Abstract

Um número crescente de relatórios mostraram que diversos microRNAs estão envolvidos na tumorigênese e progressão tumoral. Realizamos este estudo para identificar novos miRNAs que podem estar envolvidos no câncer de pulmão e estudo sobre suas funções. Testamos a expressão de 450 miARNs em tecidos de tumor de pulmão e tecidos não-cancerosas adjacentes. Descobrimos que miARN-545 foi menos abundante nos tecidos pulmonares cancerosas do que em tecidos não-cancerosas adjacentes. Nossos estudos posteriores mostraram que miR-545 suprimiu a proliferação de células

in vitro

e

in vivo

. Nós também descobrimos que miR-545 causou interrupção do ciclo celular na fase G0 /G1 e apoptose celular induzida em células de câncer de pulmão, visando ciclina D1 e CDK4 genes. Os efeitos de ciclina D1 e CDK4 sub-regulada por miR-545 foram semelhantes aos causados ​​por ARNsi de ciclina D1 e CDK4, e a sobre-expressão de ciclina D1 e CDK4 pode abolir a inibição induzida por miR-545 de proliferação celular. Em conclusão, o miR-545 suprimiram a proliferação celular através da inibição da expressão de ciclina D1 e CDK4. Nossos resultados fornecem novos conhecimentos sobre o papel do miR-545 no desenvolvimento de cancro do pulmão e indicar o potencial de aplicação de miR-545 na terapia do cancro

Citation:. Du B, Wang Z, Zhang X, Feng S , Wang G, Ele J, et al. (2014) MicroRNA-545 suprime a proliferação celular por Segmentação de ciclina D1 e CDK4 em células de câncer de pulmão. PLoS ONE 9 (2): e88022. doi: 10.1371 /journal.pone.0088022

editor: Liang-Hu Qu, Sun Yat-sen University, China

Recebido: 12 Agosto, 2013; Aceito: 02 de janeiro de 2014; Publicação: 05 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Du et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo National Natural Science Foundation da China (No. 30870535 e 90913017), o Projeto de combinação da província de Guangdong e do Ministério da Educação (No. 2009B090300080 e 2011B090400478), o R D Programa Equipe da província de Guangdong (Sem . 201001Y0104789252) e do Programa 863 da China (No. 2012AA022501). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores têm as seguintes participações: Shipeng Feng é empregado por Guangzhou RiboBioCo, Ltd. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenos RNAs não-codificantes que são aproximadamente 22 nucleotídeos de comprimento [1], [2], e miARN pode suprimir a expressão do gene pós-transcricional por ligação para as regiões 3 ‘não traduzida (3’UTRs) de ARNm, que induz a inibição de translação ou ARNm alvo degradação [3].

Ciclina D1 e CDK4 trabalhar em conjunto no mesmo complexo para regular a transição do ciclo celular G1 /S. Estudos anteriores demonstraram que a ciclina D1 e CDK4 são mais abundantes em tecidos de tumor do pulmão que nos tecidos pulmonares normais [4], [5]. Um crescente corpo de evidências suporta um papel central para a ciclina D1 e CDK4 na promoção da proliferação de células cancerígenas. Oliver et al. relatado ciclina D1 como um “elemento central” de transformação maligna do cancro do pulmão [6]. Por conseguinte, o silenciamento ciclina D1 com oligonucleótidos anti-sentido podem inibir a proliferação de células não-pequenas de cancro do pulmão de células [7]. Estes estudos indicam que a ciclina D1 e CDK4 pode ser genes importantes para a proliferação de células de cancro de pulmão.

miARNs estão envolvidos na proliferação celular [8], diferenciação [9], e a apoptose [10], e a expressão aberrante é miARN ligada a formação e progressão tumoral [11] – [14]. Muitos estudos têm demonstrado que a miARN pode funcionar como oncogenes ou genes supressores de tumor no cancro do pulmão. Por exemplo, o agrupamento de miR-17-92 é sobre-expresso em células de cancro do pulmão e promove a proliferação de células em uma linha celular de cancro do pulmão [15]. Além disso, oligonucleotídeos antisense complementares para miR-17-5p e miR-20a, que são membros do cluster miR-17-92, pode induzir a apoptose das células [16]. No entanto, deixa-7 miARN funciona como um gene supressor de tumor no cancro do pulmão e é menos abundante em células de cancro de pulmão do que nas células pulmonares normais [17]. A sobre-expressão de let-7 suprime o crescimento de células em várias linhas celulares de cancro do pulmão e xenoenxertos em ratinhos imunodeficientes [18]. miR-34a é uma outra importante supressor de tumor miRNA. miR-34a é underexpressed em tecidos tumorais primários do cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), em comparação com tecidos normais emparelhadas [19]. Além disso o miR-34a pode inibir a proliferação de células NSCLC [20]. miR-210 é sobre-expresso nas fases tardias de NSCLC e envolvida na alteração da viabilidade celular na linha celular de adenocarcinoma do pulmão A549 [21]. nível de miR-23 é elevada no soro de doentes com NSCLC comparados com os de indivíduos saudáveis ​​[22]. Estes relatórios revelam que vários miRNAs estão envolvidos na regulação do câncer de pulmão.

O objetivo deste estudo foi identificar novos miRNAs associados com câncer de pulmão e para elucidar as suas funções. Nós utilizamos ensaios quantitativo em tempo real de reação em cadeia da polimerase (qRT-PCR) para estudar o perfil de miRNA no cancro do pulmão, e os resultados revelaram que miR-545 foi underexpressed em tecidos tumorais de pulmão em comparação com os tecidos do pulmão não-cancerosas adjacentes. Descobrimos que miR-545 suprime a proliferação de células diretamente pela segmentação ciclina genes D1 e CDK4 em linhas celulares de cancro do pulmão. Nossos resultados indicam que miR-545 funciona como um supressor tumoral no câncer de pulmão.

Resultados

miR-545 é diminuído em Pulmão humano Cancer tecidos

Nós comparamos a expressão de 450 miRNAs entre os tecidos de câncer de pulmão e tecidos do pulmão não-cancerosas adjacentes de 15 pacientes, e descobrimos que 31 miRNAs foram underexpressed (P 0,05, mudança dobra 0,5) em tecidos de câncer de pulmão em comparação com os tecidos do pulmão não-cancerosas adjacentes (Fig . S1, Tabela S1 e S2).

Para confirmar a expressão de miR-545, testou-se o miR-545 a expressão em outros 10 pacientes. Descobrimos que miR-545 níveis em tecidos de câncer de pulmão foram menores que 50% das pessoas nos tecidos pulmonares não-cancerosas adjacentes em 14 dos 25 pacientes, enquanto que miR-545 níveis em tecidos de câncer de pulmão foram mais de duas vezes os de não-adjacentes tecidos cancerosos pulmonares em dois dos 25 pacientes (Fig. 1A). A análise de múltiplos conjuntos de tecidos pulmonares não-cancerosas e cancerosas adjacentes comparáveis ​​indicou que o miR-545 foi menos abundante em tecidos de cancro do pulmão que nos tecidos adjacentes não cancerosos (Fig. 1B). Isto sugere que o miR-545 foi underexpressed em tumores do pulmão e pode funcionar como um supressor do tumor.

(a) Relativa miR-545 de expressão em 25 tecidos de tumor do cancro do pulmão e tecidos emparelhados não-cancerosas adjacentes. (B) Expressão de miR-545 em tecidos de cancro do pulmão em comparação com tecidos não-cancerosas adjacentes. 5S rRNA foi usado como um controlo interno. Os dados foram analisados ​​usando o

-ΔΔCt o método 2. *, P . 0,05 (teste de Wilcoxon)

miR-545 inibe a proliferação celular in vitro e in vivo

Para identificar miRNAs que possam estar envolvidos na proliferação celular, foi utilizado o CCK-8 kit para estudar a viabilidade de células A549 transf ectadas com cada uma das 31 miARNs. Descobrimos que as células A549 transf ectadas com miR-545 teve o menor viabilidade celular (Fig. 2).

viabilidade celular A549 foi medida por CCK-8 às 72 horas após a transfecção com cada miARN. Os dados são apresentados como a média ± S.D. a partir de três experiências independentes. NC, no-alvo de controlo; *, P 0,05; **, P . 0,01 (teste t de Student)

Para confirmar que miR-545 pode suprimir a proliferação celular, foi realizado o ensaio de viabilidade celular com três linhagens celulares. As células A549 e H460 transfectadas com o miR-545 imita apresentaram menor viabilidade celular do que as transfectadas com um controlo não-alvo (Fig 3A e 3B.); No entanto, os fibroblastos de pulmão HFL1 transfectadas com um inibidor de miR-545 exibiram uma proliferação celular mais eficiente em comparação com as transfectadas com um inibidor de controlo (Fig. 3C).

A transfecção com miR-545 imita suprime a viabilidade de (a As células A549) e (b) células H460. (C) transfecção com um inibidor de miR-545 aumenta a viabilidade das células HFL1. imagens (d) tumor do rato modelo de xenotransplante nu. (e) Volumes e (f) pesos de tumores em um modelo de rato de xenotransplante nu. Os dados são apresentados como a média ± S.D. a partir de três experiências independentes. *, P 0,05; **, P . 0,01 (teste t de Student)

A seguir, usou um modelo do rato de xenotransplante tumoral para testar o efeito de miR-545 na progressão do tumor. As células A549 foram pré-tratadas com miR-545 ou imita um controlo não-alvo e, subsequentemente, foram injectadas em ratinhos nus atímicos. O volume do tumor em ratinhos que receberam células pré-tratadas com miR-545 imita foi significativamente (P 0,05) menor do que nos ratinhos que receberam células tratadas com um controlo não-alvo. Estas diferenças no volume e peso foram observados em tumores colhidos a partir de ratinhos sacrificados no dia 48 (Fig. 3D, 3E, 3F e). Os resultados mostram que miR-545 pode inibir significativamente o crescimento de células de câncer de pulmão em um rato modelo de xenotransplante nu.

miR-545 induz a paragem do ciclo celular na fase G0 /G1 Fase

Um ensaio EdU revelou que ambas as células A549 e H460 transfectadas com o miR-545 imita incorporada EdU menos do que as transfectadas com um controlo não-alvo (Fig. 4A-C). Em contraste, as células transfectadas com o HFL1 inibidor de miR-545 incorporado mais do que EdU as transfectadas com o inibidor de controlo (Fig. 4D). Estes resultados sugerem que o miR-545 podem inibir a síntese de ADN. Para sondar adicionalmente o mecanismo de regulação (s) de miR-545, foi conduzido um ensaio do ciclo celular. Uma proporção maior de A549 e H460 transfectadas com o miR-545 imita estavam na fase G0 /G1, quando comparada com as transfectadas com um controlo não-alvo (Fig. 4E e 4F). Em contraste, uma proporção menor de células transfectadas com um HFL1 miR-545 inibidor estavam na fase G0 /G1, quando comparada com as transfectadas com um controlo de anti-inibidor de miARN (Fig. 4G). Estes resultados demonstram que o miR-545 prisões do ciclo celular na fase G0 /G1, inibindo assim a síntese de DNA e proliferação celular. Além disso, verificou-se que o miR-545 induziu a apoptose e morte celular em células A549 e H460 (Fig. 4a e 4H).

(a) EdU incorporação em células A549 medidos por microscopia confocal a laser. A transfecção com o miR-545 inibe a síntese de ADN em (b) as células A549 e (c) células H460. (D) A transfecção de células HFL1 com miR-545 inibidor aumenta a síntese de ADN. A transfecção com o miR-545 aumenta a percentagem de células na fase G0 /G1 em (E) células A549 e (f) H460 células (g), a transfecção de células HFL1 com miR-545 reduz a percentagem de células na fase G0 /G1 . miR-545 induz a apoptose em células (H) e A549 (i) H460. Os dados são apresentados como a média ± S.D. a partir de três experiências independentes. NC, no-alvo de controlo miRNA; *, P 0,05; **, P . 0,01 (teste t de Student)

miR-545 Diretamente Alvos de ciclina D1 e CDK4

Foi utilizado o software TargetScan para prever os possíveis alvos de miR-545 . Entre centenas de alvos previstos, escolhemos CASP8AP2, DDX58, ciclina D1, MAF, CDK4, e PRKCE como os alvos putativos porque eles podem ser envolvidos no ciclo celular ou apoptose. Nós clonado as 3’UTRs destes genes no plasmídeo pmirGlo e examinado se o miR-545 pode suprimir a expressão destes genes pelo ensaio de luciferase. O ensaio de luciferase mostrou que o miR-545 inibiu imita a actividade de duas construções repórter que continha o 3 ‘UTR, quer de ciclina D1 ou CDK4 (Fig. 5A). Além disso, para testar se a ciclina D1 e CDK4 são alvos directos de miR-545, que o local de ligação mutado previsto de miR-545 nas 3’UTRs de ambos os genes. Descobrimos que o miR-545 não inibiu a actividade de construções repórter que continham os 3’UTRs mutantes (Fig. 5B).

(a) o miR-545 inibiu a actividade da luciferase contendo o 3 ‘UTR de a ciclina D1 ou gene CDK4. pmirGlo plasmídeos contendo de tipo selvagem (WT) 3’UTRs do CASP8AP2, DDX58, ciclina D1, MAF, CDK4, ou gene PRKCE foram co-transfectados em células A549 com os miARN de controlo ou de miR-545. A actividade de luciferase foi medida 48 h após a transfecção. A razão normalizada da actividade da luciferase foi calculada como (Rluc

miR-545 /Luc

miR-545) /(Rluc

NC /Luc

NC). (B) o miR-545 não inibiu a actividade da luciferase de construções contendo o mutante (Mut) 3’UTR do gene de ciclina D1 ou CDK4. (C) A abundância de proteínas de ciclina D1 e CDK4 foram analisados ​​em células A549, H460, e HFL1 por transferência de Western após tratamentos de transfecção. (D) Os níveis de ciclina D1 e proteínas CDK4 foram quantificados usando software ImageJ. β-actina foi utilizado como um controlo interno. Os dados são apresentados como a média ± S.D. a partir de três experiências independentes. *, P 0,05; **, P 0,01; *** P 0,001 (teste t de Student)

Nós também examinaram a expressão da ciclina D1 endógeno e genes CDK4 em ambos os mRNA e os níveis de proteína.. Descobrimos que o miR-545 reduziu o nível de ARNm de CDK4 em células A549, mas não afectou o nível de ciclina D1 mRNA (Fig. S2). No entanto, observou-se que as células A549 e H460 transfectadas com miR-545 tinham níveis mais baixos de ambos os ciclina D1 e CDK4 proteínas do que as transfectadas com um controle sem-alvo (Fig. 5C e 5D). Além disso, as células HFL1 transfectadas com miR-545 inibidor tinham níveis mais elevados de ambos os ciclina D1 e CDK4 proteínas do que as transfectadas com inibidores da NC (Fig. 5C e 5D).

miR-545 Suprime Tumor Proliferação pela segmentação ciclina D1 CDK4 e

para examinar se o miR-545 inibe a viabilidade celular por segmentação ciclina D1 e CDK4, foram utilizados os siRNAs para inibir a expressão de genes de ciclina D1 e CDK4; os resultados foram semelhantes aos descritos acima para o miR-545. Por exemplo, o uso de siRNAs para silenciar quer a ciclina D1 ou CDK4 reduziu a viabilidade das células A549 (Fig. 6A). A supressão mediada por siARN da ciclina D1 e CDK4 genes causou a paragem do ciclo celular em G0 /G1 de fase (Fig. 6B), inibiu EdU incorporação (Fig. 6C e 6D) e a apoptose induzida em células A549 (Fig. 6E). Além disso, a sobre-expressão de ciclina D1 e /ou genes de CDK4 pode revogar significativamente a inibição induzida por miR-545 do crescimento das células A549 (Fig. 6F). Tomados em conjunto, estes resultados revelam que a ciclina D1 e CDK4 genes são alvos directos de miR-545.

(a) o miR-545 e imita a viabilidade celular A549 inibida siRNAs a 72 h após a transfecção. (B) O-ciclo celular preso na fase G0 /G1, após transfecção das células A549 com miR-545 e siRNAs segmentação ciclina D1 e CDK4. miR-545 e siRNA induziu a inibição da síntese de ADN, tal como determinado pelo ensaio de incorporação de edu utilizando (c), microscopia confocal a laser e (d) a citometria de fluxo. (E) A baixa de ciclina D1 e CDK4 induz a apoptose celular em células A549. (F) A sobre-expressão de ciclina D1 e CDK4 abole a inibição causada por miR-545. Os dados são apresentados como a média ± S.D. a partir de três experiências independentes. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001. teste t de Student foi utilizado para (a) – (e); one-way ANOVA foi utilizado para (f).

Discussão

Nosso estudo mostra que miR-545 é underexpressed em tumores de câncer de pulmão, e miR-545 foi relatado para ser underexpressed no carcinoma gástrico [23]. Além disso, o miR-545 inibe a proliferação de células de câncer de pulmão tanto

in vitro

e

in vivo

. Estes resultados indicam miR-545 pode funcionar como um supressor tumoral no câncer de pulmão.

Outras investigações revela que os genes da ciclina D1 e CDK4 são alvos diretos de miR-545. miR-545 inibe a ciclina D1 e expressão gênica CDK4 reconhecendo seqüências em suas 3’UTRs. Além disso, a sobre-expressão de ciclina D1 e CDK4 pode abolir a inibição da proliferação causada por miR-545 imita. Estes dados sugerem que o miR-545 inibe a proliferação celular pela segmentação directamente ciclina D1 e CDK4. Estudos anteriores relatam que a expressão de ciclina D1 e CDK4 em tecidos de cancro do pulmão humano é substancialmente mais elevada do que nos tecidos pulmonares normais [7], [8]. Os nossos resultados indicam que a sobre-expressão de ciclina D1 e CDK4 em tecidos de cancro do pulmão pode resultar em parte do subexpressão de miR-545.

Em conclusão, os resultados da caracterização de miARN mostram que o miR-545 é menos abundante no cancro do pulmão humano tecidos do que em tecidos do pulmão de não-cancerosas adjacentes. miR-545 inibe a proliferação de células de cancro de pulmão através da repressão da expressão de genes de ciclina D1 e CDK4. Uma melhor compreensão do miR-545 desregulação em células de câncer de pulmão contribui para a nossa compreensão dos mecanismos moleculares responsáveis ​​pelo câncer de pulmão. Além disso, o miR-545 pode ser um alvo potencial para o tratamento terapêutico do cancro do pulmão.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Nós obtido consentimento informado por escrito de todos os pacientes, e todos protocolos foram aprovados pelo Institutional Review Board do primeiro Hospital Filiado de Guangzhou Medical College. Todos os materiais humanos foram utilizados de acordo com as políticas do Conselho de Revisão Institucional. A proposta animal estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use of Guangzhou Institutos de Biomedicina e Saúde (IACUC 2.012.010). Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram realizados de acordo com as diretrizes éticas institucionais para experiências com animais.

Linhas Celulares

O pulmão humano câncer de linhas de células A549 (ATCC) e NCI-H460 (H460, ATCC) foram obtidos a partir do laboratório do Dr. Duanqing Pei no Instituto Guangzhou de Biomedicina e Saúde e foram cultivadas em meio RPMI-1640 (1640, GIBCO, NY, EUA) suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS, Hyclone, UT, EUA). A linha normal de células de fibroblastos de pulmão HFL1 foi adquirido da Academia Chinesa de Ciências Cell Bank of Type Culture Collection (CBTCCCAS, Xangai, China) e foi cultivada em meio F-12K (Jinuo, Hangzhou, China) suplementado com 10% FBS. Todas as células foram cultivadas numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2 a 37 ° C.

As amostras de tecido obtidas a partir de pacientes com carcinoma pulmonar

Ambas as amostras de tecido de pulmão não-cancerosas e cancerosas adjacentes foram obtidos do Instituto Guangzhou de doenças respiratórias, que é associado com o primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina de Cantão (Guangzhou, China). Cirurgicamente removidas amostras foram armazenadas em azoto líquido até à sua utilização. As características relevantes dos indivíduos estudados são apresentados na Tabela S3.

A transfecção

Todos os siRNAs, imita miRNA e inibidores de miRNA foram comprados de Guangzhou RiboBio (RiboBio, Guangzhou, China) e transfectados células utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Life Technologies, CA, EUA) tal como recomendado pelo fabricante. As células foram transfectadas com mímicas e inibidores de miARN a uma concentração de 50 nM. As sequências de siRNAs são como se segue: Si-ciclina D1 sentido, 5′-UGG AAU AGC UUC UGG AAU UdTdT-3 ‘, anti-sentido, 3′-dTdAA CCU UAU CGA AGA CCU UAA-5′; si-CDK4 sentido, 5’-CAG CCG AAA CGA UCA AGG AdTdT-3 ‘, antisense, 3′-dTdTG UCG GCU UUG CUA GUU CCU-5’.

Proliferação Celular Ensaio

a proliferação celular foi medida utilizando um kit de contagem de células 8 reagente (CCK-8, DOJINDO, Kyushu, Japão) ou reagente CellTiter-Glo (Promega, WI, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

EdU celular Ensaio de proliferação

a incorporação da timidina análogo 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) no ADN durante a replicação do ADN pode ser utilizada para medir a células que sofrem replicação do ADN. A porcentagem de células que incorporam EdU foi avaliada usando a imagem de células-Light EdU detectar kit seguindo as instruções do fabricante (RiboBio, Guangzhou, China).

ciclo celular Assay

As células foram colhidas 72 h após transfecção e pernoite fixa em 70% etanol gelado. Após a fixação, as células foram tratadas com 500 ng /ml de RNase A durante 30 min e em seguida coradas com 50 ng /mL de iodeto de propídio (PI) durante 20 min. As células foram quantificados utilizando células activadas por fluorescência (FACS, BD, NJ, EUA), e os dados foram analisados ​​pelo software FlowJo (ár, OR, EUA).

celular Ensaio de Apoptose

análise celular de apoptose foi realizada com o Kit de Detecção de PE Anexina V apoptose I (BD, NJ, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante, e as células foram analisadas usando FACS (BD, NJ, EUA).

ARN extracção e qRT-PCR

o ARN total foi extraído das linhas celulares e amostras de tecidos, utilizando o reagente Trizol (Invitrogen, Life Technologies, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Síntese de ADNc, utilizando M-MLV da transcriptase reversa (Promega, WI, EUA) foi realizado, tal como sugerido pelo fabricante, e iniciadores aleatórios (Takara, Shiga, Japão) foram usadas para o ARNm. Os ensaios de qRT-PCR foram realizadas utilizando o kit de SYBR Green RealMasterMix (Tiangen, Pequim, China) de acordo com as instruções do fabricante. Transcrição reversa e qRT-PCR para miRNA foram realizadas utilizando o Bulge-Loop miRNA qRT-PCR Primer Set (RiboBio, Guangzhou, China). A análise dos dados foi realizada utilizando o

-ΔΔCt método 2 [24]. Os seguintes iniciadores foram utilizados para a análise: A ciclina D1 iniciador de sentido directo, 5′-CAA ATG GAG CTG CTC CTG GTG-3 ‘, iniciador reverso, 5′-CTT TCT CGA GCT CCT AGG GGC-3′; CDK4 iniciador de sentido directo, 5’-TGC CAA CAT TTG CGT TCA CCG AG-3 ‘, iniciador reverso, 5′-TGC CCA ACT GGT CTT CGG AC-3′; actina iniciador de sentido directo, 5’-CTC CAT GGC CCT CTC GCT GT-3 ‘, iniciador reverso, 5′-GCT GTC ACC TTC ACC GTT CC-3′; e 5S rRNA iniciador directo, 5’-ACG GCC ATA CCA CCC TGA AC-3 ‘, o iniciador inverso, 5′-GGC GGT CTC CCA TCC AAG TA-3’.

plasmídeo Construção

os 3’UTRs de ciclina D1 e CDK4 genes foram clonados no plasmídeo pmirGlo (Promega, WI, EUA) entre o

Xho

I e

Xba

locais I utilizando os seguintes iniciadores: ciclina D1 de tipo selvagem iniciador directo 3’UTR, 5′-ATA TCT CGA GCA GGT GCT CCC CTG ACA GTC CCT-3 ‘, iniciador inverso, 5′-TAA TCT AGA TGG AAA CAT GCC GGT TAC ATG TTG GT-3′; CDK4 do tipo selvagem 3’UTR iniciador directo, 5’-ATA TCT CGA GGC AAT GGA GTG GCT GCC ATG GAA-3 ‘, o iniciador inverso, 5′-TAA TCT AGA TTG ACA CAG AGT CTT GCT CTG TTG CCC A-3’ .

os plasmídeos pmirGlo contendo ciclina D1 mutado ou CDK4 3’UTR foram construídos utilizando a KOD-plus mutagênese kit (Toyobo, Osaka, Japão) de acordo com as instruções do fabricante.

a leitura aberta expressão quadro vetores pReceiver_M02_cyclin D1, pReceiver_M02_CDK4, e os pReceiver_M02 vetor de controle foram adquiridos a partir do FulenGen Corporation (GeneCopoeia, MD, EUA). Todas as sequências inseridas ou mutados foram confirmadas por sequenciação.

Dual-Luciferase Assay

As células foram semeadas em placas de 96 poços um dia antes da transfecção. Os imitadores de miARN (50 nM) e o plasmídeo (5 ng /mL) foram co-transfectados em células A549. Às 48 horas após a transfecção, a actividade de luciferase foi medida utilizando o kit de Dual-Glo de ensaio de luciferase (Promega, WI, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

Western Blotting

As células foram colhidas e ressuspensas em tampão SDS (Beyotime, Xangai, China) para a preparação de extratos de proteína total. Resumidamente, o extracto de proteína total foi separada por electroforese em gel de poliacrilamida-sulfato de dodecilo de sódio a 12% e transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno de transferência Immobilon-P (Millipore, MA, EUA). A membrana foi incubada à temperatura ambiente em 5% de albumina de soro bovino (BSA), preparada com tampão de TBS-T, durante 2 h. A membrana foi incubada com anticorpo primário diluído 1:1,000 com 1% de BSA, a 4 ° C durante a noite. No dia seguinte, a membrana foi incubada com o anticorpo secundário -conjugated peroxidase de rábano (HRP), diluído 1:5,000 com 1% de BSA, a 4 ° C durante 6 h. A membrana foi visualizado após incubação no substrato de HRP (BeyoECL além de A /B, Beyotime, Xangai, China). Os anticorpos utilizados neste estudo foram anti-ciclina D1 (sc-8396, Santa Cruz, CA, EUA), anti-CDK4 (sc-260, Santa Cruz, CA, EUA), anti-β-actina (A2066, Sigma, MO, EUA), conjugado com HRP de IgG anti-ratinho (sc-2005, Santa Cruz, CA, EUA), e IgG anti-coelho conjugado com HRP (sc-2004, Santa Cruz, CA, EUA).

xenoenxertos tumorais

a 6 h após a transfecção de miR-545 imita ou controlam miARN, células A549 foram colhidas e suspensas em solução salina tamponada com fosfato a uma concentração de 1 × 10

6 células /ml e injectado em cada lado do flanco posterior da mesma ratos BALB /c atímicos nu (5-6 semanas de idade) com 100 uL de suspensão de células. O crescimento do tumor foi medido a cada 4 dias. O volume do tumor (V) foi monitorizado por medição do comprimento (L) e a largura (W) do tumor com compassos e foi calculada utilizando a fórmula V = (L x W

2) /2 [25].

Análise

estatística

os dados são apresentados como a média ± desvio padrão (SD). P 0,05 foi considerado significativo. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS 16.0 software (Chicago, IL). O teste t de Student foi utilizado para analisar a significância entre os dois grupos. Uma forma de Análise de Variância (ANOVA) foi utilizada para testar a significância entre mais do que dois grupos. A análise da expressão miRNAs em amostra clínica foi utilizado o teste de Wilcoxon.

Informações de Apoio

Figura S1. expressão

miRNA em tecidos de câncer de pulmão e tecidos não cancerosos adjacentes. As expressões de miARNs são medidos com qRT-PCR. 5S rRNA foi usado como um controlo interno. O heatmap representa o superexpressão (vermelho) e subexpressão (verde) de miRNAs. Dados em falta é representado com a cor cinza

doi:. 10.1371 /journal.pone.0088022.s001

(TIF)

Figura S2.

CDK4 e Ciclina D1 mRNAs foram medidos por qRT-PCR. β-actina foi utilizado como um controlo interno. Os dados são apresentados como a média ± S.D. *, P 0,05; **, P 0,01; *** P 0,001 (teste t de Student)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0088022.s002

(TIF)

Tabela S1. .

A expressão dos miRNAs no tecido câncer de pulmão e tecidos do pulmão não-cancerosas

doi: 10.1371 /journal.pone.0088022.s003

(DOC)

Tabela S2.

A expressão relativa de 450 miRNAs

doi:. 10.1371 /journal.pone.0088022.s004

(XLS)

Tabela S3.

As características dos pacientes com câncer de pulmão clínicos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0088022.s005

(DOC)

Reconhecimentos

Estamos gratos ao Dr. Pei Duaquing pelo dom das linhas de células A549 e H460.