Abstract

STC1 é uma glicoproteína hormonal envolvido em cálcio /fosfato (Pi) homeostase. Há evidências crescentes de que STC1 está fortemente associada ao desenvolvimento de câncer. Mas a função de STC1 no cancro não é completamente compreendido. Aqui, descobrimos que STC1 é regulada para baixo em tecidos clínicos de cancro do colo do útero em comparação com os tecidos normais adjacentes cervicais (15 casos). Posteriormente, a expressão de STC1 foi derrubado por interferência de RNA em células CaSki câncer de colo do útero e do crescimento celular promovido baixa expressão, migração e invasão. Nós também descobrimos que STC1 superexpressão inibiu a proliferação celular e invasão das células cancerosas cervicais. Além disso, a sobre-expressão STC1 sensibilizados células CaSki para drogas. Além disso, mostramos que a proteína p65 de NF-kB directamente ligado ao promotor STC1 e activada a expressão de STC1 em células de cancro do colo do útero. Assim, estes resultados forneceram evidências de que STC1 inibiu a proliferação celular e invasão através da ativação p65 NF-kB em câncer cervical

Citation:. Guo F, Li Y, Wang J, Li Y, Li Y, Li G (2013 ) Stanniocalcin1 (STC1) inibe a proliferação celular e invasão das células cancerosas do colo do útero. PLoS ONE 8 (1): e53989. doi: 10.1371 /journal.pone.0053989

editor: Soumitro Pal, do Hospital Infantil de Boston Harvard Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 18 de julho de 2012; Aceito: 05 de dezembro de 2012; Publicação: 29 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Guo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da National Natural Science Foundation da China (No. 30.672.352) e Projeto de Inovação da Pós-Graduação da Universidade Central do Sul (No. 2.340-74334000006). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Stanniocalcin1 (STC1) é uma hormona glicoproteica envolvida na cálcio /fosfato (Pi) homeostase, que foi originalmente descoberto em uma hormona secretora dos corpúsculos de Stannius, uma glândula endócrina de peixes ósseos [1]. O STC1 de mamífero é amplamente expressa em vários tecidos, incluindo coração, pulmão, fígado, supra-renal, rim, ovário, da próstata, do cólon e do baço [2] – [5]. STC1 desempenha um papel em diversos processos fisiológicos e patológicos, incluindo a gravidez, lactação, angiogénese, organogénese, o stress oxidativo, isquémia cerebral, e a apoptose [6] – [10]. A ortólogo humano da STC1 peixe foi encontrado por exibição diferencial mRNA de genes relacionados com o cancro [11]. STC1 foi originalmente clonado em uma tela de genes relacionados ao câncer. Numerosas linhas de estudos indicaram que a expressão alterada de STC1 pode ter um papel na carcinogénese e no desenvolvimento. O aumento da expressão do gene STC1 foi encontrado em hepatocelular, colo-rectal, leucemia aguda, e carcinomas de tiróide medular, no entanto, a diminuição da expressão de expressão STC1 foi encontrada no cancro da mama e cancro do ovário linhas de células [12] – [19]. Contudo, a relação entre a expressão diferencial de STC1 no tumor em comparação com o tecido normal e a sua função biológica necessita de uma investigação mais aprofundada. Alguns estudos indicaram que a expressão STC1 estava envolvido na formação da vasculatura do tumor, e pode induzir STC1 adaptativa sensível à hipoxia HIF por regulação em células de cancro humano [20], [21]. É relatado que a induzida pelo inibidor histona desacetilase apoptose celular envolve a activação STC1 [22].

Apesar de um melhor conhecimento dos STC1, é função de STC1 pouco conhecido na progressão do cancro. Neste estudo, examinou-se o papel da expressão do gene STC1 no cancro do colo do útero humano. Descobrimos que STC1 foi regulada para baixo em tecidos clínicos de cancro cervical. Posteriormente, verificou-se que STC1 baixa expressão promoveu o crescimento celular, migração e invasão. Nós também descobrimos que STC1 superexpressão inibiu a proliferação celular e invasão das células cancerosas cervicais. Além disso, a sobre-expressão STC1 sensibilizados células CaSki para drogas. Estes dados apoiaram a função pró-apoptótica de STC1. Além disso, mostramos que a proteína p65 NF-kB diretamente ligado ao promotor STC1 e ativado a expressão de STC1 em células de cancro do colo do útero.

Resultados

STC1 foi regulada para baixo em tecidos clínicos de cancro do colo do útero

Para explorar o papel da STC1 no cancro do colo do útero, foram examinados pela primeira vez o nível de expressão de mRNA em 15 pares de tecidos cervicais pareados por RT-PCR. O nível de expressão de mRNA em tecidos de cancro STC1 cervical foi diminuída em comparação com as normais adjacentes (Figura 1A e B). Em seguida, a análise imuno-histoquímica revelou que o nível de proteína de STC1 foi baixa em tecidos tumorais, e ao mesmo tempo aumentado em tecidos normais adjacentes, indicando o seu papel potencial na progressão do cancro do colo do útero (Figura 1C e D).

(A ) O nível de expressão de ARNm STC1 no canceroso (T) e normal adjacente (N), coincidiram com os tecidos do colo do útero foi analisada por RT-PCR. GAPDH serviu como um controlo de carga. graph plot (B) Box mostrou os resultados quantitativos da expressão de mRNA STC1 em todos os pares de amostras (

p Art 0,05). nível (C) Proteína de STC1 em tecidos tumorais e normais foram examinados por análise de imuno-histoquímica. tamanho Bar: 100 m. (D) Análise Quantidade de nível de expressão da proteína STC1. A intensidade da reação foi marcado usando um sistema de três camadas (

p Art 0,05). Os dados foram expressos como média ± SEM de três experiências separadas. Um valor de P . 0,05 foi considerado como significância estatística

Down-regulação da STC1 Promovido células CaSki Crescimento e invasão

Para estudar a função biológica do STC1, geramos RNAi vector contendo siRNA STC1 visando especificamente a bater de forma estável para baixo a expressão endógena de STC1 em células CaSki. Como mostrado na Figura 2A, em comparação com o controlo (CaSki /NC), as células transfectadas com ARNsi -STC1 tinha diminuído significativamente os níveis de mRNA ou proteínas STC1.

(A) Bata de baixo STC1 em células CaSki. células CaSki foram transfectadas pelo siRNA alvejando STC1, e eficiência knockdown foi demonstrado por RT-PCR e transferência de Western. Os ensaios (B) MTT mostraram que o efeito de diminuição da STC1 sobre o crescimento de células CaSki. Após um período de 7 dias, o crescimento de células CaSki /siRNA era muito mais rápido do que as células CaSki /NC (*

P

0,05). ensaio (C) A formação de colónias demonstrou o grande número de colónias de células a partir de células CaSki /siRNA em comparação com células CaSki /NC (

P

0,05). (D) para tratamento de feridas ensaios mostraram o efeito de STC1 sobre a migração de células CaSki. CaSki /células siRNA migraram mais rapidamente em comparação com células CaSki /NC (painel esquerdo). A distância de migração relativa de células CaSki foi calculada (painel da direita) (

P

0,05). tamanho Bar: 100 m. Os ensaios de invasão (E) de Matrigel mostraram o efeito de STC1 na invasão de células CaSki. O número de células CaSki /siRNA sobre a superfície do filtro foi maior do que as células CaSki /NC (painel esquerdo) (

P

0,05). O valor médio de células invadidas foi mostrado no painel direito. tamanho Bar: 100 m. (F) As curvas de crescimento dos xenoenxertos foram determinadas pelo volume do tumor (painel esquerdo) (*

P

0,05). As taxas de crescimento dos xenoenxertos foram avaliados pelo volume do tumor /dias (painel direito) (*

p Art 0,05). células CaSki /siRNA ou CaSki /NC foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus. (G) No final do período experimental, os tumores de xenoenxerto finais foram mostrados. (H) por RT-PCR analisaram a expressão de tumores de xenoenxerto em STC1 representativos. (I) Imagens representativas de inspecção histológica de tumores de xenoenxerto. As secções de tumores de xenoenxerto foram coradas com H E. tamanho da barra: 20 mm. Os dados foram expressos como média ± SEM de três experiências separadas. Os dados foram expressos como média ± SEM de três experiências separadas. Um valor de P 0,05 foi considerado como significância estatística

Em seguida, examinamos o efeito de diminuição da STC1 no crescimento celular CaSki por ensaios de MTT.. Após um período de 7 dias, o crescimento de células CaSki /siRNA era muito mais rápido do que as células CaSki /NC, e significativamente elevados números de células CaSki /siRNA foram observados a partir do dia 4 (Figura 2B). Um padrão semelhante de promover o efeito de expressão STC1 reduzida em células CaSki foi conseguida no ensaio de formação de colónias (Figura 2C). Por conseguinte, a alta actividade e um grande número de colónias de células a partir de células CaSki /siRNA demonstrado que a regulação negativa da expressão STC1 promoveu o crescimento celular in vitro.

A migração celular e invasão é importante processo de desenvolvimento do tumor e metástases. Em seguida, examinou-se o efeito de STC1 sobre a migração de células CaSki pelo ensaio ferida curando na Figura 2D. Após a incubação de células fisicamente feridos durante 48 h, as células CaSki /siRNA migraram mais rapidamente em comparação com células CaSki /NC. Uma análise mais detalhada do impacto dos STC1 em células CaSki invasão revelou que a sub-regulação de STC1 reforçada a invasão de células in vitro, determinado por ensaio de invasão de Matrigel (Figura 2E). O significativamente maior distância de migração e números grandes de células CaSki /siRNA sobre a superfície do filtro indicou que a sub-regulação de STC1 melhorada a capacidade de migração e invasão de células CaSki in vitro.

Para determinar o papel da STC1 carcinogénese e desenvolvimento de câncer cervical, CaSki /siRNA ou células CaSki /NC foram injectados subcutaneamente em ratinhos nus. O desenvolvimento do tumor foi monitorizado durante 40 dias. Tal como mostrado na Figura 2F, tumores knockdown STC1 emergido mais cedo e cresceu rapidamente em comparação com os tumores de controlo. No final do período experimental, os pesos finais do STC1 knockdown tumores (1,417 ± 0,169 g) foram encontrados para ser significativamente maior do que os controles (0,478 ± 0,115 g) (Figura 2G). RT-PCR de STC1 em tumores de xenoenxerto representativos indicados de que a diminuição da expressão STC1 tinha sido mantida ao longo do curso tempo experimental (Figura 2H). H E de tumores coloração knockdown STC1 mostrou um elevado rácio nuclear /citoplasmática, grande, e núcleos profundos-coradas em comparação com tumores de controlo (Figura 2I). Colectivamente, estes dados evidenciaram que a regulação por diminuição dos STC1 promovido in vivo desenvolvimento do tumor xenoenxerto.

A superexpressão de STC1 Proliferação e celular inibido invasão de células CaSki

Uma vez que a regulação negativa da STC1 promovidas células CaSki desenvolvimento in vitro ou in vivo, a hipótese de que pode STC1 CaSki inibiu o desenvolvimento das células. Para testar esta hipótese, as células CaSki foram transfectadas com o plasmídeo que codifica STC1. Comparando com o controlo (CaSki /NC), as células CaSki (/STC1) transfectadas com o plasmídeo que codifica STC1 tinham aumentado os níveis de ARNm ou proteína STC1 (Figura 3A). ensaios MTT mostrou que o crescimento de células CaSki /STC1 foi muito mais lenta do que as células CaSki /NC (Figura 3B). ensaio de formação de colónias mostrou que uma pequena quantidade de colónias de células a partir de células /STC1 CaSki demonstrado uma baixa actividade (Figura 3C). ensaio de invasão de Matrigel revelou que a sobre-regulação de STC1 atenuado a invasão de células in vitro (Figura 3D).

(A) A sobre-expressão de STC1 em células CaSki. STC1 vector de expressão foi transfectado em células CaSki, e aumento da expressão de STC1 foi demonstrado por RT-PCR e transferência de Western. Os ensaios (B) MTT mostrou que o crescimento de células CaSki /STC1 foi muito mais lenta do que as células CaSki /NC (*

P

0,05). ensaio de formação (C) Colony mostrou que uma pequena quantidade de colónias de células a partir de células /STC1 CaSki demonstrado uma baixa actividade (

P

0,05). ensaio de invasão (D) Matrigel revelou que a sobre-regulação de STC1 atenuado a invasão de células in vitro. tamanho Bar: 100 m. (E) STC1 overexpressed tumores surgiram mais tarde e cresceu lentamente em comparação com tumores de controlo (*

P

0,05). (F) No final do período experimental, os pesos finais dos tumores STC1 sobre-expresso foram encontrados para ser mais baixa do que os controlos. (L) por RT-PCR de STC1 em tumores de xenoenxerto indicaram que o aumento de expressão STC1 tinha sido mantida ao longo do curso tempo experimental. (H) H E de tumores coloração STC1 overexpressed mostrou uma baixa razão núcleo /citoplasmática, e limitada para os ninhos cancro, em comparação com tumores de controlo. tamanho da barra: 20 mm. Os dados foram expressos como média ± SEM de três experiências separadas. Um valor de P 0,05 foi considerado como significância estatística

células

Em seguida, CaSki /STC1 ou CaSki /NC foram injectados subcutaneamente em ratinhos nus.. STC1 overexpressed tumores surgiram mais tarde e cresceu lentamente em comparação com os tumores de controlo (Figura 3E). No final do período experimental, os pesos finais do STC1 overexpressed tumores (0,285 ± 0,057 g) foram menores do que os controles (0,523 ± 0,154 g) (Figura 3F). RT-PCR de STC1 em tumores de xenoenxerto indicaram que o aumento de expressão STC1 tinha sido mantida ao longo do curso tempo experimental (Figura 3G). H E coloração de tumores STC1 overexpressed mostrou uma baixa relação nuclear /citoplasmático, e limitada aos ninhos cancro, em comparação com tumores de controlo (Figura 3H). Colectivamente, estes dados sugerem que a sobre-regulação de STC1 inibiu a proliferação celular e a invasão de células CaSki in vitro ou in vivo.

STC1 sensibilizado CaSki células para Drugs

Os resultados anteriores mostraram que podem inibir STC1 proliferação celular de células CaSki. A cisplatina, tapsigargina e rapamicina são fármacos associados com as células de crescimento e a apoptose. Baseada em cisplatina quimioterapia de combinação tem sido comumente usado na terapia de tumores, incluindo o câncer cervical [23]. Tapsigargina como um agente apoptótico pode exibem eficazmente um tumor de controlo com base na capacidade de inibir a bomba de cálcio sarco- /endoplasmtic intracelular [24], [25]. O alvo da rapamicina em mamíferos é uma proteína quinase serina /treonina da via de sinalização de PI3K /AKT que desempenha um papel crítico no controle do crescimento celular do cancro, o metabolismo e a progressão do ciclo celular [26]. Em seguida, as células CaSki foram tratados com com ou sem cisplatina (0, 1, 2, e 3 mg /L), tapsigargina (0, 1, 3, 6, e 9? M), ou rapamicina (0, 0,01, 0,1, 0,5 , e 1 mg /L) durante 96 h ou 72 h, a remoção de aliquotas a cada 24 h, para se avaliar a viabilidade celular. Verificou-se que o crescimento de células CaSki foi lento, com o aumento do tempo e da concentração da droga (Figura 4A-C). Para determinar se a expressão aumentada de STC1 retardado o crescimento de células induzida por drogas, CaSki /STC1 ou CaSki /NC foram tratadas com diferentes medicamentos, tais como a cisplatina, tapsigargina e rapamicina. O crescimento de células /STC1 CaSki foi mais lento com o aumento de tempo em comparação com células CaSki /NC quando as células foram tratadas com cisplatina, ou tapsigargina rapamicina (Fig. 4D-F). Estes dados demonstram que a sobre-expressão de STC1 aumentada a sensibilidade de células CaSki para drogas.

(A) Efeito da cisplatina em células CaSki crescimento. células CaSki foram tratados com cisplatina com ou sem (0, 1, 2, e 3 mg /L) durante 96 h, a remoção de aliquotas a cada 24 h, para se avaliar a viabilidade celular. (B) Efeito de tapsigargina em células CaSki crescimento. células CaSki foram tratados com ou sem com tapsigargina (0, 1, 3, 6, 9 e? M) durante 72 h, a remoção de aliquotas a cada 24 h, para se avaliar a viabilidade celular. (C) Efeito de rapamicina em células CaSki crescimento. células CaSki foram tratados com rapamicina com ou sem (0, 0,01, 0,1, 0,5, e 1 mg /L) durante 72 h, a remoção de aliquotas a cada 24 h, para se avaliar a viabilidade celular. células CaSki (D) STC1 sensibilizados a cisplatina. células CaSki /STC1 ou CaSki /NC foram tratados com cisplatina (2 mg /L) durante 96 h. ensaios MTT detectado o crescimento celular de CaSki /STC1 ou células CaSki /NC em face de cisplatina (*

p Art 0,05). células (E) STC1 sensibilizado CaSki para tapsigargina. células CaSki /STC1 ou CaSki /NC foram tratados com tapsigargina (3 uM) durante 72 h. ensaios MTT detectado o crescimento celular de CaSki /STC1 ou células CaSki /NC em face da thapsigargin (*

p Art 0,05). (F) STC1 sensibilizados células CaSki para rapamicina. células CaSki /STC1 ou CaSki /NC foram tratados com rapamicina (0,5 mg /L) durante 72 h. ensaios MTT detectado o crescimento celular de CaSki /STC1 ou células CaSki /NC em face da rapamicina (*

p Art 0,05). Os dados foram expressos como média ± SEM de três experiências separadas. Um valor de P . 0,05 foi considerado como significância estatística

A ligação directa de NF-kB p65 Proteína para STC1 Promotor Região em células de câncer cervical e regulada a expressão de STC1

A factor nuclear kappa B (NF-kB) da família de factores de transcrição regula a expressão de muitos genes, incluindo genes de proliferação e invasão. NF-kB via desempenha um papel central em cancros e doenças cardiovasculares. O promotor de STC1 contém múltiplos locais de ligação de p65 de NF-kB [27]. Para começar a explorar ainda mais os mecanismos entre a correlação de STC1 e p65, os locais de ligação foram testados em células CaSki por coimmunoprecipitation cromatina. O site (-GGGACAAACC-) foi encontrada para se ligar a p65 de NF-kB (Fig. 5A). Para determinar se a expressão em células CaSki STC1 foi correlacionada com a NF-kB, a actividade de NF-kB foi detectado. Acompanhando com o aumento da actividade da PARP e caspase-3, a actividade de p65 de NF-kB e STC1 também aumentou quando as células CaSki foram tratados com tapsigargina (Fig. 5B). TNF activa as vias de apoptose após a indução simultânea de NF-kB. Para determinar se a expressão de STC1 aumento semelhante na apoptose induzida por TNFa, as células CaSki foram tratados com o tempo de aumento de TNFa. A expressão de p65 de NF-kB e aumentou a actividade de STC1 e caspase-3 aumentada em resposta a TNF (Fig. 5C). Ditiocarbamato de pirrolidina (PDTC) é um inibidor eficaz da activação do NF-kB e de NF-kB suprime a transcrição dependente de pró-inflamatórios em citocinas e quimiocinas [28]. Quando as células CaSki foram tratadas com PDTC, a actividade da p65 de NF-kB e diminuiu a expressão de STC1 regulada negativamente com o tempo de PDTC (Fig. 5D) aumentando. Além disso, após o knockdown de p65 foi realizada por transfecção siRNA alvejando p65 de NF-kB, a expressão de p65 e subcelular STC1 em células CaSki foi analisado (Figura 5E). A expressão de p65 em citoplasma e núcleo tanto diminuiu, e enquanto o núcleo em uma significativamente reduzida. A expressão STC1 down-regulação no núcleo também foi encontrado após o knockdown de p65. O knockdown de p65 causou a expressão de p65 e STC1 tanto diminuindo ao nível de ARNm (Figura 5F).

(A) Os locais de ligação de STC1 foram testadas em células CaSki por coimmunoprecipitation cromatina. O local foi encontrado para se ligar a p65 NFkB. (B) Western blotting detectada a actividade da PARP, caspase-3, p65 STC1, e de NF-kB em células CaSki. células CaSki foram tratados com tapsigargina (3 uM) durante 12 h. (C) transferência de Western detectou a actividade de p65, STC1, e caspase-3 em células CaSki. células CaSki foram tratados com o tempo de TNFa (10 mg /L), aumentando para 2,5 h. (D) transferência de Western detectou a actividade de p65 e STC1 em células CaSki. células CaSki foram tratadas com PDTC (10 uM) durante 60 min. (E) A actividade de p65 e subcelular STC1 em células CaSki foi analisada por Western blotting. células CaSki foram tratadas com siRNA knockdown de p65 por 72 h. (F) A expressão de p65 e em STC1 CaSki foi detectada por RT-PCR no nível de ARNm. células CaSki foram tratadas com siRNA knockdown de p65 por 48 h. (G) Representação esquemática de alguns achados neste trabalho.

Discussão

Há evidências crescentes de que STC1 está fortemente associada ao desenvolvimento de câncer. Mas a expressão de STC1 variaram em diferentes tecidos e mesmo para o mesmo tecido em nível diferente (mRNA ou proteínas), e, por conseguinte, a função de STC1 pode mostrar a diferença [29]. Neste estudo, descobrimos que STC1 inibiu a proliferação celular e invasão das células cancerosas cervicais. STC1 é regulada para baixo em tecidos clínicos de cancro do colo do útero, o que indicava STC1 está envolvida na progressão de cancro cervical. No cancro do colo do útero, a baixa expressão da STC1 pode causar o desenvolvimento do tumor. Posteriormente, verificou-se que STC1 baixa expressão promoveu o crescimento celular, migração e invasão após o down-regulação da STC1 por interferência de RNA em células de cancro do colo do útero. Além disso, também descobrimos que STC1 superexpressão inibiu a proliferação celular e invasão das células cancerosas cervicais. Além disso, a sobre-expressão STC1 sensibilizados células CaSki para drogas. Estes dados suportam a opção que STC1 pode inibir a progressão do tumor para o cancro do colo do útero. A perda da função de STC1, que inibem o crescimento e invasão de células de tumor, pode levar à progressão do tumor no cancro do colo do útero.

O promotor do gene STC1 contém HIF e sítio de ligação de NF-kB. É relatado que o HIF-1α ligado ao promotor do gene p300 STC1 e foi necessário para uma interacção produtiva com HIF-1 e a sobre-regulação de ARNm e a expressão da proteína STC1 [30]. Chen et al pensou que STC1 bloqueou parcialmente a activação de NF-kB em células de TNF-a humano tratado com endoteliais de artérias coronárias [31]. Lei et al relataram que histonas hiper-acetilação e do recrutamento de NFkB estimulada activado a expressão do gene em células HT29 STC1 [22]. A relação entre STC1 e NF-kB é diferente em diferentes tipos de tecidos. Nós mostramos que a proteína p65 NF-kB diretamente ligado ao promotor STC1 e regulada a expressão de STC1 em células de cancro do colo do útero. Estes resultados têm implicações clínicas potenciais. Nossos resultados sugerem que o aumento da expressão de STC1 deve ser uma boa estratégia para inibir a proliferação do tumor e invasão e também pode ser um tratamento combinado viável com medicamentos quimioterápicos em câncer cervical.

De cima desses resultados, apresentamos o modelo para a inibição mediada por STC1 de progressão tumoral (Figura 5): Após a activação da p65 de NF-kB, a expressão aumentada STC1. A expressão STC1 elevada redução da progressão do tumor, e, consequentemente, a sensibilidade das células de cancro cervical com a expressão STC1 elevada para a droga de quimioterapia aumentou. Assim, mais estudos são para elucidar profundamente os mecanismos envolvidos na inibição STC1 mediada da progressão do tumor e para continuar a explorar o que as outras moléculas de participar na progressão.

Materiais e Métodos

Amostras e imuno-histoquímica

Casos de câncer de colo do útero e tecidos normais adjacentes foram obtidos em protocolos aprovados pelo Hospital secundário Xiangya da Universidade Central do Sul. características clínico-patológicas de 15 pacientes com câncer cervical foram apresentados na Tabela S1. As secções de parafina foram desparafinados com xileno e re-hidratadas em álcool graduado. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada através da incubação em peróxido de hidrogénio a 3% à TA durante 10 min. A ligação não específica foi bloqueada com PBST contendo soro de cabra a 10% durante 2 h a TA. anticorpo STC1 (Santa Cruz Biotechnology) foi adicionado a cada lâmina e incubaram-se a 4 ° C durante a noite. Após três lavagens, as lâminas foram incubadas com Envision (DAKO) durante 40 min à TA. Diaminobenzidina foi utilizada como um cromogénio. As secções foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas, e montado. Avaliação de lâminas de imunohistoquímica foi feito com um microscópio Nikon Eclipse E800 a 200 × ampliação. A intensidade da reação foi marcado usando um sistema de três camadas: 0-3 (0 = nenhuma coloração, 3 = 100% da coloração). A pontuação imunorreactiva da amostra foi determinada pela percentagem de células positivas. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Xiangya School of Medicine, Centro Universitário do Sul de Ética.

transcrição reversa-PCR (RT-PCR)

RNA isolado a partir de tecidos e células foi inversamente transcritas e amplificada utilizando o Sistema de ONE-STEP transcrição reversa-PCR (Fermentas). As sequências dos iniciadores usados ​​foram apresentados na Tabela S2. Após aquecimento a 95 ° C durante 1 min, PCRs foram expostos a 30 ciclos (GAPDH, 25 ciclos) a 95 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, e 68 ° C durante 1 min 30 s, com uma extensão final a 68 ° C durante 10 min. O valor de densidade integrada (IDV) de cada banda foi avaliada usando Gel-Pro Analyzer Imagem (Bio-Rad, Hercules, Califórnia), e as proporções dos valores IDV foram calculados para avaliar os níveis de expressão relativa de ARNm.

Cultura celular

CaSki células de cancro cervical humano foram mantidas por nosso laboratório e cultivadas em meio Eagle Dulbecco modificado (DMEM; Gibco) suplementado com 10% de soro de vitelo (BCS) (Gibco). As células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera de ar humidificado com 5% de CO2.

Vector Construção e transfecção celular

Para derrubar expressão STC1, usamos pRNAT-U6.1 /Neo vector que codifica um pequeno ARN em gancho dirigidos contra o gene alvo em células CaSki. As sequências alvo para STC1 foram 5′-TTAGTCCAGGAAGCAATAGTA -3 ‘(CaSki /siRNA). Utilizou-se controlo negativo universal como um controlo negativo (CaSki /NC).

Para a transfecção do plasmídeo de expressão humana STC1 vector que codifica a sequência de ADN contendo a grelha de leitura aberta STC1 flanqueada por locais de restrição HindIII-XhoI foi amplificado por PCR a partir de células CaSki. As sequências dos iniciadores utilizados foram 5′-sentido GAAAGCTTATGCTCCAAAACTCAG -3 ‘e anti-sentido 5′-ATGG TTCTCGAGTTATGCACTCTC -3’. O fragmento resultante foi inserido HindIII /Xhol -precut pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) para gerar pcDNA3.1- STC1. A sequência desejada foi confirmada por sequenciação directa de ADN.

Para a transfecção, as células de cancro cervical foram cultivadas até 70% de confluência e transfectadas em meio isento de soro durante 6 h, com Lipofectamine 2000 (Invitrogen) e o vector. Após 48 h, as células foram colhidas, seguido por diluição limite em placas de 96 cavidades para a geração de clones de células individuais. Três semanas mais tarde, os níveis de expressão STC1 em clones de células que tinham sido infectadas com vectores, foram caracterizados para a proteína e ARNm STC1.

MTT e Formação de Colónias

ensaio de MTT foi realizado como relatado anteriormente [32]. Para o ensaio de formação de colónias, as células a 100 células por poço em placas de 60 mm foram cultivadas em DMEM 10% de FBS a 37 ° C, CO2 a 5% durante 3 semanas. As colónias de células foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas em 4% de paraformaldeído durante 15 minutos e coradas com Gimsa durante 30 min. Os clones individuais com mais de 50 células foram contadas. Clone eficiência formando para o tipo individual de células foi calculado, de acordo com o número de colónias /número de células inoculadas × 100%.

monocamada cicatrização de feridas e Invasão Ensaios

ensaio

Para monocamada cicatrização de feridas, As células foram cultivadas em DMEM 10% de FBS em placas de 60 mm. Depois de as células atingirem sub-confluência, as células em monocamada foram feridos por raspagem das células e, em seguida, cultivadas em meio durante 48 h. A distância migrada de células CaSki foi monitorizada e fotografada sob um microscópio. As distâncias de migração de células foram calculadas subtraindo a distância entre as bordas da lesão em 48 horas a partir da distância medida às 0 h. A distância de migração relativa das células é medida pela distância de migração de células /a distância medida a 0 h. Para o ensaio de invasão, as células em 10

4 /poço foram semeadas em câmaras superiores em DMEM de 200 mL de FBS e os poços livre inferior foi preenchida com 500 ul de DMEM FBS a 10% para a indução de migração celular. Após a incubação durante 24 h, as células na superfície do filtro foram fixadas com formaldeído a 4%, coradas com 0,5% de violeta de cristal, e examinadas com um microscópio. As células em, pelo menos, seis campos aleatórios (200 ×) foram contadas.

Análise Western Blot

As células foram lavadas com soro fisiológico tamponado com fosfato frio (PBS) e lisaram-se em tampão de Laemmli (62,5 Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% de glicerol, ditiotreitol 50 mM, e 0,01% de azul de bromofenol) durante 5 min a 95 ° C. Os lisados ​​celulares foram analisados ​​por SDS /PAGE e transferidas electroforeticamente para uma membrana de difluoreto de polivinilideno. As manchas foram sondadas com anticorpos específicos por um passo de detecção secundária. As proteínas imunorreactivas foram reveladas por um kit ECL. Western blot foi efectuada utilizando os seguintes anticorpos: de coelho anti STC1-anticorpo (Santa Cruz Biotechnology), anticorpo p65 anti-fosfo-NF-kB de coelho (Cell Signaling Technology), anticorpo de coelho anti-PARP (Cell Signaling Technology), de coelho anti foi examinado -Caspase-3 anticorpo (Cell Signaling Technology).

In vivo tumor Crescimento Ensaio

a influência do STC1 sobre o desenvolvimento do tumor de carcinoma cervical in vivo. Células a 5 × 10

6 por rato foram injetados /c ratos pelados subcutaneamente em 4 semanas de idade Balb (n = 4 por grupo, Xangai Laboratory animal Center, Xangai, China). Os pares experimentais foram realizadas em ratinhos diferentes. O desenvolvimento e o crescimento de tumores sólidos foram monitorados através da medição do tamanho do tumor utilizando um calibrador vernier de forma cega a cada cinco dias, num período de 40 dias. O volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula: volume do tumor (mm

3) = Largura (mm)

2 × comprimento (mm) 0,5 × [33]. No final da experiência, todos os ratinhos foram sacrificados e os pesos de tumor individuais foram medidos usando um balanceador.

Cromatina imunoprecipitação

Ensaios Ensaio ChIP

foi realizada utilizando o kit de ensaio de ChIP de acordo com as instruções do fabricante (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) e o anticorpo contra p65 de NF-kB (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA). iniciadores cromatina imunoprecipitação foram concebidos para amplificar um fragmento contendo o promotor STC1. As sequências dos iniciadores utilizados foram apresentados na Tabela S2.

Análise Estatística

Os dados foram expressos como média ± SEM. A diferença entre grupos foi determinada por análise ANOVA e comparação de dois grupos foi analisada pelo teste t de Student, utilizando o software GraphPad Prism Versão 4.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Um valor de P 0,05 foi considerado como significância estatística

Informações de Apoio

Tabela S1..

características clínico-patológicas de 15 pacientes com câncer cervical.

doi: 10.1371 /journal.pone.0053989.s001

(DOC)

Tabela S2.

Primer para RT-PCR.

doi: 10.1371 /journal.pone.0053989.s002

(DOC)