Abstract
Microseminoprotein-beta (MSMB,
MSMB
) é uma proteína de secreção abundante contribuiu pela próstata, e está implicado como um cancro da próstata (PC) biomarcador baseado em observações do seu menor expressão em células cancerosas em comparação com o epitélio da próstata benigna. No entanto, como a literatura atual sobre MSMB é inconsistente, avaliamos a expressão de MSMB nos níveis de proteína e mRNA em um conjunto abrangente de diferentes formas clínicas de PC. A imuno-histoquímica utilizando anticorpos monoclonais e policlonais contra MSMB foi utilizado para estudar a expressão de proteínas em amostras de tecido representando prostatectomias (n = 261) e em biópsias de agulha de diagnóstico a partir de doentes tratados com a terapia de privação de androgénios (ADT) (n = 100), e em castração localmente recorrente PC -resistente (CRPC) (n = 105) e metástases CRPC (n = 113). Os níveis de transcrição de
MSMB
, nuclear receptor co-ativador 4 (
NCOA4
) e
MSMB-NCOA4
fusão foram examinadas por qRT-PCR em amostras de prostatectomia e por RNA -sequencing na hiperplasia prostática benigna, PC, e as amostras CRPC. Nós também mediram os níveis MSMB soro e genotipados os rs10993994 single nucleotide polymorphism usando DNA do sangue de 369 pacientes de PC e 903 controles. expressão MSMB no PC (29% do prostatectomies e 21% das biópsias por agulha) foi mais frequente do que em CRPC (9% do CRPC localmente recorrentes e 9% de metástases CRPC) (
p Art 0,0001). Detecção da proteína MSMB foi inversamente correlacionada com a pontuação de Gleason em espécimes de prostatectomia (
p
= 0,024). O read-through
MSMB-NCOA4
transcrição foi detectada em níveis muito baixos em PC. níveis MSMB no soro foram semelhantes nos casos de PC e controles, mas foram significativamente associados com o risco de PC quando ajustado para idade ao diagnóstico e níveis de PSA livre ou total (
p Art 0,001). Os níveis séricos de MSMB em ambos os pacientes de PC e controles foram significativamente associados com o genótipo rs10993994 (
p Art 0,0001). Em conclusão, diminuição da expressão de MSMB paralelo com a evolução clínica dos níveis de PC e MSMB soro ajustada estão associados com risco PC
Citation:. Sjöblom L, Saramäki O, Annala M, Leinonen K, Nättinen J, Tolonen T, et ai. (2016) Expressão Microseminoprotein-Beta em diferentes estágios de câncer de próstata. PLoS ONE 11 (3): e0150241. doi: 10.1371 /journal.pone.0150241
editor: Irina U. Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos
Recebido: 30 de outubro de 2015; Aceito: 02 de fevereiro de 2016; Publicação: 03 de março de 2016
Direitos de autor: © 2016 Sjöblom et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. o trabalho foi apoiado por subsídios da Agência de Financiamento finlandesa de Tecnologia e Inovação da Finlândia programa distinto professor, a Academia da Finlândia, a Sociedade do Câncer da Finlândia, o Juselius Fundação Sigrid, o Fundo de Investigação médica do Hospital Universitário de Tampere, o National Cancer Institute dos Institutos Nacionais de Saúde (R01 CA160816, R01 CA175491); o Centro Kimmel Sidney de próstata e urológicos cancros; David H. Koch através da Fundação do cancro da próstata; o Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde (NIHR) Oxford Biomedical Programa Centro de Investigação; Cancer Research UK Oxford Centre; o Swedish Cancer Society (projecto n.º 14-0722.); e Fundação Federico SA, bem como pela Universidade de Tampere
Conflito de interesses:. Hans Lilja detém patentes de PSA livre (US 5.501.983), hK2 (patente US No. US 5.614.372) e PSA intacta (Patente US Nenhum . US 7.872.104 B2) ensaios, e é nomeado em um pedido de patente para um método estatístico para detectar câncer de próstata. As patentes de ensaio e o pedido de patente para o modelo estatístico foram licenciados e comercializados pela OPKO e Dr. Lilja receber royalties de vendas destes testes. Dr. Lilja possui ações em OPKO. Outros não divulgar qualquer COIs.
Introdução
O câncer de próstata (PC) é o segundo câncer mais comum entre os homens em todo o mundo [1]. Medições de antigénio específico da próstata (PSA), no sangue são largamente utilizados para detectar os homens da PC-risco e monitorar os homens com PC. Devido à baixa especificidade do teste-em níveis moderadamente elevados, uso indiscriminado de resultados de testes de PSA em grande número de biópsias desnecessárias e excesso de diagnóstico, com o consequente risco de excesso de tratamento [2,3]. Portanto, há uma necessidade urgente de biomarcadores adicionais que podem proporcionar especificidade melhorada para a detecção precoce de formas agressivas, letais da doença.
Microseminoprotein-beta (
MSMB
, MSMB aka MSP, PSP94) é uma das três proteínas mais abundantes secretadas pela próstata, juntamente com a PSA e da fosfatase ácida prostática (PAP) [4]. Vários estudos mostraram maior expressão MSMB em tecido normal e benigna da próstata do que em tecido canceroso [4-7]. Observações de maior expressão MSMB no tecido da próstata benigna levou alguns investigadores a sugerir que MSMB tem um papel supressor de tumores em [8] PC. Estudos funcionais
in vivo
e
in vitro
também sugerem um papel supressor tumoral para MSMB [9]. Níveis de MSMB no soro e na urina, também têm sido mostrados para ser mais baixa em pacientes PC do que nos controlos [10]. MSMB expressão positiva foi reportado para associar com prognóstico em biópsias de agulha [11] e a perda de coloração MSMB tem sido mostrado para ser associado com o tempo mais curto de recorrência bioquímica em PC clinicamente localizado [7]. Por contraste, a expressão aumentada em espécimes de prostatectomia MSMB tem sido sugerido para ser associado com a evolução das doenças desfavoráveis [12]. Assim, o significado prognóstico da expressão MSMB no tecido da próstata permanece controverso.
Foi demonstrado que o nível sérico de MSMB está associado com um único polimorfismo de nucleótido (SNP) em rs10993994 na região promotora de
MSMB
, o gene que codifica para MSMB [13,14]. O alelo T do SNP rs10993994 também tem sido associada com o risco de PC [15,16], que foi replicada em vários estudos [17-19]. Ainda assim, há evidências de uma associação entre baixos níveis de MSMB no soro e aumento do risco de PC, independentemente do genótipo rs10993994 [20].
Os dados publicados sobre a regulação da
expressão MSMB
por andrógenos são inconsistentes. Alguns estudos têm mostrado que a expressão MSMB é independente de androgénios [21,22]. No entanto, Dahlman e co-autores [23] descobriram que o
MSMB
transcrição e proteínas MSMB foram ambos significativamente reduzido após a curto prazo terapia da privação do andrógeno (ADT). Enhancer de zeste homólogo-2 (EZH2), um silenciador epigenética conhecido da expressão de genes, tem sido sugerido para silenciar
expressão MSMB
em PC avançado [24]. EZH2 também tem sido mostrado para ser sobre-expresso em PC fase final de [25].
O
gene MSMB
está localizado no cromossoma 10q11.2 [26]. Uma transcrição de fusão de leitura através da combinação
MSMB
com o gene adjacente receptor nuclear co-ativador 4 (
NCOA4
) foi recentemente demonstrado pelo Nacu et al. [27] e confirmado no tecido PC e do tecido normal da próstata por Lou et al. [28]. Eles também relataram que o
MSMB-NCOA4
gene de fusão inclui elementos de resposta a andrógeno (ARE), sugerindo que o gene de fusão pode ser regulada por andrógenos.
NCOA4 (
aka
ARA 70)
codifica uma proteína associada à AR que aumenta a atividade transcricional do AR em células da próstata [29]. Tem sido sugerido que o
MSMB-NCOA4
fusão pode ter um papel no PC devido aos papéis importantes do
MSMB
no tecido da próstata e da
NCOA4
como um potenciador de atividade de AR [27].
Devido aos dados inconsistentes sobre a expressão tecidual de MSMB /
MSMB
na próstata que queríamos para avaliar a expressão da proteína por imuno-histoquímica (IHQ) em coortes abrangentes de PC representando doença hormônio-naïve localizada e avançada, bem como PC resistente à castração localmente recorrente (CRPC) e metástases CRPC. Além disso, níveis de transcrição de
MSMB,
NCOA4
e
MSMB-NCOA4
foram estudados para avaliar a importância da transcrição de fusão ler-through. Finalmente, os níveis séricos de MSMB, bem como o genótipo rs10993994 foram analisados em uma coorte de pacientes de PC e controles.
Materiais e Métodos
amostras de tumores clínicos
prostatectomia, biópsia de agulha e amostras de tecido CRPC localmente recorrentes, bem como amostras de soro foram obtidas a partir de Tampere University Hospital (TAUH). As amostras foram de-identificados e analisados anonimamente. O uso de amostras coletados prospectivamente foi aprovado pela Comissão de Ética do Hospital Universitário de Tampere e do consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes. A aprovação para uso de coleta retrospectiva de amostras de tecido sem o consentimento informado foi obtido de a Autoridade Nacional para os Assuntos Médico-legais de acordo com a lei finlandesa. O uso de metástases CRPC foi aprovado pela Johns Hopkins Medicine Institutional Review Board, e consentimento informado por escrito foi obtido a partir dos sujeitos. Todas as amostras utilizadas para IHC foram fixadas em formalina, amostras embebidos em parafina (FFPE). tissue microarray (TMA) lâminas foram criados a partir da prostatectomia e amostras CRPC.
amostras de prostatectomia.
expressão MSMB foi avaliado com IHC em 261 espécimes de prostatectomia. As características da coorte estão apresentados na Tabela S1. Os mesmos espécimes de prostatectomia foram previamente analisados para o Ki-67 e EZH2 [25]. A progressão da doença foi definida de acordo com o nível de PSA no sangue, com recorrência bioquímica (BCR), definida como um nível de PSA ≥ 0,5 ng /ml em dois sangue empates consecutivos.
espécimes agulha de biópsia.
A biópsia de agulha coorte consistiu de 99 biópsias por agulha de diagnóstico de pacientes que posteriormente receberam ADT primário. A informação da contagem e tratamento de Gleason são apresentados na Tabela S2. As mesmas amostras foram previamente analisados para Ki-67- EZH2 e imuno-[30]. A progressão da doença foi definida por medições de PSA em dois sangue empates consecutivos sendo 25% acima do ponto mais baixo com um aumento absoluto de ≥ 2 ng /ml acima nadir ou o desenvolvimento de novas metástases [30,31].
amostras CRPC localmente recorrente .
a ressecção transuretral da próstata (RTU) espécimes de 105 homens com evidência de progressão da doença durante a ADT. tratamento informação é mostrada na Tabela S2.
metástases CRPC.
Cento e treze metástases CRPC foram coletados de 32 pacientes que morreram de CRPC e submetidos a autópsia rápida. Todos os pacientes tinham sido tratados com ADT. Os mesmos metástases também foram analisadas para Ki-67 e EZH2 [25].
coorte Prostatectomia para qRT-PCR analisa.
Setenta e seis espécimes de prostatectomia recém congelados contendo um mínimo de 70% As células cancerígenas foram utilizadas para análise de qRT-PCR. As características da coorte estão apresentados na Tabela S1. TRI-reagente (Molecular Research Center Inc., Cincinnati, OH, EUA) foi utilizado para isolar o ARN total a partir de amostras clínicas recém-congelados e linhas celulares de acordo com as instruções do fabricante.
-RNA Sequenciação coortes.
dados a partir de material tumoral recém-congelados de 12 a hiperplasia prostática benigna (BPH) amostras, 28 espécimes de hormona-naïve prostatectomia e 13 CRPC [32], bem como 301 amostras, incluindo 251 amostras cancerosas e 45 amostras de tecidos normais adjacentes do Cancer Genome Atlas (TCGA) – coorte, foram utilizados para avaliar os níveis de
MSMB
,
NCOA4
e
MSMB-NCOA4
a imuno-histoquímica de expressão.
Todos os FFPE-amostras foram coradas com um anticorpo monoclonal MSMB (ab19070; Abcam, Cambridge, UK), eo prostatectomy- e CRPC-espécimes também foram coradas com um anticorpo policlonal MSMB (4) .Para a coloração , Power Vision
kit + poli-HRP IHC (imunológicos, AD, Duiven, Holanda) foi utilizada de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as amostras foram primeiro desparafinadas e tratadas termicamente em pH 6 citrato trissódico-tampão, contendo 0,05% de Tween. As secções foram incubadas durante a noite com o anticorpo primário diluído. Para o anticorpo MSMB comercial derivadas de ratinho, as amostras foram bloqueadas em solução de pós-bloqueio e foram então incubadas com poli-HRP solução. Sistema de Detecção de UltraVision (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA) foi utilizado para a visualização do anticorpo primário ligado. O controlo negativo sem o anticorpo primário foi incluído em todas as colorações. As lâminas foram digitalizadas com Aperio ScanScope XT digitalizador (Aperio Technologies, Inc., Vista, CA, EUA). O escore foi realizado de forma cega utilizando um microscópio virtual (https://jvsmicroscope.uta.fi). foi avaliada a intensidade ea porcentagem da área do tumor coradas. Expressão de MSMB foi considerada elevada quando 20% ou mais de todo o tecido tumoral foi corado com uma intensidade de, pelo menos, um de uma escala de intensidade de 0-3. Os valores médios de Ki-67 definido baixa e alta expressão de Ki-67. expressão EZH2 foi definida como alta quando o 50% das células tumorais foram coradas
qRT-PCR para
MSMB
,
NCOA4
e
MSMB-NCOA4. Comprar e sequenciação do
MSMB-NCOA4
o ensaio SYBR Green (Thermo Fischer Scientific Inc., Waltham, MA, EUA) foi utilizado de acordo com o protocolo do fabricante para detectar a expressão de mRNA níveis de
MSMB
,
NCOA4
e
MSMB-NCOA4
de fusão. As sequências para os iniciadores foram obtidos a partir de Lou et al. [28]. ciclos térmicos foram os seguintes:.. 95 ° C durante 5 min, 95 ° C durante 10 s, temperatura de recozimento 59 ° C (para
MSMB
), 62 ° C (para
NCOA4
) e 59,5 ° C (para
MSMB-NCOA4
) durante 30 segundos. e 72 ° C durante 20 seg. O gene que codifica a proteína de ligação a caixa de TATA- (
TBP
) foi utilizado para normalização. Finalmente, -produtos de PCR foram separados em geles de agarose a 1% para confirmar a especificidade da reacção. O
MSMB-NCOA4
produto de fusão foi sequenciado para confirmar a presença de fusão. Para a sequenciação, -produtos de PCR foram extraídos a partir do gel e purificado com um kit QIAquick (QIAGEN Inc., Valencia, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Produto de PCR purificado foi clonado usando um kit de clonagem TOPO-TA (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). Um kit de sequenciação com terminação Big Dye (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) foi utilizado para as reacções de sequenciação. Na análise de dados, os valores médios foram usados como um limite entre a expressão alta e baixa dos níveis de mRNA de
MSMB
,
NCOA4
e
MSMB-NCOA4
.
genotipagem do rs10993994 SNP no DNA da linha germinal e medição dos níveis séricos MSMB
a medição dos níveis MSMB soro e genotipagem de rs10993994 foram realizadas a partir de 369 pacientes de PC e 903 adultos do sexo masculino pareados por idade (± dois anos) indivíduos controle encaminhado ao Departamento de Urologia, sem evidências de PC. As características dos casos são apresentados na Tabela S3. O rs10993994 SNP foi genotipados a partir das amostras de DNA que utilizam o sistema do Instituto de Medicina Molecular Finlândia (FIMM) Sequenom MassARRAY (Sequenom Inc., San Diego, CA, EUA). medições de imunoensaio de MSMB foram conduzidas no sistema de imunoensaio automática AutoDelfia 1235 (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA) no laboratório do Dr. Lilja na Wallenberg Laboratórios de Pesquisa, do Departamento de Medicina Translacional, Universidade de Lund, Hospital Universitário de Skåne, Malmö, na Suécia, como descrito anteriormente [20,33,34]. PSA livre e total foram medidos utilizando o duplo-label total de DELFIA Prostatus /free PSA-Assay (PerkinElmer, Turku, Finlândia) [35] calibrado contra o WHO 96/670 (PSA-OMS) e da OMS 68/668 (PSA livre OMS) normas. Todas as medições de ensaio foram realizados com amostras cegos para o resultado.
Análise estatística
O teste exato de Fisher, o teste do qui-quadrado, Mann-Whitney U-test e testes t desemparelhados foram usadas para analisar a associação entre MSMB,
MSMB
,
NCOA4
e
MSMB-NCOA4
expressão e diferentes variáveis clínico-patológico e expressão. testes t pareados foram utilizados para analisar as diferenças entre os níveis de
MSMB,
NCOA4
e
MSMB-NCOA4
expressão. A análise de Kaplan-Meier de sobrevida livre de progressão foi utilizado para analisar o significado prognóstico da expressão MSMB em diferentes grupos com o teste de Mantel-Cox. O teste exato de Fisher e Kappa-teste foram aplicadas quando a comparação de resultados obtidos utilizando o anticorpo MSMB comercial e aqueles obtidos com a nossa anticorpo MSMB policlonal. O U-teste de Mann-Whitney foi utilizado para comparar os níveis séricos de MSMB e PSA entre os pacientes de PC e controles. Os dados foram analisados com a análise de covariância (ANCOVA) para examinar a associação dos níveis de PC e MSMB soro, ajustado para idade no momento do diagnóstico e PSA livre ou PSA total. Ambas as variáveis MSMB e PSA foram log transformados. A análise de regressão logística foi realizada, também com SPSS, para estudar a associação entre o nível de risco MSMB soro e PC indicado pelo escore de Gleason eo estágio de PC. correlação de Spearman foi utilizado para estudar correlação entre os níveis de PSA livre, total e livre para totais e o nível MSMB no sangue de pacientes e controles. O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para analisar a associação entre nível MSMB soro e o genótipo do rs10993994 SNP. correlação de Spearman foi utilizado para analisar correlação entre o nível MSMB soro e idade no momento do diagnóstico.
Resultados
Comparação dos anticorpos monoclonais e policlonais MSMB
amostras CRPC
prostatectomia e localmente recorrente foram coradas tanto com um anticorpo policlonal de coelho MSMB como descrito por Abrahamsson et ai. [4] e um anticorpo monoclonal MSMB comercial (ab19070, Abcam, Cambridge, UK). Tanto a intensidade de coloração e a área do tecido canceroso foram avaliadas em conseguir com expressão MSMB definida como positiva quando 20% ou mais da área do tumor tinha intensidade de coloração de 1 a 3. Resultados da coloração com o anticorpo monoclonal e anticorpos policlonais foram semelhantes. Oitenta por cento das amostras de prostatectomia manifestando expressão de baixo nível MSMB coradas com o anticorpo policlonal MSMB também mostraram baixa expressão MSMB nível quando coradas com o anticorpo monoclonal (κ = 0,559,
p Art 0,0001; Tabela 1). Em amostras CRPC, os resultados de coloração foram ainda mais consistentes entre os anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais MSMB (k = 0,77,
P
0,0001; Tabela 1). Devido à natureza coerente do coloração, todas as outras amostras foram coradas apenas com o anticorpo monoclonal.
e prostatectomia amostras CRPC localmente recorrentes foram coradas com um anticorpo policlonal de coelho MSMB (33) e um anticorpo monoclonal comercial MSMB ( ab19070, Abcam, Cambridge, UK).
espécimes de prostatectomia
MSMB foi heterogênea expressas no citoplasma do epitélio da próstata maligno com diferenças de intensidade distintos observados nas glândulas cancerosas separadas da mesma espécime. glândulas benignas eram comumente coradas com alta intensidade, enquanto as glândulas cancerígenas apenas raramente mostrou alta intensidade de coloração e expressão MSMB era comumente baixa (Fig 1). MSMB foi expresso a um nível elevado em 29% (75/261) do tecido canceroso em espécimes de prostatectomia. lesões cancerosas teve intensidade de coloração de 0 em 89% (166/186) dos espécimes de prostatectomia, que foi definida como baixa expressão nível de MSMB. expressão MSMB tendem a ser inversamente associado com a pontuação de Gleason, mas não com o grau de Gleason (
p
= 0,0544 e 0,1669, respectivamente, Tabela 2). expressão alta MSMB foi observada em casos 52/178 (29%) das amostras PT2 e 21/82 casos (26%) em amostras PT3 (Tabela 2). Não houve associação entre os níveis de expressão MSMB e PSA diagnóstico ou entre a expressão MSMB e idade (
p
= 0,8248; 0,2563, respectivamente; Tabela 2).
(A) de alta, média e baixa MSMB coloração no tecido da próstata normal. (B) de alta, média e baixa coloração MSMB no tecido de câncer de próstata.
Estes resultados são baseados em IHC-análise de diferentes coortes.
Apesar de não haver significativa associação entre a expressão MSMB e expressão EZH2, expressão EZH2 tendeu a ser maior em amostras expressam baixos níveis de MSMB (
p
= 0,1040; Tabela 2). Não houve associação entre a expressão de MSMB e expressão do marcador de proliferação Ki-67 (
p
= 0,2208; Tabela 2) ou com tempo de recorrência bioquímica (
p
= 0,8997; S1 Fig ).
espécimes agulha de biópsia
as secções de tecido de biópsias de agulha de diagnóstico representada uma coorte de pacientes idosos e /ou doença mais avançada no momento do diagnóstico do que o coorte prostatectomia, e que recebeu ADT primário. Vinte e um dos 99 (21%) das amostras de biópsia expressa MSMB a um nível elevado (Tabela2), sem associação entre a expressão MSMB e pontuação de Gleason ou T-estágio (
p
= 0,7869; 0,8097, respectivamente; Tabela 2). Da mesma forma, não houve associação entre a expressão MSMB ea expressão de EZH2 ou Ki-67 (
p
= 0,4849 e 0,4055, respectivamente; Tabela 2). Além disso, casos com elevado em comparação com baixa expressão MSMB não mostrou diferença no tempo de progressão bioquímica por análise de Kaplan-Meier (
p
= 0,5621; S1 Fig).
localmente recorrente espécimes CRPC
expressão MSMB foi alta em apenas 9% (9/105) das amostras CRPC localmente recorrentes (Tabela 2), sem associação entre a expressão da MSMB e EZH2 ou Ki-67 (
p
= 0,1024; 0,1545, respectivamente;. Tabela 2)
metástases CRPC
expressão alta MSMB foi observada em 9% dos casos (3/32) (Tabela 2). Uma destas três pacientes tiveram alta expressão MSMB no 1 de 2 de suas metástases. Outro paciente teve alta expressão MSMB em três de cinco das metástases, e o terceiro paciente, em três de quatro das metástases. MSMB foi expresso a um nível elevado em 6% (7/112) de todas as metástases (Tabela 2). expressão MSMB não foi associada com a expressão de Ki67 ou com EZH2 (
p
= 0,2412 e 0,3295, respectivamente; Tabela 2).
MSMB
,
NCOA4 Comprar e
MSMB-NCOA4
fusão
em primeiro lugar, transcrições de
MSMB
,
NCOA4
ea fusão de
MSMB-NCOA4
foram medidos por qRT-PCR em ARN isolado a partir de tecido canceroso de uma coorte de pacientes com PC clinicamente localizado tratados com prostatectomia (n = 76). Os dados apresentaram distribuição não-Gaussiana, com a maioria das amostras com
expressão abaixo- média MSMB
e apenas 25% (19/76) das amostras manifestando MSMB-expressão acima da média.
NCOA4
foi expresso a um nível elevado em 41% (31/76) das amostras e altos níveis de
MSMB-NCOA4
fusão foi encontrado em 32% (23/73) do amostras (Tabela 3). A expressão de
MSMB-NCOA4
transcrições de fusão foi correlacionada com a expressão de
MSMB
(Pearson r = 0,5092,
p Art 0,0001; Fig 2).
MSMB
expressão tende a ser menor em grau do tumor maior, mas os níveis de
MSMB
,
NCOA4
, eo
MSMB-NCOA4
fusão de expressão transcrição não foram significativamente associados com a pontuação de Gleason (
p
= 0,0913; 0,2577 e 0,1963, respectivamente), a PT-stage (
p
= 0,2760; 0,4819; e 1.000, respectivamente, Tabela 3) ou tempo de recorrência bioquímica (
p
= 0,3862; 0,4126 e 0,5940, respectivamente;. S2 Fig)
MSMB
expressão foi positivamente correlacionada com a expressão de
MSMB-NCOA4
.
Estes resultados são baseados em Q-RT-PCR-análise. Meio dos valores normalizados foram utilizados como um valor de corte entre alta e baixa expressão de
MSMB
,
NCOA4
e
MSMB-NCOA4
. Idade refere-se à idade no momento do diagnóstico.
Em segundo lugar, a detecção de
MSMB
,
NCOA4
e
MSMB-NCOA4
transcrições de fusão foi avaliada utilizando ARN-SEQ em duas coortes; um contendo 12 HBP, 28 PC hormona-naïve, e 13 amostras CRPC [32], bem como um segundo TCGA-coorte que consiste de 301 tumores de adenocarcinoma da próstata. No geral, a expressão de
MSMB-NCOA4
foi baixa e expressão foi observada mais freqüentemente em PC do que no tecido HBP, embora os baixos níveis de expressão foram detectados em 2 das amostras de 12 BPH (Fig 3). Na amostra que expressou
MSMB-NCOA4
ao mais alto nível, apenas 2,2% das transcrições a partir do
MSMB
promotor formada uma transcrição com
NCOA4
(Fig 3B ).
NCOA4
foi expressa em um nível significativamente inferior ao
MSMB
em ambas as coortes (Fig 3 e S3 FIG).
(A)
MSMB
foi expressa em nível superior ao
NCOA4
. painel (B) inferior mostra a percentagem de
MSMB-NCOA4
lê a partir do total de leituras de
MSMB
e
MSMB-NCOA4
.
NCOA4
foi expresso em nível inferior ao
MSMB
. A porção de expressão do gene de fusão foi de 2,2% na mais alta, para fora da soma de MSMB e MSMB-NCOA4 lê. Eixo Y representa contagem leitura normalizada.
Os níveis séricos de MSMB e SNP rs10993994
Não houve correlação significativa entre os níveis MSMB no soro e idade ao diagnóstico de pacientes de PC (Spearman r = 0,1550) ou idade na coleta de sangue entre os controles (Spearman r = 0,1876; S4 Fig). Em casos de PC, o nível mediano de MSMB no soro (23,0 ng /ml; intervalo interquartil (IQR) 15.9) não foi diferente (
p
= 0,2422) do que nos controles (21,8 ng /ml; IQR 15,3 ; Tabela 4). No entanto, quando ajustada por idade e PSA livre ou total no momento do diagnóstico, houve uma associação significativa entre o risco de PC e os níveis séricos de MSMB na análise de covariância (
p Art 0,001; Tabela 5). níveis MSMB foram maiores nos controles (o nível significa MSMB foi de 29,7 ng /ml quando ajustada por idade e PSA total no momento do diagnóstico e 29,2 ng /ml quando ajustada por idade e PSA livre no momento do diagnóstico) em comparação com pacientes de PC (o nível significa MSMB foi 21,1 ng /ml quando ajustada por idade e PSA total no momento do diagnóstico e 22,4 ng /mL quando foi ajustada por idade e PSA livre no momento do diagnóstico) (Tabela 5). Além disso, o nível MSMB soro foi associado com o risco indicado pelo escore de Gleason e com o estágio clínico no momento do diagnóstico (S4 Table), com a associação restante significativo na não-metastáticos ou metastáticos casos isolados. Além disso, os pacientes de PC tinha um rácio significativamente menor livre /PSA total em comparação com os controles (
p Art 0,0001; Tabela 4). Havia uma embora fraca correlação positiva estatisticamente significativa entre os níveis de MSMB e PSA livre, bem como entre MSMB e PSA total no soro de casos de câncer (Spearman r = 0,3990 e 0,3200, respectivamente) e nos controles (Spearman r = 0,3421 e 0,2710, respectivamente),
p Art 0,0001 em todos (S5 Fig), e associação significativa entre a taxa de PSA free-to-total e os níveis séricos de MSMB em casos e controles (Spearman r = 0,2142; r = 0,1351, respectivamente),
p
. 0,0001 em todos (S5 Fig)
Entre os pacientes de PC, os níveis MSMB no soro não foram associados com o escore de Gleason em prostatectomia ou biópsias (
p
= 0,6621; 0,819, respectivamente; Tabela 6), mas MSMB níveis séricos e pT-estágio (
p
= 0,0288) e idade no momento do diagnóstico (
P
= 0,0452) tendem a ser fracamente associada, em casos de prostatectomia (Tabela 6). A análise de Kaplan-Meier mostrou nenhuma associação entre o nível MSMB soro e tempo de recorrência bioquímica em pacientes tratados com prostatectomia ou radioterapia (
p
= 0,1396; 0,1925, respectivamente; S6 Fig) ou pacientes tratados com hormonas (
p
= 0,2070;. S6 Fig)
em contrapartida, houve uma forte associação entre os níveis MSMB baixas no soro e no genótipo TT risco da rs10993994 SNP de ambos os casos de câncer e controles (
p Art 0,0001; 0,0001, respectivamente; Fig 4). No entanto, a rs10993994 SNP não foi associado com pontuação de Gleason na biópsia ou prostatectomia espécimes ou com a PT-estágio em prostatectomia (
p
= 0,7959; 0,4683; 0,3584, respectivamente; Tabela 7). Embora a frequência de genótipo TT tendem a ser ligeiramente mais elevado nos casos de câncer (15%) em comparação com os controles (12%), não houve associação com o genótipo de rs10993994 eo risco de câncer neste grupo (
p
= 0,5114 ; Tabela 7)
O genótipo do nível de rs10993994 e MSMB SNP no sangue de () pacientes de um PC e) os controlos (B.. nível MSMB menor foi associada com T-alelo do SNP rs10993994. teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para comparar os diferentes grupos. Linhas representa o nível MSMB média dos diferentes genótipos. *** denota
p
. 0,0001
Discussão
Neste trabalho, estudamos o papel potencial da MSMB /
MSMB Twitter /
MSMB-NCOA4
como biomarcadores de PC em coortes correspondentes a diferentes fases do PC a partir do início de doença avançada. Nós mostramos que a expressão MSMB é reduzida em PC mais avançado, sendo menor no CRPC. Os baixos níveis de proteína MSMB em CRPC foram consistentes com os nossos dados RNA-seq indicando baixa
MSMB
níveis de transcrição no CRPC em comparação com amostras de PC. O achado de diminuição da expressão de MSMB /
MSMB
no PC em comparação com o de próstata não maligno, bem como a associação da perda de expressão com a doença mais avançada e de maior Gleason-score, é consistente com várias publicações anteriores [5-7]. No entanto, casos CRPC não foram minuciosamente estudados antes. Dahlman et al., [23] estudaram a expressão MSMB em 3 metástases CRPC e encontrou
MSMB
baixos níveis de transcrição. Aqui, mostramos que ambos os níveis de transcrição e proteínas MSMB são baixos em CRPC com apenas 9% dos casos CRPC expressando MSMB.
Em nosso estudo, a proteína MSMB ou níveis de mRNA não foram associados com o prognóstico em prostatectomia ou ADT – pacientes tratados. Algumas publicações anteriores demonstraram uma associação entre baixo MSMB e mau prognóstico no PC [7,11], enquanto outros demonstraram alta MSMB ou
níveis de transcrição MSMB Comprar e mau prognóstico [12,36]. Pode haver várias razões para os resultados discordantes. coortes de pacientes variam. Aqui, usamos três coortes: (a) uma coorte prostatectomia de 261 casos com um seguimento médio de 7,3 anos, (b) uma coorte prostatectomia de 76 casos com um seguimento médio de 5,2 anos e (c) uma coorte principalmente de ADT-tratados pacientes com um seguimento médio de 3,6 anos. Coortes A e C foram utilizados para a detecção imunohistoquímica da proteína MSMB e coorte b para medição de qRT-PCR de
MSMB
transcrição. Consistentemente, nenhum dos grupos mostrou valor prognóstico de MSMB /
MSMB
. Uma variável putativo é o anticorpo utilizado para a imunocoloração. Foram testados dois anticorpos comumente utilizado, um anticorpo monoclonal e um anticorpo policlonal. Eles deram padrões de coloração altamente concordantes. Assim, os anticorpos não são susceptíveis a causa dos dados discrepantes.
Uma transcrição de fusão de leitura através de
NCOA4
e
MSMB
foi recentemente demonstrada em alguns tipos de câncer de próstata [27,28]. Assim, o nosso objectivo de medir a expressão do transcrito de fusão em amostras clínicas.