Abstract

contas metástase hematogênica para a maioria das mortes relacionadas com o cancro, mas o mecanismo ainda não está claro. Que circulam células tumorais (CTCs) no sangue pode empregar caminhos diferentes para atravessar a barreira endotelial arterial e estabelecer um nicho metastático. Vários estudos proporcionam evidência de que o cancro da próstata (CaP) amarrar célula e rolando sobre o endotélio microvascular através de interacções de ligandos de selectina-E /E-selectina sob fluxo de cisalhamento teoricamente promover o extravasamento e contribuir para o desenvolvimento de metástases. No entanto, não se sabe se a partir de pacientes com CaP CTC interagir com E-selectina expressa no endotélio, iniciando uma rota de metástases tumorais. Aqui mostramos que CTC derivadas de pacientes com CaP apresentou interacções com E-selectina e E-selectina expressa células endoteliais. Para examinar interacções E-selectin-mediada de linhas de células APC e CTC derivadas de pacientes com CaP metastáticos, usamos fluorescentemente marcado com antigénio de membrana (PSMA) J591-488 anticorpo anti-específico da próstata monoclonal que é internalizada a seguir à ligação da superfície celular. Nós empregamos um dispositivo de fluxo microescala que consiste em microtubos E-revestido-selectina e células humanas endoteliais da veia umbilical (HUVECs) na câmara de fluxo de placas paralelas simulando endotélio vascular. Observamos que J591-488 não alterou significativamente o comportamento evolutivo em células CaP em tensões de cisalhamento abaixo de 3 dyn /cm

2. CTC obtidos a partir de 31 amostras de pacientes com CaP CTC mostrou que o tirante e interagir de forma estável com a E-selectina e E-selectina em HUVEC expressando shear stress fisiológico. Curiosamente, as amostras recolhidas durante a progressão da doença demonstraram significativamente mais interações CTC /E-selectina do que amostras durante os tempos de resposta terapêutica (

p

= 0,016). Análise da expressão do sialil-Lewis X (SLE

X) em amostras de doentes mostrou que um pequeno subconjunto compreendendo 1,9-18,8% de CTC possuem alta SLE

x expressão. Além disso, as interacções de E-selectina-mediada entre CTC próstata e células HUVEC foram diminuída na presença de anticorpo neutralizante anti-E-selectina. interações CTC-endoteliais fornecer uma visão romance em potenciais mecanismos adesivas de CTCs de próstata como um meio para iniciar a metástase

Citation:. Gakhar G, Navarro VN, Jurish M, Lee GY, Tagawa ST, Akhtar NH, et al . (2013) de circulação células tumorais do cancro da próstata Os pacientes Interagir com E-selectina sob fluxo de Sangue fisiológica. PLoS ONE 8 (12): e85143. doi: 10.1371 /journal.pone.0085143

editor: Kjetil Tasken, da Universidade de Oslo, Noruega |

Recebido: 27 de agosto de 2013; Aceito: 23 de novembro de 2013; Publicação: 27 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Gakhar et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do treinamento de pós-doutorado do Departamento de Cancer Research Program Defesa da próstata (W81XWH-12-1-0124, a G. Gakhar); U54CA143876 do Instituto Nacional do Câncer (para D.M. Nanus e M. R. King); David H. Koch Foundation e Robert Dow Foundation (para N.H. Bander); National Science Foundation Graduate Research Fellowship (a Y. Geng); do NIH EUA (R01 CA137020-01, a P. Giannakakou); O Charles H. Leach, II Foundation, eo McCooey Genitourinary Fund Research Oncologia Robert H.; da Clínica Translational Science Center, Centro Nacional para a Promoção da Ciência Translacional (UL1-TR000457-06, a PJ Christos). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos. NHB é um inventor nas patentes relacionadas com o anticorpo J591 utilizada neste estudo (ver por favor o ficheiro attachment- Bander_J591Patent). Estas patentes são atribuídos a Cornell. Dr. Bander é consultor e mantém a equidade na Bzl Biologics, a empresa à qual as patentes foram licenciadas pela CRF para novas pesquisas e desenvolvimento. MS é uma co-inventor no seguinte patente que cubra o uso de células endoteliais E4ORF1 (células endoteliais Expressando Adenovirus E4ORF1 e métodos da sua utilização, Patente EUA # 8465732). Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O desenvolvimento de metástases é a hipótese de iniciar por meio de mecanismos semelhantes às usadas pelos leucócitos para adesão e transmigração através endotélio sangue [1]. A cascata recrutamento de leucócitos ao endotélio durante a inflamação envolve etapas sequenciais, incluindo tethering, rolamento, aderência, e, finalmente, a transmigração. O passo inicial de amarração e de rolamento ocorre através de interacções dinâmicas e transientes entre selectinas expressas por células endoteliais (ECS) e os seus respectivos ligandos presentes em leucócitos durante o fluxo de sangue que causam quebra contínua e formação de ligações de receptor-ligando. Este ciclo leva ao comportamento de rolamento característica dos leucócitos [2]. Nos seres humanos, a E-selectina foi demonstrado ser a principal responsável pela laminagem mediada por selectina e amarrar [3].

Numerosos estudos utilizando linhas de células de tumor e modelos de ratos sugerem que endotelial (E) -selectin está também envolvido na adesão de células tumorais, a migração e o desenvolvimento de metástases [4,5].

In vivo

modelos de ratos têm mostrado que a E-selectina promove metástases [6] e redireciona metástases para o fígado [7]. A cimetidina, que inibe a indução da expressão de E-selectina, diminuiu significativamente a metástase do fígado de células HT-29 do cancro do cólon num modelo rato atímico sem afectar o tumor primário [8]. Além disso, ratinhos deficientes em E- e P-selectina injectados com HT-29 células tumorais mostraram uma diminuição significativa no número de metástases do pulmão em comparação com ratinhos de tipo selvagem [9].

A ligação entre a E-selectina e metástase conduziu a diversos estudos que caracterizam ligandos de selectina na superfície de células de tumor. ligandos de selectina são glicoproteínas específicas, que se tornam funcional após modificação pós-tradução por glicosiltransferases e sulfotransferases. A presença de sialil-Lewis X (SLE

x) e sialil-Lewis um (SLE

a), epítopos de hidratos de carbono de ligantes selectina [10,11] é frequentemente associada com a progressão do câncer e de prognóstico reservado [12,13 ]. Os estudos também sugerem que o tropismo das células APC, para o osso é atribuído às interacções entre a E-selectina expressa em células endoteliais de medula óssea (ECS) e ligandos de E-selectina na presente CaP células [14].

O provas que implicam a função da E-selectina e os seus ligandos em metástase de tumor são derivados a partir de estudos utilizando linhas de células de tumor, mas nunca foram confirmados em células tumorais (CTCs) derivadas de pacientes de circulação. Relatamos aqui, usando

ex vivo

condições que CTCs isoladas de homens com câncer de próstata resistente à castração (CRPC) demonstram interações físicas, predominantemente adesão tethering e firme, com superfícies E-revestido-selectina e E-selectina expressando ECs durante o fluxo de sangue fisiológico. Além disso, as interações CTC /E-selectina mostrou uma correlação significativa com a resposta clínica dos pacientes à terapia. Estas interacções foram diminuída na presença de anticorpo neutralizante anti-E-selectina. Além disso, encontramos expressão variável do LES

x em CTCs, sugerindo que provavelmente não todos os CTCs contribuir para metástases.

Materiais e Métodos

As linhas celulares

PC3, C4-2, LNCaP, CaP MDA 2b (MDA), e KGI células são de ATCC (Manassas, VA, EUA ). CaP linhas celulares PC3, C4-2, e LNCaP foram mantidas em meio RPMI suplementado com FBS a 10%, e MDA CaP 2b (MDA) foi mantida em meio F-12K suplementado com 20% de soro fetal de bovino (FBS), 10 ng /mL EGF, 0,005 mg /ml de insulina, 100 pg /ml de hidrocortisona, 25 ng /ml de toxina da cólera, ácido selenioso 45 nM, e fosfoetanolamina 0,005 mM. células KG1 (linha celular de leucemia mielóide aguda) foram cultivados em meio IMDM suplementado com 20% FBS.

Declaração de Ética e amostra do doente coleção

Sob um Weill Cornell Medical College Institutional Review Board (IRB) protocolo aprovado, 31 amostras de sangue periférico foram obtidas de pacientes com CRPC e 10 amostras de sangue periférico foram retirados de doadores saudáveis ​​após consentimento informado por escrito. O sangue foi obtido em ambos os tubos de Ficoll-Paque (7,5 ml de sangue de cada) ou BD tubos Vacutainer (2,7 ml de sangue de cada; Becton-Dickinson) contendo 2,3% de citrato de sódio anticoagulante. foi obtida a informação clínica de-identificados. Determinação do estado do tumor (evolução clínica ou resposta clínica) foi determinada por 2 médicos independentes usando critérios padronizados.

Labeling Superfície com anti-PSMA anticorpo monoclonal J591

células MDA foram tripsinizadas, centrifugadas e incubadas em solução salina equilibrada de Hank (HBSS) /HEPES 10 mM /CaCl2

2 /0,5% de albumina de soro humano (tampão I). O anticorpo monoclonal J591 [15], que reconhece o domínio externo de antigénio específico da próstata membrana (PSMA) conjugado com Alexa Fluor-488 (J591-488) foi adicionado a células MDA e PC3 (isoladamente e células cravado no sangue normal e saudável) a 20 ug /ml durante 30 minutos à temperatura ambiente num agitador rotativo, centrifugou-se a 1500 rpm durante 5 min e o sedimento ressuspenso em meio RPMI. As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) isoladas a partir de sangue normal, saudável por centrifugação de densidade de Ficoll-base foram processados ​​de forma semelhante, e colocada sobre BD célula-Tak (BD Biosciences, San Jose, CA) lamelas revestidas por citocentrifugação. PBMC foram fixadas usando 2% de formaldeído (Tousimis, Rockville, MD) e coradas com anticorpo de CD45 anti-rato (1: 200, clone 2D1, BD Pharmingen, San Jose, CA), lavadas com PBS e incubadas com anticorpo de cabra anti-rato Alexa fluor (AF) -594 anticorpo secundário, lavados e contrastadas com DAPI.

enriquecimento de CTCs por anti-CD45 talão imunomagn�ica esgotamento

para enriquecer para CTCs, PBMCs isoladas de sangue periférico por Ficoll densidade centrifugação baseado foram submetidos a seleção negativa para leucócitos utilizando anti-CD45 esferas imunomagnéticas (Life Technologies, Grand Island, NY). As PBMC foram lavadas duas vezes com 2% de RPMI /4 mM MgCl

2/1 mM de CaCl

tampão 2 (tampão II) e incubadas com esferas imunomagnéticas-CD45 anti pré-lavado em 1 ml de tampão de I durante 20 min num agitador rotativo. Após a incubação, 35 ml de tampão de I foi adicionado e as células foram mantidas em um íman durante 10 min a 4 ° C. As células foram centrifugadas a 400 g durante 12 min e o anticorpo anti-PSMA J591-488 foi adicionada durante 40 min, centrifugadas e ressuspensas em tampão I e os ensaios foram realizados de rolamento. Para imunocoloração experiências, seguindo anti-CD45 depleção imunomagnética, as células foram ressuspensas em 500 ul de 2% de meio RPMI e cytospun em lâminas de vidro carregadas positivamente (Thermo Scientific, Asheville, NC). As lâminas foram armazenadas a -20 ° C para a imunocoloração subsequente.

fluxo baseado em Microtube Ensaio

Resumidamente, estéril 50 cm de comprimento de ‘D’ tubos microrenathane 300 mm (Braintree Scientific, MA) foram incubadas com 10 mg /mL de solução de proteína-G, durante 1,5 h, seguido por uma 2 horas de incubação com 10 ng /mL de recombinante de IgG de e-selectina humana [16] (R D Systems, Minneapolis, MN) e bloqueadas com 5% de leite durante 1 h. Todas as incubações foram realizadas à temperatura ambiente. Os tubos de controlo foram ou não incubada com E-selectina ou incubadas com 10 ug /ml de IgG recombinante L-selectina humana (R D Systems, Minneapolis, MN). microtubos revestidos foram montadas num microscópio invertido equipado com uma câmera Zeiss AxioCam MRM. Uma bomba de seringa (KDS 230, IITC Life Science, Woodland Hills, CA) foi utilizado para controlar a tensão de cisalhamento da suspensão de células. Uma concentração conhecida de 1 x 10

6 não marcado ou marcado J591-488 células MDA diluídos em tampão I foi perfundido através da superfície a uma tensão de corte de 0,5 dine /cm

2 durante 3 min após o que as células foram perfundidos a tensões de corte que variam de 0.5-8 dyn /cm

2. Vídeos foram gravados durante 30 segundos a 10 locais ao acaso ao longo do comprimento de cada microtubo.

Para a medição das interações CTC pacientes com E-selectina, PBMC obtidos a partir de 21 amostras CRPC paciente após a depleção-CD45 anti e seis amostras de pacientes sem depleção de anti-CD45 foram marcadas com J591-488 e correram sobre a E-selectina microtubos -Revestido em 0,6 dyn /cm

2. J591-488 marcado CTC foram visualizadas utilizando 488 nm de comprimento de onda do laser. Uma série de contínuas 45 vídeos seg foram registrados utilizando o módulo de lapso de tempo Axiovision (Carl Zeiss, Thornwood, NY). Todos os tubos e pontas de pipetas foram pré-revestidos com 0,5% de albumina de soro humano para bloquear a ligação não específica do CTC.

análise de Fluxo Laminar para interações celulares CTC-endoteliais

Para interações CTC-endoteliais, foi utilizada uma câmara de fluxo de placas paralelas [17]. HUVECs (uma oferta do Dr. Shahin Rafii) foram cultivadas em meio M199, Hepes 1 M, FBS a 20%, 5 mg /ml de heparina, /factor de crescimento de células endoteliais ml 100 ug, e L-glutamina. HUVECs E4ORF1-transduzidas foram preparadas e mantidas como anteriormente descrito [18]. células MDA ou CTC derivados de quatro pacientes CRPC foram perfundidos sobre monocamadas confluentes de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) cultivadas em um 35 x 10 mm pratos de cultura de tecidos (Corning Inc., Corning, NY). HUVEC foram estimuladas em primeiro lugar com 50 ng /ml de IL-1β (Peprotech, Rocky Hill, NJ) durante 4 h. HUVECs estimulada de IL-1p-tratadas com 30 ug /ml de anticorpos anti-E-selectina (68-5H11, BD Pharmingen, CA) durante 1 h a 37 ° C incubadora, não estimulada HUVEC, e o anticorpo humano anti-rato ICAM-1 ( clone BBiG-I1, # BBA3 sistemas R e D) foram utilizados como controlos. células MDA ou CTC foram ressuspensas em tampão I e perfundidas na câmara de fluxo paralelo placa sobre células HUVEC. rolamento de células MDA foi avaliada em diferentes tensões de corte que variam de 0.5-4 dyn /cm

2 realizando três experimentos independentes. Para rolar medições em CTCs derivadas de pacientes APC, as células enriquecidas por anti-CD45 esgotamento imunomagn�ica e marcadas com anti-PSMA J591-488, foram perfundidos sobre HUVECs em 0,6 dyn /cm

2 estresse de cisalhamento. Como indicado nos resultados, um subconjunto de rolamento experimentos ensaio também foram realizados utilizando tecnologias BioFlux microfluídica (Fluxion Biosciences, San Francisco, CA).

análise off-line do e-mediada por selectina interações

células de “rolling” foram definidas como qualquer traduzindo célula ao longo da superfície do tubo por mais de dois segundos, a uma velocidade inferior a 50% da velocidade da corrente livre hidrodinâmico de uma célula não interagindo perto da parede do tubo [19]. velocidade de rolamento foi quantificada registando a quantidade de tempo (T) necessário para uma célula de rolamento para se mover através de uma distância conhecida (d). Rolamento velocidade v = d /t.

Para avaliar as interações de CTCs derivadas de pacientes com E-selectina, CTCs foram categorizados em três classes: 1) CTCs de adesão estável (ou seja, preso à superfície por mais de cinco segundos); 2) Rolamentos /Tethering CTCs (isto é, tethering refere-se a CTCs que atribuem à superfície, em seguida, destacar em menos de cinco segundos e volte a ligar novamente); e 3) CTCs não aderentes (CTCs que não rolam /corda ou aderem à superfície).

coloração de imunofluorescência de marcadores de superfície celular

Seguindo o enriquecimento de PBMC de pacientes APC, células isoladas foram ligados às lâminas de vidro por citocentrifugação, fixados em formaldeído a 2% (Tousimis, Rockville, MD) durante 20 min, e lavou-se com PBS 3X. As células foram bloqueadas com BSA a 2% durante 1 h, e incubados com anticorpos primários de rato anti-LES

X (01:10, HECA-452, BD Pharmingen, San Jose, CA), ou anticorpo policlonal de coelho anti-CXCR4 (1: 100, Novus Biologicals, Littleton, CO) mAbs durante 1 h, e incubadas com Abs secundário (cabra AF594 anti-rato e anticorpos de cabra anti-coelho DyLight 405) durante 1 h, incubados em FA-488 e AF-647 anticorpos primários conjugados para anti-PSMA (humanizadas) e anti-EpCAM (ratinho, clone 9C4, BD Biosciences), respectivamente, e montados sobre um coverslide com Mowiol recentemente preparada (Calbiochem, Billerica, MA). Todas as incubações foram realizadas à temperatura ambiente, seguido por lavagem com 3X PBS mais 0,5% de BSA. Para coloração por imunofluorescência, MDA, PC3, KG1cells, e PBMC obtidas a partir de dadores saudáveis ​​normais foram utilizados como controlos negativos e positivos para proteínas diferentes. As células de controlo foram semeadas em BD-Tak celular lamelas revestidas e processados ​​da mesma forma como as amostras de pacientes. Quantificação de SLE

x dados expressão foi obtido usando Metamorph

TM software (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA) e medindo a intensidade de fluorescência média (IFM) por pixel [20]. A intensidade de fundo, determinada seleccionando uma área CTC falta, foi subtraída a partir destes valores para cada imagem. Para estas medições, Z-pilhas de imagens adquiridas foram usadas tomada pelo LSM 700 Zeiss Observer.Z1 (Carl Zeiss, MicroImaging Inc, Thornwood, NY).

Western blot e immunofluorescene para a expressão de E-selectina em HUVECs

Ambos 1 ° e E4ORF1 células HUVEC foram estimuladas com IL-1β durante 4 h. Após a estimulação de IL-1β, tanto não estimuladas e estimuladas células foram lavadas três vezes com PBS arrefecido em gelo. As células foram ressuspensas em tampão de lise (150 mM de NaCl, 10 mM Tris HCl, pH = 7,5, EDTA 5 mM) contendo comprimido inibidor de protease do cocktail (/10 ml de tampão de lise 1 comprimido; Roche). As concentrações de proteína de lisado de células foram determinadas pelo método de Bradford. O lisado celular foi diluído em tampão de amostra redutora 6X (12% w /v de SDS, 0,06% w /v de azul de bromofenol, 47% v /v de glicerol, Tris 0,5 M, pH = 6,8, levar o volume até 10 ml com água destilada) e separados em gel de SDS-PAGE a 10%. proteínas resolvidas foram transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (Bio-Rad, Inc., Hercules, CA) e bloqueadas em leite 5% durante 1 h à temperatura ambiente. Membrana foi cortada e, em seguida, incubadas com anti-ratinho de E-selectina (1: 500, 68-5H11, BD Pharmingen, San Jose, CA) e de ratinho anti-β-actina (1: 10000, Sigma Aldrich) durante a noite a 4 ° C. Imunorreatividade foi visualizado pela Odyssey Infrared Imaging System LI-COR (LI-COR Biosciences). Para imunofluorescência, tanto 1 ° e E4ORF1 células HUVEC foram estimuladas com IL-1β durante 4 horas, e ambas as HUVEC não estimuladas e IL-estimularam-1b foram fixadas, permeabilizadas com 0,1% de Triton-X 100, e imunocorados com anticorpo monoclonal anti-E-selectina de rato (2,5 ug /ml, 68-5H11, BD Pharmingen, San Jose, CA) durante a noite a 4 ° C. As HUVECs foram coradas com Alexa Fluor de cabra anti-rato anticorpo 488 nm (1: 500, Molecular Probes) durante 1 h à temperatura ambiente. HUVECs foram lavadas e contrastadas com DAPI.

Análise Estatística

As estatísticas descritivas são apresentados com histogramas que mostram a média + desvio padrão (SD). As médias foram comparadas pelo teste t de duas amostras com calculadora variância apropriada. Os diagramas de caixa foram feitas e o teste de Wilcoxon rank-sum não paramétrica foi realizada para comparar as distribuições (ou seja, mediana, gama) entre os grupos. Um mínimo de três experiências independentes foram realizados com linhas celulares de cancro. O teste exato de Fisher foi realizado para avaliar a relação entre o estado de interação CTC /E-selectina paciente e status de progressão clínica. Um valor de p

0,05

foi considerado estatisticamente significativo em todas as análises. Todas as análises foram realizadas no STATA versão 10.0 (StataCorp, College Station, TX).

Resultados

Rotulagem de células tumorais da próstata com o anticorpo anti-PSMA J591-488

Para CTCs de estudo isolados de pacientes com CRPC, aproveitamos o fato de que 90% das células CaP expressam PSMA na sua superfície celular [21,22], e usado mAbJ591-488, que reconhece um domínio externo de PSMA e é rapidamente internalizado após a ligação a PSMA de superfície celular, para identificar CaP CTC [15,23] .. células MDA células que expressam PSMA e PC-3 (controle negativo PSMA) foram adicionados separadamente ao sangue normal, saudável, e a mistura foi incubada com mAbJ591- 488. Após a incubação, a camada de PBMC contendo células cancerosas foram recolhidos. Tal como esperado (Figura 1A), as células que expressam o PSMA MDA internalizado mAbJ591-488 e eram facilmente visíveis por microscopia fluorescente, enquanto mAbJ591-488 não se ligou a células PC3 (Figura 1B). experimentos spiking sangue com MDA e PC3 foram realizadas seis vezes usando diferentes sangue do doador saudável. Nenhuma expressão de PSMA foi detectada em torno leucócitos que foram identificados por imunocoloração com anticorpo anti-CD45 (Figura 1C). PSMA expressão também não foi observado em células PC3 misturadas com sangue (dados não mostrados). Estes resultados sugerem que pode especificamente mAbJ591-488 marcar as células APC e pode, assim, ser usadas para rotular CaP CTC.

As células cancerígenas foram cultivadas isoladamente (A, B) ou na presença de dadores saudáveis ​​derivado PBMC (C ). As células foram marcadas com anticorpo J591-488 (verde), à ​​temperatura ambiente, em seguida, fixo e imunocoradas para CD45 (vermelho) e DAPI (azul). A) As células MDA são positivos para a expressão de PSMA. B) células PC3 são negativas e, por conseguinte, não têm a expressão de PSMA. C) Direito subfigura mostra a expressão específica do PSMA por células MDA enquanto as células do sangue expressam CD45. CMSPs isolados a partir de dadores saudáveis ​​normais foram misturadas com células MDA e processadas como em A, células de cancro MDA B. PSMA positivos são claramente e especificamente descrita (seta branca) entre os leucócitos que expressam CD45 (setas) na mistura.

Green = PSMA, Red = CD45, e azul = DAPI

.

adesão E-dependente de selectina de não marcado e anti-PSMA J591-488 rotulados células tumorais da próstata

Durante uma resposta inflamatória, leucócitos aderem ao endotélio vascular pelas interações entre a adesão moléculas presentes no lado luminal do endotélio vascular e ligandos complementares presentes nos leucócitos. Essas interacções resultam na transiente, adesão dinâmica (rolamento) de células para a parede vascular [2]. Rolamento é observada devido a quebra contínua e formação de ligações de receptor-ligando na extremidade traseira da cela e o bordo frontal da célula, respectivamente. Para investigar se a interacções de E-selectina dependente de ocorrer no CTC próstata, utilizou-se primeiro MDA, PC3, LNCaP, e C4-2 CaP linhas de células para avaliar o seu comportamento de rolamento na presença de superfícies de microtubos de E-selectina-revestido. Fora das quatro linhas celulares de CaP estudados, apenas detectado comportamento robusto rolamento em células MDA (dados não apresentados), consistente com estudos anteriores [24,25].

O anticorpo monoclonal J591 é internalizado na sequência da superfície celular de ligação sugerindo que CaP CTCs podem ser rotulados

ex vivo

e estudou para interações CTC-endoteliais. No entanto, para descartar a possibilidade de que a ligação J591-488 e altera internalização rolando comportamento, nós rotulados células MDA com J591-488 e comparou o comportamento de rolamento com células MDA não marcados em tensões de corte que variam de 0.5-8 dyn /cm

2 . A velocidade de rolamento significativo de células MDA não marcados e marcados no J591-488 0,5 dyn /cm

2 foi de 5,27 + 1,28 | iM /seg e 5,23 + 1,85 ^ M /s (Figura 2, p = 0,88, NS). Fizemos observar um pequeno, mas estatisticamente significativa diferença na média rolando velocidades de não marcado contra J591-488 rotulados células MDA em 3 (7,04 + 1,15 vs 6,33 + 1,22 mm /s,

p 0,005

) e 8 ( 17,81 + 3,51 vs 14,38 + 1,83 mm /s,

p 0,0005

) dyn /cm

2 estresse de cisalhamento. Portanto, com base em nossos resultados e estudos anteriores, realizamos experimentos em 0,6 dyn /cm

2, uma tensão de cisalhamento fisiológica amplamente aplicado para medir o comportamento de rolamento [17]. Além disso, tem sido mostrado que as células do tumor e do tirante rolar em tensões de corte menores (

3 dyn /cm

2) [26]. Estes dados sugerem que o CTC pode ser marcado com J591-488 e que marcação fluorescente dos CTC não afecta o comportamento de rolamento em tensões de cisalhamento mais baixas. De nota, não se detectou qualquer comportamento de rolamento, quer na ausência de E-selectina a qualquer tensão de cisalhamento examinado ou na presença de proteína recombinante L-selectina humana (dados não mostrados), sugerindo que a E-selectina é necessário para o rolamento comportamento. Vídeos S1 e S2 mostram o comportamento de rolamento de células não marcadas e J591-488-rotulados MDA

. células

MDA foram marcadas com mAb J591-488 para PSMA. Após a marcação, 10

6 J591-488 células MDA marcadas foram perfundidos a 0,5, 1, 3, 5, e 8 dine /cm

2 estresse de corte. Da mesma forma as células MDA não marcados também foram perfundidos através de microtubos revestidas E-selectina. Dez vídeos foram tomadas em diferentes comprimentos de microtubo para cada tensão de cisalhamento. velocidade de rolamento foi medida tanto para não marcado e anti-PSMA marcado J591-488 células MDA. A figura não mostra nenhuma diferença significativa na velocidade de rolamento entre não marcado e anti-PSMA marcado J591-488 células MDA na tensão de cisalhamento variando 0,5-1 dyn /cm

2. As velocidades médias rolando em 0,5 dyn /cm

2 foram 5.27+ 1,38 e 5,23 + 1,85 mm /seg em marcado e J591-488 rotulados células MDA, respectivamente. Em tensões de cisalhamento mais elevadas, foi observada uma diferença significativa entre as duas categorias de células MDA. Histograma mostra os resultados de três experiências separadas, combinadas em conjunto. UnL = células MDA não marcados, Lab = J591-488 rotulados células MDA. Os dados são representados como média + SD.

interações E-mediada por selectina em CTCs derivadas de pacientes com câncer de próstata

A seguir, determinou se CTCs derivado de pacientes APC irá interagir com E- selectina semelhantes às células MDA APC. As CMSPs de ~ 6 ml (5.4-7.5) de sangue total foram obtidos a partir de 17 doentes individuais (27) amostras de sangue com PCA metastático, e incubadas com mAb J591-488. Seguindo rotulagem, 21 amostras foram submetidos a depleção de anti-CD45; enquanto em 6 amostras, não foi realizada nenhuma depleção de anti-CD45. Nós concorreu pela primeira vez seis amostras de pacientes sem depleção anti-CD45. Subsequentemente, para evitar a contaminação leucócitos que pode diminuir potencialmente a probabilidade de CTC interagir com a superfície, é empregue o esgotamento de anti-CD45 para enriquecer a população CTC. A taxa de recuperação desta técnica foi de 60-70%, utilizando células que expressam PSMA PCA (dados não mostrados). Cada amostra do doente foi submetido a perfusão sobre as superfícies microtubos revestidos por E-selectina em 0,6 dyn /cm

2 gerando uma taxa de cisalhamento de 60

-s, que está dentro da gama de taxa de corte na parede nas vénulas pós-capilares fisiológico [27 ]. CaP CTC marcadas com mAb J591-488 foram identificadas em 23 amostras, e o número médio do CTC detectados utilizando a análise de vídeo desligada era nove (gama 0-270) (Tabela 1). Nove dos 23 (39,1%) e 10/23 (43,5%) de amostras de doentes mostrou rolamento /amarrar e adesão estável, respectivamente. As interações E-selectina mediada observados em CTCs próstata composta principalmente tethering e aderência estável com muito poucas CTCs que mostram o comportamento de rolamento. Quando avaliamos o estado clínico no momento da coleta e processamento de amostras, observamos que CTCs de amostras de doentes com uma resposta clínica foram significativamente menos propensos a ter interações E-mediada por selectina em comparação com CTCs de progredir clinicamente pacientes (Tabela 1; 0.0 % vs. 61,9%, respectivamente,

p

= 0,016). depleção anti-CD45 não tinha um efeito sobre a interacção de E-selectina-dependente no CTC (Tabela 1, a amostra 1, 13, 17, 21, 22, 25); embora, não podemos descartar por completo a possibilidade de que algumas CTCs foram perdidos durante o processo de esgotamento anti-CD45. Vídeo S3 mostra um vídeo a partir de uma amostra do paciente que demonstra a interacção dos CTC com E-selectina. Estes resultados fornecem evidências de que física directa CTC próstata que expressam PSMA interagir com E-selectina e sugerem que possuem ligando CTC próstata E-selectina (s) (ESLs) nas suas superfícies celulares.

Paciente No.

Amostra No.

Rolamentos, Tethering

Adesão Estável

total

História clínica no momento da coleta da amostra

resposta clínica no momento da coleta da amostra

1 * 13329Bone e metástases LN seguintes progressão na docetaxel e terapia experimental atualmente no cetoconazol /hydrocortisoneProgression121310Bone e metástases LN seguintes progressão na docetaxel e terapia experimental atualmente no cetoconazol /hydrocortisoneProgression132814270Bone e metástases LN seguintes progressão na terapia hormonal, docetaxel, e terapia de investigação actualmente em abiraterona /prednisoneProgression140072Bone e LN metástases seguintes progressão na docetaxel e abiraterona atualmente no carboplatina /paclitaxelResponding150012Bone e LN metástases após progressão na docetaxel e abiraterona atualmente no carboplatina /paclitaxelResponding26009Bone e LN metástases previamente tratados com terapia hormonal e docetaxel em therapyProgression27004Bone e LN metástases experimentais previamente tratados com hormonal terapia e docetaxel em metástases therapyProgression38035Bone experimentais seguintes múltiplas linhas de metástases therapyProgression39009Bone hormonais seguintes múltiplas linhas de terapia hormonal sobre docetaxelResponding410012Bone, LN, metástases hepáticas e pulmonares previamente tratados com docetaxel e abiraterona atualmente no metástases carboplatina /paclitaxelProgression511009LN com a progressão de metástases therapyProgression512001LN hormonais com progressão na terapia hormonal e docetaxel actualmente em abiraterona /prednisoneResponding6 * 13400166bone metástases com progressão em docetaxel e metástases therapiesProgression614036bone experimentais com progressão em docetaxel, terapias de investigação, e abirateroneProgression7152141bone, LN, cólon, e metástases da bexiga seguindo therapyProgression716002bone hormonal e experimental, LN, do cólon e da bexiga metástases após a terapia hormonal e de investigação, atualmente no docetaxelResponding8 * 17023bones metástases previamente tratados com várias linhas de therapyProgression818000bones metástases hormonais previamente tratados com várias linhas de terapia hormonal, atualmente no metástases docetaxelResponding919000bone progredindo em therapyProgression10202153LN hormonal e metástases hepáticas iniciais previamente tratados com docetaxel atualmente no abirateroneProgression11 * 219228bone metástases previamente tratados com docetaxel, cetoconazol, e therapyProgression12 investigacional * 22102LN metástases tratados previamente terapia de investigação e docetaxel, actualmente em enzalutamideProgression1323000bone e LN metástases de leuprolida e bicalutamideProgression14240020bone e pulmões metástases previamente tratados com therapyProgression15 hormonal * 250010bone, LN, bexiga e metástases pulmonares previamente tratados com terapia de investigação e metástases docetaxelProgression1626000bone LN e previamente tratados com terapia de investigação e docetaxelProgression17271022LN e metástases bexiga anteriormente treatd com cetoconazol, docetaxel, terapia de investigação, actualmente em cabazitaxelProgressionTable 1. Interacções entre CTC derivadas de pacientes com CaP e metastáticos microtubo de e-selectina-revestido . superfícies

LN = linfonodo; Total significa todas as CTCs marcado com J591;