencionadas de amostras de cancro e tem sido relatado e discutido anteriormente [23-25,32]. Fatores adicionais que tornam o ensaio MLPA atraente como um segundo nível

EGFR

método de detecção de mutações são a baixa quantidade de DNA (50-100 ng) necessária para análise (não é necessária a extração de amostra adicional ou preparação, ea mesma amostra de DNA pode ser utilizado tanto para a análise MLPA RT-PCR e), um curto tempo de rotação ( 2 dias), e de baixo custo (cerca de US $ 5 mais o custo inicial da síntese de sonda, de aproximadamente US $ 3.000). No caso de ensaios de rotina utilizados, o custo da síntese de sonda pode ser ignorada, porque a quantidade das sondas sintetizadas é suficiente para centenas de milhares de análises.

Além

EGFR

detecção de mutações , o ensaio EGFRmut + também permite a detecção de

EGFR

,

MET

e

ERBB2

amplificação. Embora os dados não sejam conclusivos, tem sido sugerido que

EGFR

amplificação pode ser um indicador ou modificador de sensibilidade ao tratamento com TKI (revisto em [11]).