Abstract
Fundo
O benefício clínico de testes oculto nas fezes guaiaco sangue (FOBT) está agora bem estabelecida para o rastreio do cancro colo-rectal. Evidências crescentes têm demonstrado que modificações epigenéticas e mudanças microbiota fecal, também conhecido como disbiose, estão associados com CRC patogenia e pode ser usado como marcadores substitutos da CRC.
Pacientes e Métodos
Foi realizada uma estudo transversal que incluiu todos os assuntos consecutivos que foram referidos (2003-2007) para o rastreio colonoscopia. Antes da colonoscopia, efluentes (fezes frescas, soro e urina-S-U) foram colhidas e FOBTs realizada. níveis de metilação foram medidos nas fezes, S e U durante 3 genes (Wif1, ALX-4, e vimentina) seleccionados a partir de um painel de 63 genes; mutações KRAS e sete populações bacterianas dominante e subdominante nas fezes foram quantificados. A calibração foi avaliada com o Hosmer-Lemeshow qui-quadrado, e a discriminação foi determinada pelo cálculo da estatística C (área sob a curva) e índice de Melhoria Reclassificação Net.
Resultados
Houve 247 indivíduos (idade média de 60,8 ± 12,4 anos, 52% dos homens) no grupo de estudo, e 90 (36%) destes indivíduos eram pacientes com pólipos avançados ou adenocarcinomas invasivos. Um modelo multivariada ajustada para idade e FOBT levou a uma estatística C de 0,83 [0,77-0,88]. Após sequencial complementar (um por um) de ajuste, wif-1 metilação (S ou U) e disbiose microbiota fecal levou a um aumento da estatística C a 0,90 [0,84-0,94] (p = 0,02) e 0,81 [0.74- 0,86] (p = 0,49), respectivamente. Quando ajustado em conjunto para FOBT e wif-1 metilação ou disbiose microbiota fecal, o aumento da estatística C foi ainda mais significativa (0,91 e 0,85, p 0,001 e p = 0,10, respectivamente)
Conclusão
a detecção de wif-1 metilado em qualquer S ou U tem uma precisão desempenho superior em comparação com FOBT guaiac para avançados triagem neoplasia colorretal. Por outro lado, a detecção microbiota disbiose fecal não era mais preciso. O sangue e teste de urina pode ser utilizada naqueles indivíduos relutantes em submeter a teste fezes
citação:. Amiot A, Mansour H, Baumgaertner I, Delchier J-C, Tournigand C, Furet J-P, et al. (2014) a detecção da metilado wif-1 Gene é mais preciso do que um teste de sangue oculto nas fezes para o rastreio do cancro colorectal. PLoS ONE 9 (7): e99233. doi: 10.1371 /journal.pone.0099233
editor: Anthony W. I. Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 03 de fevereiro de 2014; Aceito: 13 de maio de 2014; Publicação: 15 de julho de 2014
Direitos de autor: © 2014 Amiot et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Cancéropôle Ile de France, Comica 2007-2010 projecto, (Charles Debray associação ACD); LNCC (francês Liga Nacional contra o Câncer), CCR Promoção INSERM (2004-2006). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados, análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos: Conflito de interesses existem para I. Sobhani eo marcador de teste Wif1 (patente registada), e para JP Carrau para o teste FOB (chefe do laboratório).
Introdução
o câncer colorretal (CRC) é uma significativa causa de morbidade e mortalidade nos países desenvolvidos. A incidência de CRC tem crescido por 3 a 4% por ano desde 1970 [1], [2]. Na maioria dos casos, a história natural da CRC inclui uma progressão de pólipos de CRC avançado que permite a detecção precoce em doentes assintomáticos. A colonoscopia, o “método padrão ouro”, sigmoidoscopia flexível, e a colonografia por tomografia computadorizada demonstraram ser eficazes para o rastreio de CRC, demonstrando uma redução no CRC incidência e mortalidade [3], [4], [5], [ ,,,0],6]. No entanto, na maioria dos países, nenhum desses métodos são atualmente recomendadas para o rastreio em massa CRC devido às limitações inerentes, que incluem preparo intestinal, alto custo, as taxas de adesão baixa, e os eventos adversos ocasionais. Nas últimas décadas, foram feitas tentativas para definir-se testes minimamente invasivos para o rastreio de CRC. O fecal de sangue oculto guaiac (FOBT) foi mostrado para reduzir a mortalidade relacionada com o CRC em três ensaios clínicos randomizados e um estudo de base populacional [7], [8], [9], [10]. No entanto, FOBT tem uma baixa sensibilidade e um impacto muito limitado sobre a transição adenoma-carcinoma, provavelmente porque as lesões pré-cancerosas precoces só produzem baixas concentrações de sangue nas fezes [11], [12]. O quantitativo imunoquímico FOBT demonstrou recentemente uma maior sensibilidade na detecção de neoplasias avançada [13]. No entanto, ainda existe uma necessidade para um teste mais preciso para melhorar o desempenho de triagem.
Na maioria dos casos, os factores genéticos herdados dar um contributo menor para a susceptibilidade ao desenvolvimento de CDC, enquanto os principais contribuintes são factores ambientais [14]. De fato, estudos anteriores demonstraram que o desenvolvimento CRC foi associado com o envelhecimento, mas também com os estilos de vida ocidentais modernas e componentes alimentares [1], [15].
A metilação aberrante de sequências CpG rica (ilhas CPG) é uma mudança epigenética que induz o silenciamento transcricional de genes supressores de tumor [16]. Estas alterações genéticas podem ser induzidas por factores químicos e /ou ambientais [1]. A hipermetilação de ilhas CpG em genes supressores de tumores tem sido relatada em tecido neoplásico de pacientes de CRC, assim como em lesões pré-malignas [17]. Sabe-se que a metilação aberrante existe no ADN, tal como a encontrada nas fezes, soro, urina e outros fluidos corporais circulantes, e poderia ser utilizado como um biomarcador para o rastreio do cancro [18], [19].
Mais recentemente, os micróbios que colonizam o trato GI, que são os principais actores em ambientes biológicos, têm sido suspeitos de jogar papéis na ocorrência de CRC [20]. Com efeito, as mudanças na luminal ou microbiota intestinal aderente, chamados dysbiosis, tem sido demonstrado em pacientes de CRC [21], [22]. Em modelos animais, a contribuição das bactérias para a etiologia de CRC tem sido estudado e tem sido sugerido que pode actuar através de vias inflamatórias, embora um efeito genotóxico directa das bactérias podem também ser suspeita [23]. Recentemente, foi demonstrado que o transplante de fezes de pacientes humanos com CRC para ratos livres de germes poderia induzir aumentos de eventos pré-cancerosas intestinais, através da alteração do gene hospedeiro, a proliferação celular e o metabolismo na mucosa [24]. Assim, as alterações na microbiota fecal poderia ser usado como biomarcadores para triagem CRC.
No presente estudo, investigamos a precisão dos novos testes de rastreio de desempenho para CRC alvejando os níveis de metilação de um painel de 63 genes nas fezes , sangue e urina, bem como a composição da microbiota fecal foi avaliada por qPCR. Os últimos testes foram comparados com FOBT guaiac em uma população de base hospitalar de indivíduos pertencentes a grupos de risco médio ou alto para CRC.
Pacientes e Métodos
População do estudo
de 2003 a 2007, 247 pacientes ambulatoriais consecutivos (idade média de 60,8 ± 12,4, 129 do sexo masculino), com um risco médio ou alto de CRC (histórico de câncer em parentes, história passada pessoal de pólipos, quaisquer sintomas abdominais ou intestinais relacionados, ou anemia que colonoscopia necessário), foram incluídos em um estudo de cobrança bancária amostra. Para ser elegível para inclusão, os pacientes tinham que ter nenhuma história prévia do seguinte: a cirurgia colorectal, doenças como lesões inflamatórias ou infecciosas do intestino, ou a necessidade de uma colonoscopia de emergência. O estudo foi realizado em dois departamentos (Gastroenterologia e Oncologia) de um hospital de ensino na área de Paris de France.
Duas semanas antes da colonoscopia e depois de dar consentimento informado, os pacientes foram incluídos no estudo e foram solicitado a dar fezes frescas, urina e amostras de sangue dentro de 2 semanas, mas até três dias antes da colonoscopia. Em todos os casos, amostras de fezes foram coletadas antes da limpeza intestinal para colonoscopia. Quaisquer dietas específicas (diabéticos, vegetarianos) e medicamentos (medicamentos anti-diabéticos, hypocholesterolemics e laxantes) durante este período foram registrados. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética da área de Val de Marne Paris-EST que autorizou a inscrição de pacientes em todos os centros associados (número 2004-4 CCPPRB). Todos os pacientes receberam informações sobre o estudo, os seus objectivos, e as amostras que dariam. Toda a informação foi dada por uma letra datilografada escrito em francês, e o consentimento formal por escrito foi obtido em um formulário triplicado; uma cópia do formulário foi retida pelo paciente, que manteve uma cópia do departamento de investigação clínica (CIC) e a última cópia foi retido pelo promotor (Instituto Nacional de pesquisas científicas na medicina-INSERM). Assim, uma adesão formal estava disponível para cada paciente. entrevistas detalhadas para a história médica e exames físicos foram realizados.
Guaiac oculto nas fezes exame de sangue
O teste guaiac Hemoccult foi realizada (realizada em um laboratório certificado pelas autoridades francesas em Paris) sobre todos os assuntos concordando a participar do estudo. Para o FOBT, foi necessária uma amostra por fezes de 3 evacuações consecutivas. De acordo com o programa em curso, uma dieta específica (sem carne durante 3 dias) foi recomendada. Assuntos recolhidos dos próprios 3 amostras em casa (usando o cartão de kit para Hemoccult), registrou a data de cada movimento do intestino envolvido, e enviou os testes pelo correio. A leitura Hemoccult foi realizada às cegas por técnicos certificados sem reidratação, de acordo com os protocolos estabelecidos pelo programa nacional de rastreio organizado. Screening foi considerado positivo se o teste Hemoccult foi positivo (pelo menos 1 dos 6 slots foi positivo).
Rastreio colonoscopia
Todos os indivíduos foram submetidos a um exame de colonoscopia sob anestesia. Locais cólon direito e esquerdo, bem como o recto, foram examinados completamente em todos os pacientes. Os resultados da colonoscopia foram registrados seguindo o processo usual para um programa de rastreio organizado na França. Os pólipos foram completamente removidos durante o exame de endoscopia usando Mucosectomia, se necessário. A colonoscopia foi considerado o método padrão de ouro. Os resultados da colonoscopia foram classificados de acordo com a lesão patológica mais avançados encontrados. neoplasias avançadas incluídas adenomas avançados (adenomas de medição 10 mm ou adenomas com displasia de alto grau ou carcinoma in situ) e CRC invasiva (invasão de células malignas para além da mucosa muscular). pólipos hiperplásico não foram incluídos como neoplasias.
A quantificação de metilação por PCR quantitativo
O ADN total foi isolado a partir de amostras de urina, de fezes e soro, usando o kit de ADN Qiamp Mini (Qiagen) e, em seguida, convertido com bissulfito de sódio e amplificado utilizando iniciadores de PCR específicas para um local que flanqueiam uma sonda MGB. O nível de metilação para cada paciente foi determinada como descrito por Eads et al [25]. As condições de PCR foram 94 ° C durante 10 minutos para activação da enzima, 45 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos e 60 ° C durante 60 segundos para emparelhamento e alongamento por PCR. Nós confirmamos resultados de metilação por sequenciamento genômico bisulfite direta em 5% dos pacientes afetados investigados para seus tecidos para excluir um artefato técnico. Um painel de 63 genes (dados não mostrados) extraída a partir da literatura foi avaliada em primeiro lugar, e, em seguida, 3 genes de interesse (com-1, ALX-4 e vimentina) foram seleccionados com base nos seus valores discriminativos que foram determinadas por comparações entre o tumor e tecidos intestinais homólogos normais [26]. A eficiência dos iniciadores dos genes alvo (Wif1, ALX4 e vimentina) e o gene de manutenção (Albumina BSP) para a entrada de ADN modificado foi avaliada utilizando diluições em série de controlos de ADN modificado metilado como mostrado na Figura S1). Depois de um estudo de viabilidade conjunto de experimentos realizados em amostras de fezes, urina e soro de 48 pacientes, decidimos medir apenas wif-1 níveis de metilação no conjunto de validação de acordo com as taxas de sensibilidade e especificidade superiores do gene wif-1 em comparação com ALX- 4 e vimentina. As sequências dos iniciadores e sonda para metilação dos genes-alvo estão listadas na Tabela S1.
análise bacteriológica de amostras fecais utilizando quantitativos PCR
Whole fezes frescas foram coletadas em caixas estéreis, e, dentro de 4 horas , 10 g foram congeladas a -80 ° C para análise. ADN bacteriano foi extraído a partir de alíquotas de fezes, e depois da precipitação final, o DNA foi ressuspenso em 150 ul de tampão TE e guardado a -80 ° C para posterior análise, tal como previamente descrito [26]. Utilizou-se uma técnica de qPCR em tempo real para investigar a diferença de densidades bacterianas dentro do microbiota entre neoplasia normal e avançado e fezes dos doentes de cancro. Os iniciadores e as sondas utilizadas neste estudo foram descritas noutro local [26] e são apresentados na Tabela S2. -QPCR em tempo real foi realizado utilizando um 7000 Sequence Detection System ABI com o software de versão 1.2.3 (Applied Biosystems-, Foster City, CA, EUA), e o número total de bactérias foram inferidos a partir das curvas padrão calculados e expressos como valores log10, como previamente descrito [26]. valores qPCR foram obtidos por paciente e para cada componente da flora intestinal. Para compensar o facto de as amostras fecais pode conter mais ou menos água, os dados para cada amostra fecal foram normalizados como descrito anteriormente [26]. O nível encontrado para cada população bacteriana dominante e sub-dominante particular foi subtraída de todos os-teor de bactérias, e os resultados são expressos como o logaritmo do número de bactérias por grama de fezes. Estes ensaios foram usados para comparar a composição da microbiota intestinal de todos os sujeitos, e os resultados são expressos como médias ± DP.
KRAS análise de mutação
O DNA foi amplificado por PCR em duplicados com uma conjunto de primers específicos de alelo cobrindo exons 12 e 13 do gene Kras [27]. As condições de PCR foram 94 ° C durante 10 minutos, 45 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos e 60 ° C durante 60 segundos para emparelhamento e alongamento por PCR. Foram utilizados dois conjuntos de primers e sondas de PCR: um conjunto foi específico para o DNA alelo selvagem e o segundo conjunto representou o alelo mutação. As sequências dos iniciadores e sondas estão listadas na Tabela S3.
A análise estatística
características de cada paciente são descritos como um número (%) para os dados qualitativos e como mediana (intervalo interquartil, IQR) ou média (± 1 desvio padrão, SD) para os dados quantitativos de acordo com a sua distribuição. Foram comparadas as características basais dos pacientes dos dois grupos (grupos de neoplasias e de controle avançado), utilizando o teste do qui-quadrado de Pearson ou exato de Fisher para as variáveis qualitativas e o não paramétrico de Wilcoxon ou testes de Kruskal-Wallis para as variáveis quantitativas. teste bilateral de Spearman foi utilizado para avaliar correlações.
As odds ratio (OR) e intervalos de confiança de 95% (IC) de cada parâmetro foram estimados usando regressão logística em separado análises. Os resultados microbiota Dysbiosis fecais foram dadas durante 1 SD dos níveis de log-transformados calculados para cada grupo de controlo. A análise foi sistematicamente idade-ajustada para estimar de forma independente a precisão de cada testes de rastreio de desempenho. A idade foi tratado em contínuo depois de verificar a normalidade suposição. Calibração de cada modelo foi estimada pela estatística de Hosmer-Lemeshow em que um
valor p
maior do que 0,20 indica o ajuste adequado. A discriminação do nosso modelo foi avaliada pela estatística C (Área sob a curva ROC), que foi calculado a partir do modelo de regressão logística multivariada. Os C-estatísticas dos modelos com e sem neoplasia avançados foram comparados usando um teste não paramétrico desenvolvido pela Delong et al e apropriada para dados não-independentes [28]. Uma análise de bootstrap resampling com 1000 repetições de conjunto de dados de linha de base foi realizado para estimar ICs de 95% de C-statitistics dos modelos multivariados. A discriminação também foi quantificada pelo cálculo do índice Melhoria Reclassificação Net (NRI) [29].
Todas as comparações foram 2 lados e um
valor p
inferior a 0,05 indicava uma diferença estatisticamente significativa . As análises foram realizadas utilizando o software STATA versão 12.0 (Stata- Corp, College Station, TX, EUA).
Resultados
População do estudo
Duzentos e quarenta e sete pacientes foram incluídos no estudo. As características da população estudada estão listadas na Tabela 1. Todos os indivíduos foram submetidos a uma colonoscopia com o exame completo da direita e cólon esquerdo e reto. Os pacientes foram, então, classificados como se segue: indivíduos normais que apresentaram tanto a colonoscopia normal (n = 123) ou pequenos adenomas menos de 1 cm de diâmetro (n = 34) foram aqui considerados controles e pacientes com neoplasia que apresentaram CRC ( n = 66) ou grandes ( 1 cm de diâmetro) adenomas (n = 24) foram aqui considerados casos. O caso médio foi de mais de 10 anos mais velho que o paciente controle a média. Os pacientes do grupo controle com menos frequência relataram uma história pessoal prévia de pólipos e câncer colorretal em sua família em comparação com os casos. Os dois grupos foram igualmente equilibrada para o IMC, co-morbidades, a absorção de medicina, e regime alimentar (Tabela 1).
Análise de sangue oculto nas fezes teste Hemoccult
O teste Hemoccult baseado em Guaiac não foi interpretável em 2 casos. No geral, o FOBT foi positiva em 46 pacientes, dos quais 36 (78%) tinham neoplasia avançada, incluindo 33 (72%) CRCs. Entre os 199 pacientes com FOBTs negativos, 146 (73%) pacientes tiveram colonoscopias normais ou pequenos adenomas enquanto que 53 (27%) tinham neoplasia avançada, incluindo 33 (17%) com o CRC. Assim, a sensibilidade e especificidade do FOBT para neoplasias avançadas foram 40,4% e 93,6%, respectivamente.
metilado wif-1, ALX-4, e vimentina no soro, urina e fezes
os níveis de metilação do wif-1, ALX-4 e genes Vimentina foram avaliados pela primeira vez em amostras fecais. Na população total, foi observada a hipermetilação de Wif-1, ALX-4 e os genes vimentina em 7,3%, 4,5% e 0,8%, respectivamente (Tabela 2). Para cada gene (com-1, ALX-4 e vimentina), metilação aberrante foi significativamente mais frequente em pacientes de casos em comparação com pacientes de controle (19,3%
vs.
0,6%, 10,6%
vs
1,3% e 32,6%
vs. 0,0%, respectivamente) (Tabela 2). Para cada gene, a especificidade foi acima de 98%, mas com uma baixa sensibilidade inferior a 25%. Para o wif-1 e ALX-4 genes, mas não o gene Vimentin, o nível de metilação foi significativamente mais elevada em pacientes casos comparados aos controles (Figura 1).
A metilação níveis de Wif-1, ALX-4, e de vimentina foram então avaliados em amostras de urina e de soro. Wif-1 parece ser o marcador mais sensível de neoplasia avançada em amostras de urina ou no soro, quer (52% e 29%) em comparação com ALX-4 e vimentina (23% e 15% vs. 4% e 8%, respectivamente). A especificidade foi maior do que 93% em todos os casos. A combinação de urina e no soro do nível de metilação WIF-1 conduziu a uma taxa mais elevada sensibilidade de 60,4% [30].
O nível de metilação de Wif-1 foi então avaliada em amostras de urina ou no soro, quer para toda a validação coorte, que incluiu 247 pacientes. A hipermetilação de Wif-1 foi observada em amostras de urina e de soro em 26,7% e 32,6% dos casos e em 1,3% e 1,3% dos indivíduos de controlo, respectivamente (P 0,001 e p 0,001). A combinação de soro e na urina aumentou a taxa de detecção de neoplasia a 47,8% nos casos, em comparação com 2,5% no grupo controlo (Tabela 2). O nível de metilação foi significativamente mais elevada nos casos em relação aos controles, nem no soro ou amostras de urina (Figura 1). Não foi encontrada diferença para diferentes estágios do câncer colorretal de acordo com a American Joint Committee on Cancer classificação
disbiose Fecal microbiota em adenomas avançados ( 10 mm). E cancro colorectal
A microbiota fecal composição estava disponível para todos os sujeitos e é apresentado na Tabela 3. nos pacientes casos, fecal dysbiosis microbiota foi caracterizada por uma maior densidade de espécies que pertencem ao
grupo Bacteroides /Prevotella
vs controlos. Considerando-se todos os indivíduos em conjunto, o
Bacteroides /Prevotella
grupo não foi associada à idade (r = 0,09; p = 0,62) ou IMC (r = 0,20 e p = 0,24)
Kras análise de mutação em amostras de fezes
mutações no KRAS (exão 12 e 13) em amostras de fezes foram encontrados em 16 (18%) pacientes com neoplasia avançada em comparação com 16 (10%) indivíduos do grupo controle. A sensibilidade e especificidade foram de 17,8% e 89,8% para mutações no KRAS b, respectivamente. Não houve correlação entre mutações no KRAS e mudanças microbiota ou wif-1 metilação sempre que foi considerado nas fezes, sangue ou urina.
Precisão de testes de triagem para identificar neoplasia avançada
As RUP multivariadas para cada um dos parâmetros para a presença de neoplasia avançada são mostrados na Tabela 4. em um modelo multivariado ajustado para a idade, sexo masculino [OR = 2,02; IC95% (1,07-3,82), p = 0,03], a história de pólipos [OR = 0,24; IC95% (0,11-0,55), p = 0,001] e história familiar de CRC [OR = 0,50; IC95% (0,27-0,95), p = 0,03) foram independentemente associados com a presença de neoplasia avançada.
Quando a idade e os resultados da FOBT foram considerados no mesmo modelo (modelo 1) , um FOBT positivo foi independentemente associada com neoplasia avançada. Em um modelo semelhante com os resultados da urina ou soro de teste de metilação wif-1 (modelo 2), um teste de metilação positiva wif-1 foi fortemente associada com neoplasia avançada (limite inferior do IC 95%: 18,7). Ajuste tanto com FOBT e urina ou soro de teste de metilação wif-1 (modelo 3) mostrou que a urina ou soro de teste de metilação wif-1 permaneceram fortemente associados com neoplasia avançada (limite inferior do IC 95%: 14,41), enquanto que o FOBT já não era significativo.
Quando a idade e disbiose microbiota fecal foram considerados, apenas o
Bacteroides /Prevotella
grupo foi associado com neoplasia avançada (modelo 4). Quando a disbiose microbiota fecal e os resultados da FOBT foram considerados no mesmo modelo (modelo 5), apenas o FOBT foi associada com neoplasia avançada.
Contribuição de cada modelo ao avançado previsão neoplasia
a qualidade do ajuste do modelo de previsão de que só incluiu idade e FOBT foi adequada (
valor p
da estatística de Hosmer Lemeshow = 0,58). Como mostrado na Tabela 4, a exactidão (avaliada pela estatística C) do que o modelo foi significativamente menor do que a urina e /ou soro de teste metilação Wif-1 (modelo 2 aumentou a estatística C de 8,6%). Esta melhoria (avaliada pela estatística C e índice de melhora reclassificação líquido) foi significativamente superior no modelo que combinava a urina e /ou soro de teste metilação Wif-1 e o FOBT (modelo 3 aumentou a estatística C de 9,8% e o NRI de 22,8%). Testes para fecal disbiose microbiota (modelo 4) teve precisão semelhante ao FOBT. Combinando FOBT e testes para disbiose microbiota fecal não aumentou o último precisão do modelo (modelo 5 não aumentou a estatística C eo NRI).
Discussão
CRC é uma das principais causas de mortalidade e um fardo económico nos países desenvolvidos. A tentativa de reduzir a mortalidade da doença tem levado os sistemas de saúde pública para dar prioridade a rastreios de massa usando FOBT em indivíduos assintomáticos. Com efeito, foi demonstrado que reduz a mortalidade FOBTs CRC-associados [7], [8], [9], [10]. Embora a medição imunoquimica de hemoglobina tem sido mostrado para ser mais sensível do que FOBT com especificidade semelhante, o grande número de indivíduos que são relutantes a realizar o teste fecal podem limitar a sua utilização. A eficácia dessas estratégias depende, principalmente, a aceitação e a relação custo-eficácia do método de triagem. Neste cenário, sangue e testes de urina poderia ser usado em indivíduos potencialmente relutantes em submeter-se a fezes de testes.
Neste estudo, comparamos o desempenho diagnóstico do metilado wif-1, um antagonista secretada da via de sinalização Wnt , como um biomarcador de neoplasia colorretal avançado em amostras de fezes, soro e urina. Incluímos também as características clínicas no processo de triagem e realizada potenciais FOBTs como padrão-ouro. Descobrimos que metilado wif-1 teve o melhor desempenho diagnóstico para prever neoplasia avançada em comparação com características clínicas, FOBTs e mudanças microbiota, isoladamente ou em combinação. Esta descoberta é de grande interesse, porque um número significativo de pacientes recusar-se a realizar a FOBT [31].
Assim, para o desempenho de FOBT no presente estudo, Wif-1 foi usada para ultrapassar as limitações de FOBT porque do seu desempenho diagnóstico similar, com sensibilidade de 47,8% e 97,5% de especificidade. células neoplásicas cancro colorectal tem provado ser um grande paradigma devido à heterogeneidade das vias moleculares envolvidos no seu desenvolvimento, [33], [34], [35] [32]. Na maioria dos casos, a alteração genómica inicial do
APC /Wnt
via de sinalização é seguido pela acumulação de mutações de motorista adicional [36]. Esta relação tem levado pesquisadores a acreditar que um único marcador de DNA não pode ser um marcador válido para o rastreio CRC. Em nosso estudo, a triagem para mutações no KRAS em amostras de fezes confirmou que este dogma, mostrando resultados muito específicos, mas muito mal sensíveis. A utilização de um painel de ADN de fezes de 21 mutações do gene mostrou uma sensibilidade mais elevada do que a FOBT mas tem uma importante limitação custo [12]. Detecção de metilação aberrante foi recentemente mostrado ser mais sensível do que a detecção de mutações genéticas [37]. Além disso, metila�es aberrantes também pode ser detectado em ADN em circulação, tal como aquela encontrada nas fezes, soro, urina e outros fluidos do corpo [39]. Neste estudo, nós mostramos que o teste de metilação wif-1 é um marcador preciso da neoplasia colorretal avançado em um conjunto inicial de avaliações. Além disso, também demonstram que as amostras de sangue ou de urina tanto pode ser utilizado para determinar o nível de metilação. Em particular, este marcador pode ser utilizado em indivíduos que são relutantes a realizar exames de fezes. Notavelmente, o desempenho de FOBT revelado uma sensibilidade menor do que o relatado anteriormente. Esta diferença pode ser explicada pela escolha de um resultado primário que incluíram pacientes com neoplasia avançada que é muito mais relevante na prática clínica e pela população em estudo que incluiu pacientes com uma média ou de alto risco de CRC. Esta diferença poderia ser explicar pela extensão dos resultados para pacientes com neoplasia avançada que é muito mais confiável na prática clínica e pela população do estudo incluindo pacientes com uma média de alto risco de CRC. No entanto, estendendo-se por esse teste para os programas de rastreio em massa requer uma validação adicional em indivíduos assintomáticos, bem como relação custo-eficácia analisa em um modelo de simulação conforme relatado anteriormente [38].
Além disso, para melhorar a precisão dos testes biológicos para a predição de neoplasias durante colonoscopias, investigamos marcadores na microbiota, que está se tornando um novo campo para estudos de doenças humanas. A contribuição da microbiota intestinal para CRC tumorigênese está agora totalmente aceite [39]. técnicas de sequenciação de alto rendimento para a microbiota humano têm sido utilizados para investigar mudanças no núcleo filogenética bacteriana em indivíduos normais e em pacientes com CCR, em qualquer banco ou mucosa microbiota associada [21], [22]. Vários grupos de bactérias, ou seja,
Bacteroides /Prevotella
[21],
Fusobacterium
,
Faecalibacterium
e, particularmente,
Coriobacteridae
e
espécies Roseburia
[22], têm sido mostrados para ser relacionada com CRC, e modelos experimentais apoiaram esta hipótese causalidade [24].
Fusobacterium nucleatum
estirpes demonstraram promover a carcinogénese colorectal da invasão das células epiteliais através da produção de danos no ADN directa relacionados com genotoxin ou através da indução de inflamação [23], [40], [41]. No presente estudo, confirmamos a disbiose específico associado a neoplasia colorretal avançado caracteriza-se por uma maior densidade de espécies pertencentes ao
grupo Bacteroides /Prevotella
. No entanto, este resultado não melhorou o desempenho de triagem do FOBT ou a testar wif-1. Estudos futuros utilizando métodos de sequenciação mais profundas e /ou abordagens metagenomic são necessários para permitir uma ferramenta de triagem com base em microbiota fecal.
Conclusão
Neste estudo, a detecção de metilado wif-1 nas fezes, urina ou amostras de soro tem uma precisão superior diagnóstico para detectar neoplasia avançada em comparação com FOBT (0,90 [0,84-0,94] versus 0,83 [0,77-0,88], p = 0,02). Mais estudos são necessários para investigar se as alterações na microbiota poderia ser biomarcadores de neoplasia colorretal avançado, especialmente por meio de bactérias candidatos e estudos metagenomic. Soro e na urina Wif-1 Ensaios de metilação pode ser utilizado em indivíduos relutantes em submeter a teste fezes e deve ser agora avaliado no contexto de rastreio.
Informações de Apoio
Figura S1.
Eficiência dos iniciadores dos genes-alvo (Wif1, ALX-4 e vimentina) e gene housekeeping (Albumina BSP) utilizado para a quantificação de metilação utilizando diluições em série de controle de DNA modificado metilado. Para cada ponto de dados foram realizadas três análises independentes. A equação da curva de regressão linear, bem como o factor de correlação são indicados em cada gráfico
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099233.s001
(DOC)
Tabela S1. .
Metilado primers e sondas segmentadas gene
doi: 10.1371 /journal.pone.0099233.s002
(DOCX)
Tabela S2.
Grupo e primers alvo de gene 16S rRNA espécie-específicos e sondas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099233.s003
(DOCX)
Tabela S3.
Kras iniciadores de mutação e sondas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099233.s004
(DOC)
Reconhecimentos
Nós gostaríamos de agradecer a M. Goossens , K. Leroy, R. Inchitti, B. Coste, B. Ghaleh-Marzban, O. Montagne, ML. Auriault, MT. Chaumette, S. Vialette, F. Bouabbas, J. Francese, R. Jian, T. Aparicio, D. Abdelrahman, H. Hagège, A. Courillon Mallet, JL. Dupas, R. Benamouzig, M. Cavicchi, Cl. Altman, E. Zrhien, G. Tordjman, F. Venezia, F. Uzzan, D. Gilot, P. De Fleury, M. Algard, M. Prieto, M. Petit, J. Samama, D. Lucienne, JC. Delchier, M. Levy, e A. Charachon por sua contribuição útil para o presente estudo.