Sumário

A medicina tradicional chinesa tem vindo a ganhar popularidade devido à sua capacidade de matar as células tumorais. Recentemente, os efeitos apoptóticos e anti-angiogénicos de Trametes robiniophila murr (Huaier) têm sido investigados. O objetivo deste estudo foi investigar o seu efeito sobre a mobilidade celular e crescimento do tumor no câncer de ovário. A viabilidade celular e motilidade foram medidos através de ensaios SRB, scratch e migração. apoptose celular foi analisada através de coloração de anexina V /PI. Utilizando um ensaio de array de proteínas de fase reversa (RPPA), foram analisados ​​os níveis de 153 proteínas e /ou em células fosfolarização Huaier-tratados e não tratados. Huaier viabilidade inibido celular e induzida precoce e tardia apoptose em SKOV3, SKOV3.ip1 e Hey células de uma forma tempo e dose-dependente. invasão e migração celular também foram reprimidas de forma significativa. Os resultados RPPA mostrou diferenças significativas (de pelo menos 30%; p 0,05) nos níveis de 7 moléculas em células SKOV3 e 10 em células SKOV3.ip1 entre as células não tratadas e tratadas. A maioria das funções têm moléculas identificadas na proliferação celular, apoptose celular ou adesão /invasão. A análise de Western blot ainda validado que o tratamento Huaier resultou numa diminuição da fosforilação de AKT, a expressão aumentada do total GSK3β, a inibição da fosforilação de GSK3β em S9, a redução de ambos expressão β-catenina citoplasmática e nuclear translocação β-catenina e a repressão da transcrição de vários Wnt /genes alvo β-catenina (

DIXDC1, LRP6, genes WNT5A

, e ciclina D1). Depois de derrubar GSK3β, expressão β-catenina não poderia ser inibida por Huaier. Finalmente, Huaier inibiu o crescimento de xenoenxertos de tumor do ovário in vivo. Estes estudos indicam que Huaier inibe a mobilidade de células de tumor no cancro do ovário através da via de sinalização de Akt /GSK3β /β-catenina

citação:. Yan X, Lyu t, Jia N, Yu Y, K Hua, Feng W ( 2013) Huaier extrato aquoso Inibe Ovarian Cancer motilidade celular através da AKT /GSK3β /β-catenina Caminho. PLoS ONE 8 (5): e63731. doi: 10.1371 /journal.pone.0063731

editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de outubro de 2012; Aceito: 05 de abril de 2013; Publicado em: 08 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Yan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é suportado pelo National Science Foundation Natural da China, conceda número 30973185 (https://www.nsfc.gov.cn). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro do ovário

epitelial é uma das principais causas de morte por câncer ginecológico nos Estados Unidos e a quinta causa mais comum de mortalidade por câncer em mulheres [1]. A incidência de cancro do ovário aumenta com a idade. Setenta por cento dos pacientes apresentam doença avançada, e menos de quarenta por cento poderia ser curada. A sobrevida global de câncer de ovário avançado não se mostrou promissor, mesmo após a cirurgia combinada com novas estratégias adjuvantes, tais como altas doses de quimioterapia com transplante de células estaminais do sangue periférico, paclitaxel semanal de dose-densa com carboplatina e terapia-alvo com carboplatina /paclitaxel. Recentemente, os resultados de um ensaio randomizado de fase III (GOG 0208) mostraram que a utilização de bevacizumab (um Receptor do Factor de anticorpo de Crescimento Endotelial) durante e até 10 meses após a carboplatina e quimioterapia com paclitaxel prolonga a sobrevivência livre de progressão média cerca de 4 meses em pacientes com câncer epitelial de ovário avançado [2]. No entanto, a sobrevivência global é semelhante à terapia convencional, apesar da despesa elevada. Porque nenhuma dessas estratégias pode proteger completamente pacientes com câncer ovariano de recorrência e metástase, são urgentemente necessários novos medicamentos.

Entre as terapias complementares, a medicina tradicional chinesa (MTC) ganhou popularidade por sua capacidade de matar as células tumorais com menos danos a células normais. Além disso, o TCM tratamento à base de plantas é relativamente barato e tem sido relatado para aumentar a eficácia da quimioterapia, reduzir a toxicidade, prolongar o tempo de sobrevivência, e melhorar a qualidade de vida e as funções imunológicas [3]. Trametes robiniophila murr (Huaier) é um tipo de fungo da China, que foi utilizado em TCM por aproximadamente 1600 anos. No entanto, os seus efeitos e mecanismos anti-tumorais têm sido estudados apenas nos últimos anos. Os ingredientes eficazes foram extraídos e analisados ​​por chromatophy líquida de alta eficiência (HPLC) e dodecil sulfato de electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), as análises, que identificou proteoglicanos, como componentes principais do extracto Huaier, que consistia em 41,53% de polissacáridos, 12,93 aminoácidos% e água 8,72% [4], [5]. A droga, que foi aprovado pela chinês Food and Drug Administration (FDA), foi utilizado em pacientes com cancro hepatocelular. Experiências in vitro mostraram que Huaier pode inibir o crescimento de células de carcinoma hepatocelular (HepG2, MHCC97H), células de adenocarcinoma de pulmão humano (A549) e as células de cancro da mama humano (MCF-7, MDA-MB-231) através da indução de apoptose [6] – [8]. Recentemente, Wang et al. relataram que o extracto Huaier pode servir como um potente agente anti-angiogénica e antitumoral [9]. No entanto, se Huaier afecta o comportamento biológico das células do ovário não tem sido explorado. Neste estudo, em adição aos seus efeitos anti-proliferativos e apoptóticas, a nova possibilidade de que Huaier exerce um efeito anti-invasivo em células de cancro do ovário através da via de sinalização de Akt /GSK3β /β-catenina foi investigada.

materiais e Métodos

Anticorpos e reagentes

O meio RPMI-1640 foi adquirido a Jinuo Co., Ltd (Xangai, China). de soro bovino fetal (FBS) foi fornecido pela Gibco-BRL (Rockville, IN, EUA). Os anticorpos contra AKT (1:1000), pAKT-Thr308 (1:1000), PS6-S235 (1:1000), PS6-S240 (1:1000), ciclina D1 (1:2000), ciclina A (1:2000 ), a e-caderina (1:1000), glicogénio sintase quinase 3 beta (GSK3β, 1:1000), GSK3β fosfo S9 (1:500, Epitomics, CA, EUA.) e β-catenina (1:1000) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA). O H1 anti-histona (1:300) e anti-rato e anti-IgG de coelho com peroxidase de rábano (HRP) () 1:5000 anticorpos foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Anti-GAPDH (1:3000) e anti-β-actina (1:3000) foram adquiridos a Biyuntian Biotech Co., Ltd. (Xangai, China). Todos os outros produtos químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, EUA) e Biyuntian Biotech Co., Ltd.

Preparação de Huaier extrato aquoso

A pomada electu�io de Huaier foi um presente de Gaitianli Medicine Co. Ltd (Jiangsu, China). Os métodos de preparação para o extracto Huaier e os seus ingredientes foram descritos noutro documento [4], [5] Um total de 2 g da pomada electuário foi dissolvido em 50 ml de meio completo e esterilizado com um filtro de 0,22 um para obter os 40 mg /ml de solução de estoque, o qual foi armazenado a -20 ° C.

cultura celular

Os três tipos de linhas celulares de cancro epitelial do ovário foram usadas neste estudo. células SKOV3 e hey foram obtidas a partir da American Type Culture Collection. células SKOV3.ip1 foram presentes de da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center (Houston, TX) [10]. As linhas celulares foram rotineiramente mantidas em meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. As células foram incubadas a 37 ° C em 5% de CO

2.

proliferação celular ensaio

O efeito inibidor do crescimento de Huaier foi determinada utilizando um ensaio de sulforrodamina B (SRB). Resumidamente, as células SKOV3 (2,5 × 10

3), as células SKOV3.ip1 (2 × 10

3) e Ei células (1,5 x 10

3) foram semeadas em placas de 96 poços e tratadas com o extracto aquoso Huaier em diferentes concentrações. Nos tempos indicados, as células foram lavadas, fixadas com 30% (p /v) de ácido tricloroacético, e coradas durante 30 minutos à temperatura ambiente com 0,4% de sulforrodamina B (SRB) em ácido acético a 1%. O corante foi lavada com 1% (vol /vol) de ácido acético e, em seguida, dissolvido em uma solução de base Tris 10 mM. As placas foram lidas com um leitor de microplacas (Bio-Rad) a 570 nm. Cada experimento foi realizado em triplicado e repetidos pelo menos três vezes

anexina V /PI coloração

O celular Kit Apoptosis inoperante com anexina V Alexa Fluor® 488 Iodeto de propídio (PI) (Invitrogen, CA, EUA) foi utilizado para investigar se o tratamento com Huaier induziu as células SKOV3, células SKOV3.ip1 e Hey células a sofrer apoptose. As células foram marcado por fluorescência de acordo com as instruções do fabricante. Em SKOV3, células cultivadas breves (2 × 10

5), SKOV3.ip1 (2 × 10

5) células e células Hey (5 × 10

3) numa placa de 35 mm foram tratadas com diferentes concentrações de Huaier durante 48 horas. As células foram colhidas e ressuspensas a 1 x 10

6 células /ml em tampão de ligação. Em seguida, corante verde fluorescente (AlexaFluor® 488) -conjugated anexina V e PI foram adicionados e incubados no escuro durante 15 min à temperatura ambiente. As amostras foram analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACScan (Beckman) equipado com o software CellQuest. A percentagem de células apoptóticas foi calculada a partir da percentagem de células no quadrante inferior direito (RV) do gráfico de pontos, que representa o número de células apoptóticas precoces (anexina V + /PI-) dividido pelo número total de células. Cada experimento foi repetido pelo menos três vezes.

In vitro zero ensaio

Um ensaio zero in vitro foi realizado para avaliar o modo como a migração celular foi afetada pela administração do extrato aquoso Huaier. Um total de 2 x 10

4 células foram semeadas numa placa de 24 poços. Os pontos de referência perto do “zero” foram marcadas para garantir a utilização da mesma área para a aquisição de imagem. Após um período de incubação de 24 horas, monocamadas confluentes do SKOV3, SKOV3.ip1 e Hey células foram riscado usando uma ponteira 200 mL de criar um “zero” em linha reta. Depois de lavar 2 vezes com PBS, meio isento de soro contendo Huaier extracto (5 mg /ml) foi adicionado a cada poço. A largura zero foi medida em quatro locais pré-definidos no início e após 12 e 24 horas após a zero em células SKOV3 e SKOV3.ip1. E a largura zero foi medida em Hey células no início e aos 6 e 12 horas após o início. As distâncias entre os 2 bordas do zero foram medidos nos pontos de referência e analisados ​​estatisticamente

ensaios de invasão Matrigel

O sistema Transwell (24 cavidades de inserção;. O tamanho dos poros, 8 mm; Corning Costar, Lowell, MA, EUA) foi utilizado para explorar o efeito do extracto aquoso Huaier na invasividade do SKOV3, SKOV3.ip1 e Heycells. As pastilhas foram revestidas com 30 ul de Matrigel (B.D. Biosciences Pharmingen). Um total de 3 × 10

4 SKOV3, células SKOV3.ip1 e Ei cada suspenso em 0,2 ml de meio fresco sem soro fetal de bovino foram adicionadas ao poço superior da câmara. No grupo de controlo, 600 ul de meio completo foi adicionado ao poço inferior, enquanto que no grupo teste, o meio continha 5 mg /ml Huaier. Após incubação durante 24 horas, as células na superfície superior da membrana foram bateu com cotonetes de algodão. Em seguida, as células aderentes à superfície inferior das inserções foram fixadas e coradas com hematoxilina. Seis campos representativos de cada inserção foram contadas aleatoriamente usando um microscópio óptico Olympus.

array de proteínas de fase reversa

células SKOV3 e células SKOV3.ip1 (5 × 10

5) foram cultivadas em placas de 6 cm de diâmetro. Após uma incubação de 24 horas, as células foram divididas em quatro grupos para receber tratamentos diferentes: meio completo apenas por 72 horas, o extracto aquoso Huaier (5 mg /ml) durante 72 horas, de meio completo durante 60 horas mais a fome durante a noite e 10 minutos de estimulação com o factor de crescimento epidérmico (EGF, 20 ng /ml) e extracto aquoso Huaier (5 mg /ml) durante 60 horas mais a fome durante a noite e 10 minutos de estimulação com EGF (20 ng /ml). O ensaio de array de proteínas de fase reversa (RPPA) foi realizada no Funcional Proteomics Fase Reversa Facilidade matriz proteína do núcleo na M.D. Anderson Cancer Center. Em resumo, os lisados ​​de células foram ajustadas para as respectivas concentrações de proteína, desnaturados com SDS, e diluídas em série (a partir de não diluído diluição a 1:16), para definir o intervalo linear de cada reacção antigénio-anticorpo. Os lisados ​​foram depositados em lâminas revestidas de nitrocelulose (Whatman, Inc.) usando uma microarrayer G3 GeneTAC (Soluções genómico) juntamente com controlos positivos e negativos. Um total de 153 anticorpos específicos validados para proteínas ou seus locais fosforilados que estão envolvidos em várias vias de sinalização estavam disponíveis e utilizados na RPPA (Ver Tabela S1 para as proteínas e os sítios de fosforilação utilizados em estudos RPPA). Cada lâmina foi sondada com um anticorpo primário, mais um anticorpo secundário conjugado utilizando a abordagem de amplificação Dako CSA (tiramida) e visualizada utilizando a reacção colorimétrica DAB. Os dados coletados foram quantificados utilizando o software MicroVigene quantitativa, que foi desenvolvido especificamente para esta abordagem. Os níveis de fosforilação de proteína foram expressos como uma proporção em relação às proteínas totais equivalentes. Os valores derivados da encosta e as interceptações foram expressos em relação aos lisados ​​celulares de controle padrão na matriz. Todos os valores foram comparados com a média dentro de cada sonda de anticorpo e visualizada com mapas térmicos criadas pelo software Matlab (Mathworks Inc.).

fraccionamento celular

As proteínas nucleares foram isolados usando o BestBio nuclear e citoplasmática reagentes de extracção (BestBio, Xangai, China) de acordo com as especificações do fabricante. Resumidamente, 1 x 10

6 as células foram lavadas duas vezes com PBS frio e lisadas com 100 uL de reagente gelada extracção citoplásmico (CER) e 1 ul de mistura de inibidores de protease. Depois de recolher a fracção citoplasmática (sobrenadante), o reagente de extracção nuclear (NER) e mistura de inibidores de protease foram adicionados à fracção insolúvel, mantendo a proporção de volume de CER: NER: cocktail de protease a 100:500:1. Na sequência de uma incubação de 60 minutos e a 5 minutos de centrifugação (16000 x

g

a 4 ° C), a fracção nuclear foi recolhido. O sobrenadante e a fracção nuclear foram submetidos a análise de Western blot para β-catenina.

análise Western blot

As células foram plaqueadas a uma densidade de 2 × 10

5 por 3,5 cm prato de diâmetro e recolhidas após o tratamento indicado. As células foram lisadas em tampão de lise (Biyuntian Biotech Co., Ltd., Shanghai, China) seguindo as instruções do fabricante. Quantidades iguais de proteína (20 ug por pista) foram separados por 12% SDS-PAGE e transferidos para membranas de PVDF (Millipore, Billerica, MA). Após o bloqueio, as membranas foram sondadas com os anticorpos primários e incubadas durante a noite a 4 ° C, seguido de marcação com os anticorpos secundários apropriados, conjugados com HRP. bandas imuno-reactivas foram visualizadas utilizando o sistema de detecção ECL (Pierce, Rockford, IL, EUA). GAPDH, β-actina e a histona H1 foram utilizados como controlos de carga.

A imunocitoquímica

Células cultivadas foram lavadas com PBS e fixadas com paraformaldeído a 4%. As lâminas foram lavadas novamente, tratado com 1% de Triton durante 15 minutos e bloquearam-se com 3% H

2O

2 durante 20 min. Após a lavagem, as lâminas foram bloqueadas com soro de cabra normal durante 10 minutos à RT e incubaram-se em primeiro lugar com 1:200 anticorpo caderina-E anti-humana (Epitomics, CA, EUA) a 4 ° C durante a noite e, em seguida, com um anti-coelho biotinilado anticorpo secundário por 30 minutos à TA. Em seguida, as lâminas foram incubadas com o sistema biotina-avidina-peroxidase durante 10 minutos à temperatura ambiente e coradas com diaminobenzidina (DAB) durante 2 minutos. Por fim, eles foram contrastadas com hematoxilina e visualizadas em microscópio de luz.

quantitativa em tempo real de RT-PCR

As células foram tratadas com ou sem 7,5 mg /ml Huaier durante 48 h. O ARN total foi extraído a partir das células tratadas e de controlo utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. O ADNc foi sintetizado a partir de 1 ug de ARN utilizando o kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Fermentas, St. Leon-Rot-, Alemanha). Os níveis de expressão de genes relacionados com a via de sinalização Wnt [domain contendo-1 (

DIXDC1)

DIX], lipoproteína de proteína relacionada com receptor de baixa densidade 6 (

LRP6)

, e do tipo sem asas MMTV família local de integração, membro 5A (

genes WNT5A)

) foram avaliados com um sistema em tempo real Illumina Eco usando um kit perfeito tempo real (Takara). β-actina foi utilizado como um controlo interno em cada reacção. Os conjuntos de iniciadores para estes genes serão fornecidos mediante solicitação. As mudanças vezes relativamente foram calculados utilizando o método ΔΔCt.

Mouse xenotransplante e medição do tamanho do tumor

O animal experimentos foram aprovados pelo comitê de ética do Hospital Obstetrícia e Ginecologia da Universidade de Fudan. camundongos fêmeas de seis semanas de idade BALB /c foram adquiridos a partir do SIPPR Sino-Britânica /BK Biotério Ltd., Co (Xangai, China). células SKOV3 (4 × 10

6) foram injectados por via subcutânea no flanco direito de cada ratinho. Em seguida, os ratos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (n = 6 ratos /grupo) para receberem ou uma solução salina normal (NS) como um controlo, Huaier (4 g /kg de peso corporal), de cisplatina (DDP) (5 mg /kg de peso corporal ) ou mais Huaier DDP. Huaier foi administrada por via oral diariamente. DDP foi injectado uma vez por semana durante três semanas. Os ratinhos de controlo foram tratados com o mesmo volume de apenas NS. Os volumes dos tumores foram medidos duas vezes por semana utilizando um calibrador digital e calculada usando a seguinte fórmula: Volume do tumor (mm

3) = (comprimento do tumor [mm] x largura x altura tumoral [mm]) n /6. Os ratos foram mortos no dia 42 após a injecção das células tumorais. Os pesos corporais também foram medidos para avaliar os efeitos colaterais. Os meios de três medições independentes foram em média

mediada por siRNA silenciamento gênico

Os duplexes GSK3β siRNA que têm como alvo as sequências:. (5′-GAGCAAAUCAGAGAAAUGAdtdt-3 ‘) foi sintetizado por Genechem (Shanghai , China), para ARNsi transfecção, 5 × 10

5 células /prato foram plaqueadas em placas de cultura de 60 mm. No dia seguinte, 10 ul de Lipofectamina reagente 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi adicionado a 0,5 ml de Opti-MEM reduzida meio de soro (Invitrogen, Carlsbad, CA), sem antibióticos e de soro, e incubaram-se à temperatura ambiente durante 5 min (solução UMA). 200 pmol siARN foi adicionado a 0,5 ml de meio Opti-MEM sem soro e antibióticos (solução B). A solução A e a solução B foram depois misturadas e incubadas à temperatura ambiente durante 20 min. O meio de cultura celular foi removido, e, em seguida, 1 ml da mistura de 2,000 siRNA-Lipofectamina e 4 ml de meio fresco sem antibióticos 1640 foram adicionados a cada placa de cultura e misturou-se suavemente. 24 horas mais tarde, o meio foi substituído com meio de cultura fresco ou 5 mg /ml de extracto aquoso Huaier. As células foram colhidas para análise western blot após 24 horas de incubação.

A análise estatística

Os dados são apresentados como médias ± desvio padrão. As experiências foram repetidas três vezes. Os resultados foram analisados ​​usando o software SPSS 11.5. p 0,05 foi aceito como significante

Resultados

Huaier inibiu a viabilidade celular em SKOV3, SKOV3.ip1 e Hey células

Para avaliar o efeito do Huaier extrair na. SKOV3, SKOV3.ip1 e Hey células, medimos a viabilidade celular utilizando o ensaio SRB. Depois as células foram tratadas com Huaier para 24, 48, 72 e 96 horas a diferentes concentrações (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5 e 10 mg /ml), Huaier inibiu significativamente o crescimento do SKOV3, SKOV3.ip1 e Ei células em um tempo e modo dependente da dose (Figura 1). O efeito citotóxico iniciada 24 horas após o tratamento de 5 mg /ml Huaier e tornou-se mais evidente aos 48, 72 e 96 horas, no SKOV3 e Hey células, enquanto que começou às 48 horas nas células SKOV3.ip1. A Ei e células SKOV3.ip1 foram mais sensíveis ao tratamento Huaier, como as taxas de viabilidade foram diminuiu a 31,94% (72 horas, P 0,001) e 20,43% (96 horas, P 0,001) nas células SKOV3.ip1, 4,9% (72 horas, P 0,001) e 3,1% (96 horas, P 0,001) nos Hey células em comparação com 61,1% (72 horas, p = 0,01) e 40,1% (96 horas, p 0,001) no células SKOV3. Um decréscimo significativo na viabilidade das células foi observada quando as células foram tratadas com 10 mg /ml Huaier, independentemente da duração do tratamento.

O efeito inibidor do crescimento de Huaier foi medida utilizando o ensaio SRB. SKOV3 (A) SKOV3.ip1 (B) e Hey células (C) foram tratadas com Huaier para 24, 48, 72 e 96 h. Os experimentos foram realizados em triplicado, e os dados são apresentados como os meios ± DP de três experiências separadas.

apoptose celular analisados ​​utilizando PI-anexina-V coloração

Porque o Huaier extrair o crescimento celular inibido significativamente, exploramos ainda se este efeito foi alcançado através da indução de apoptose. O ensaio de coloração V PI-anexina mostraram que após o tratamento Huaier durante 48 h, a apoptose tardia ou taxa de morte celular (UR) e a taxa de apoptose precoce (LR) ambos aumentaram de uma forma dependente da dose em células SKOV3, SKOV3.ip1 e Ei células (Figura 2 e Tabela 1).

a percentagem de células apoptóticas foram medidos por citometria de fluxo utilizando o ensaio de PI-anexina V. (A, B, C) Os gráficos de pontos que mostram a apoptose em células SKOV3 (A), SKOV3.ip1 (B) e Hey células (C) com tratamento Huaier a 0, 2,5, 5 e 10 mg /mL durante 48 h.

motilidade celular diminuiu devido à exposição a Huaier extrair

para explorar se o Huaier extrair motilidade celular afetada, foram realizados ensaios de invasão celular e scratch. Quando as células SKOV3 foram tratados com 5 mg /extracto Huaier ml, o número de invadir células através da membrana de Matrigel-revestidos foi significativamente diminuída em comparação com o grupo não tratado (218 ± 35 versus 18 ± 7, p 0,001,), indicando que capacidade de invasão foi inibida. Resultados semelhantes foram encontrados no SKOV3.ip1 e Hey células (SKOV3.ip1: 438 ± 26 contra 83 ± 25; Hey: 264 ± 21 versus 62 ± 16 p 0,001, Figura 3).

(A ) o efeito de Huaier na invasão de células SKOV3, SKOV3.ip1 e Hey células foi examinado usando o sistema Transwell. Imagens representativas são apresentadas. (B) Depois de um tratamento de 24 horas com 5 mg /ml Huaier, o número de invadir com sucesso SKOV3, SKOV3.ip1 e Hey células foi contado. Os dados são apresentados como médias ± DP. ** P . 0,01 em comparação com o controlo

Um ensaio zero foi realizada para avaliar a migração celular in vitro. Como indicado na Figura 4, o Índice de migração (correspondente a ferida capacidade de cicatrização) foi significativamente inibida em células SKOV3 tratados com Huaier durante 48 horas, em comparação com células não tratadas (23,3% versus 69,8%, p 0,01), ao passo que era semelhante em células tratada com Huaier durante 24 horas e as células não tratadas (17,5% versus 24,7%, p 0,05). No entanto, o índice de migração diminuição tão cedo quanto 24 horas depois do tratamento Huaier em células SKOV3.ip1 em comparação com células não tratadas (19,3% versus 60,6%, p 0,05). Para as células de Ei, a ferida pode quase fechada para apenas 12 horas de cura em células não tratadas, e o índice de migração foi significativamente inibida em células tratadas com Huaier simplesmente por 6 h (58,2% versus 29,1%, p . 0,01).

(a) uma área de ferida linear foi gerado em cada poço de cultura, no início, e administração de Huaier (5 mg /ml) mostrou um processo de fecho de feridas retardada em comparação com as células não tratadas. Imagens representativas das células de controle e 5 mg /células tratadas com Huaier mL foram adquiridos a 0, 12,24 h (SKOV3, SKOV3.ip1) ou 0, 6, 12 h (Hey). (B) Os índices de migração foram significativamente inibido por Huaier. As barras representam o índice de migração para cada tratamento, expressa como um valor relativo para a distância movida pela monocamada de células. Os dados são apresentados como médias ± DP. As experiências foram repetidas pelo menos três vezes. ** P 0,01 em comparação com o controle

A proliferação celular, apoptose e adesão celular ou invasão sinalizando proteínas são down-regulada por Huaier tratamento

Para investigar as vias de sinalização que pode. contribuir para efeito inibitório do Huaier na motilidade, utilizamos a análise RPPA para avaliar mudanças da proteína em células SKOV3 e SKOV3.ip1 tratados com Huaier. RPPA é uma nova tecnologia de alto rendimento que monitoriza as alterações na expressão de proteína ao longo do tempo, antes e após os tratamentos, entre doenças e estados de doença não-e entre respondedores e não-respondedores [11]. Usando RPPA, analisou-se o nível de expressão de 153 proteínas e /ou locais de fosforilação em linhas celulares de cancro do ovário Huaier-tratadas ou não tratadas com ou sem estimulação EGF. Para cada amostra, e cada um dos anticorpos, a diferença de sinal entre as células não tratadas e Huaier-tratadas foi calculada como se segue [12]: ([médio de células tratadas – os meios de células não-tratadas] /[meio de células não-tratadas]) × 100%.

dos 153 locais de fosforilação de proteínas e analisados, 7 e 10 diferiam por mais do que 30% nas condições tratadas e não tratadas nas células SKOV3 e SKOV3.ip1, respectivamente. heatmaps representativos são apresentados na Figura 5A. Em células SKOV3, o tratamento Huaier inibiu a proliferação celular e alterou os níveis de sites proteínas /fosforilação relacionados; por exemplo, diminuiu a fosforilação de HER2 em Y1248 e proteína ER níveis, mas up-regulada p53 e fosforilação Taz no S79. Em células SKOV3.ip1, proteínas mais pró-proliferativa, como ER, c-kit e fosforilada S6 (proteína quinase S6 ribossômica; fosforilada no S235-236 e S240-244) foram regulados negativamente pela Huaier. Além disso, Huaier inibiu a expressão da isoforma mais longa de Bcl (Bcl-xL) e supra-regulados a expressão de proteínas pró-apoptóticas, tais como p53 e poli clivado (ADP-ribose) polimerase (PARP_cleaved), em SKOV3.ip1 células (Figura 5B).

(a) análise de agrupamento hierárquico de quatro amostras (controle, Huaier-tratados durante 72 horas, inanição + estimulação EGF, estimulação fome + EGF + Huaier por 60 horas) em SKOV3 e SKOV3 .ip1 células de acordo com a expressão de moléculas de sinalização 16. Cluster tecla de cor: vermelho – up-regulamentada; verde – regulados para baixo; preto – inalterado. (B e C): Fold alterações na expressão ou fosforilação de várias proteínas após tratamento Huaier e adição de EGF foram analisados ​​utilizando o ensaio RPPA na SKOV3 (B) e células SKOV3.ip1 (C). Os valores relativos do grupo de controlo e os grupos de estimulação de fome + EGF foram definidos como 1,0. *:. Alteração dobra 30%

Nós também descobrimos que Huaier pode regular a adesão celular e invasão, com base em infra-regulação da fibronectina, β-catenina e caveolin-1 expressão em ambas as linhas celulares e -regulação de claudin 7 em células SKOV3.ip1 após o tratamento Huaier (Figura 5B).

o envolvimento do /mTOR /via pAKT S6 em Huaier induzida por inibição do crescimento de células de câncer de ovário

Usando o RPPA, descobrimos que ribossômica fosforilação S6 quinase foi reprimida por tratamento Huaier. S6 quinase é um alvo importante da via mTOR, e que promove o crescimento celular e proliferação. A Akt é um activador a montante da via mTOR. Por isso, foram analisados ​​os níveis de proteína de pAKT, AKT, PS6 (S235-236) e PS6 (S240-244) por western blot. Verificou-se que a fosforilação de AKT foi significativamente reduzida em células SKOV3.ip1 depois de 72 h de tratamento Huaier, com ou sem estimulação EGF. Em conformidade com a diminuição da pAKT, a fosforilação de S6 em S235-236 e S240-244 foi também sub-regulada. No entanto, em células SKOV3, a fosforilação de S6 em S235-236 e S240-244 foi regulada para baixo em células tratadas com Huaier apenas, mas não nos grupos de estimulação EGF, enquanto que pAKT foi ligeiramente aumentada nas células SKOV3-tratados Huaier. Huaier regulada para baixo a fosforilação de S6 na S240-244 em ambos os tratados Huaier apenas e grupos de estimulação EGF no Hey células. (Figura 6).

fosforilação de AKT, os níveis de Akt total, e fosforilação S6 em S235 e S240 foram medidos por transferência de Western de amostras de cada um dos quatro grupos de tratamento (controlo, Huaier-tratados durante 72 horas, inanição + EGF estimulação, a fome + EGF estimulação + Huaier por 60 horas). Os números sobre as bandas de proteína representam as mudanças de dobra, com os níveis basais nos grupos de fome + EGF controlo ou atribuído um valor de 1,0.

Huaier inibe a invasão celular através da via /β-catenina GSK3β

Uma vez que os resultados da coloração de anexina V /PI Huaier indicou que induz a apoptose e os resultados RPPA indicou ainda que várias proteínas pro- e anti-apoptóticas foram moduladas por tratamento Huaier, os nossos resultados suportam o efeito pró-apoptótico de Huaier observado em outros estudos. No entanto, a análise RPPA também mostraram que as proteínas envolvidas na adesão celular e invasão foram moduladas por tratamento Huaier (Figura 5). Isto sugere que Huaier pode ter outro efeito terapêutico importante, especialmente porque as células câncer epitelial de ovário têm uma capacidade metastática /invasiva única e, muitas vezes implantar na cavidade pélvica ou abdominal.

Entre essas proteínas, β-catenina é uma chave componente da cascata de adesão célula-célula mediada por E-caderina. Usando transferências de Western, verificou-se ainda mais as mudanças na expressão de β-catenina em SKOV3, SKOV3ip1 e Hey células. Como mostrado na Figura 7, Huaier diminuiu drasticamente a acumulação citosólica de β-catenina de uma forma dependente do tempo em células SKOV3, SKOV3.ip1 e Hey células. A expressão nuclear de β-catenina também foi diminuída. Os nossos dados indicam que não só Huaier reprime a expressão de proteínas, mas também a translocação nuclear de β-catenina.

Tanto a expressão citoplasmática e translocação nuclear do β-catenina foram significativamente inibido por tratamento Huaier. (A) células SKOV3, (B) SKOV3.ip1 e (C) Hey foram tratados com 5 mg /ml e 7,5 mg /ml Huaier para 24, 48 e 72 h. As proteínas citoplasmáticas e nucleares foram extraídas separadamente. Um western blot representativo é mostrado. Para a análise densitométrica dos níveis de β-catenina, os resultados foram normalizados para os níveis de GAPDH (para proteínas citoplasmáticas) ou histona 1 (proteínas nucleares). O nível basal para os grupos não tratados, em cada ponto de tempo foi atribuído um valor de 1,0.

Para clarificar o mecanismo fazendo com que a sub-regulação de β-catenina, avaliou-se ainda mais a expressão de GSK3β (glicogénio 3β sintase-quinase), que é conhecido por regular negativamente a via de sinalização Wnt /β-catenina clássico por fosforilação β-catenina, o que leva a sua degradação [13]. Uma vez que a fosforilação de GSK3β em S9 inibe a sua actividade e impede a segmentação de β-catenina de degradação, os lisados ​​de células inteiras foram analisados ​​para ambos total de GSK3β e GSK3β fosforilada em níveis S9 após o tratamento Huaier.