Sumário

o fosfato inorgânico (Pi) é exigido por todos os organismos vivos para o desenvolvimento de órgãos tais como o osso, músculo, cérebro e pulmões, que regula a expressão de vários genes críticos, bem como transdução de sinal. No entanto, pouco se sabe sobre os efeitos do consumo Pi alimentar prolongada sobre a progressão do câncer de pulmão. Este estudo investigou os efeitos de uma dieta rica em fosfato (HPD) em um mouse modelo de adenocarcinoma. K-ras ratinhos

LA1 foram alimentados com uma dieta normal (0,3% pi) ou um HPD (1% pi) durante 1, 2, ou 4 meses. Os ratos foram sacrificados e submetidos a indutivamente acoplado massa de plasma /espectrometria de emissão ótica e laser ablação analisa com plasma indutivamente acoplado espectrometria de massa, análise de western blot, histopatológico, imuno-histoquímica e imunocitoquímica análises para avaliar a formação e progressão tumoral (incluindo proliferação celular, angiogênese, e apoptose), alterações nos níveis de íons e metabolismo, autofagia, transição epitelial-a-mesenquimal e tradução da proteína nos pulmões. Um HPD tumorigénese acelerada, tal como evidenciado por um aumento da taxa de adenoma e adenocarcinoma, bem como o tamanho do tumor. No entanto, após 4 meses de o HPD, a proliferação celular foi preso, e aumentos dos níveis de fígado e de iões de pulmão e na produção de energia através foram observados no ciclo do ácido tricarboxílico no fígado, os quais foram acompanhados por aumento autofagia e diminuição da angiogénese e apoptose marcada. Estes resultados indicam que um HPD promove inicialmente, mas mais tarde inibe a progressão do cancro do pulmão por causa da adaptação metabólica que conduz à quiescência celular tumoral. Além disso, os resultados sugerem que o consumo de Pi cuidadosamente regulado são eficazes na prevenção do câncer de pulmão

Citation:. Lee S, Kim J-E, Hong S-H, Lee A-Y, Parque E-J, Seo HW, et al. (2015) Fosfato alta Inorgânica Intake Promove Tumorigênese em estágios iniciais em um mouse modelo de cancro do pulmão. PLoS ONE 10 (8): e0135582. doi: 10.1371 /journal.pone.0135582

editor: Libing Song, Sun Yat-sen University Cancer Center, CHINA

Recebido: 16 de fevereiro de 2014; Aceito: 24 de julho de 2015; Publicação: 18 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Lee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento: Parte deste trabalho é apoiada pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Ciência, TIC Planejamento Futuro (2012M3A9C4048819). M. H. Cho também foi parcialmente financiado pelo Instituto de Pesquisa para a Ciência Veterinária da Universidade Nacional de Seul. experimentos LA-IPC-MS foram realizadas com o apoio do Conselho Australiano de Pesquisas, Agilent Technologies, e Kenelec científica como parte do programa Projetos Linkage (LP100200254). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O fosfato inorgânico (Pi) é exigido por todos os organismos vivos para diversas funções-incluindo celulares metabolismo mineral ea produção de energia a partir de fosfolipídios de membrana e nucleotídeos e como substrato para os intermediários fosforilada em sinalização celular [1]. Pi pode ser adquirido de forma passiva através da ingestão de alimentos ou ativamente através do metabolismo celular. Ele é frequentemente usado como aditivo alimentar não por razões de saúde, mas para funções como manter a cor dos alimentos eo sabor, buffering ácido, fermentação, estabilização de textura, e prolongamento da vida útil. A gama de produtos alimentares contêm Pi, incluindo caju, amêndoas, bacon, conservas de peixe, leite evaporado, queijos processados, o fermento em pó, fermento de padeiro, ovos, lentilhas e bebidas isotônicas e cola [2]. Pi consumo humano está a aumentar devido à disponibilidade destes alimentos; estudos indicam que o uso de Pi em aditivos alimentares tem vindo a aumentar, enquanto a ingestão de Pi aumentou em quase 17% nas últimas décadas [3].

Os últimos relatórios sugerem que a ingestão anormal Pi está intimamente relacionada com a ocorrência de vários tipos de cancro [4]. Pi também desempenha um papel crucial na regulação de genes durante o ciclo celular, assim como na transdução de sinal e controlo de transcrição in vitro [5]. Além disso, foi mostrada uma dieta rica em fosfato (HPD) para promover a tumorigénese pulmão através Akt alterada sinalização [6]. No entanto, não houve estudos até à data avaliando a manutenção da homeostase nos pulmões em relação a um HPD ou o papel de Pi na adaptação metabólica e progressão do cancro, que envolve autofagia, a apoptose, a regulação do nível de íons, e trifosfato de adenosina síntese (ATP) via o ácido tricarboxílico (TCA) ciclo. O presente estudo investigou os efeitos do alto consumo de Pi na progressão do câncer de pulmão e os mecanismos subjacentes no K-ras

camundongos LA1, em que a activação constitutiva dos oncogene K-ras leva ao desenvolvimento de adenocarcinoma de pulmão. Os resultados indicam que um HPD inicialmente promove mas depois inibe a progressão do câncer de pulmão, como resultado da adaptação metabólica que conduz à quietude de células tumorais.

Materiais e Métodos

Animais e dieta

os métodos utilizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê animal Care and Use na Universidade Nacional de Seul (SNU-120904-3-2). Os experimentos foram conduzidos em 5 semanas de idade K-ras do sexo masculino

camundongos LA1 obtidos a partir do Consórcio Humano do Câncer do Instituto Nacional do Câncer (Frederick, MD, EUA). Os animais foram mantidos numa instalação de laboratório a uma temperatura normal de 23 ° C ± 2 ° C e uma humidade relativa de 50% ± 10% sob um ciclo de 00:12 horas de luz /escuro. Um total de 36 ratinhos foram distribuídos aleatoriamente em seis grupos de seis ratos cada um; metade dos ratinhos (1, 2, e 4 grupos mês) foram alimentados com dieta a base de 93 um Instituto padrão americano do Nutrition (AIN) contendo 0,3% de PI (dieta normal, ND), enquanto a outra metade (1, 2, e grupos de 4 meses) receberam a mesma dieta suplementada com 1,0% Pi (HPD). A composição da dieta AIN-93G purificado roedor modificado [7] é mostrada na Tabela 1. O peso corporal, bem como a quantidade de sedimento e o volume de água consumida, foi medida uma vez por semana. Depois de 1, 2, ou 4 meses de dieta, os ratos foram anestesiados com 15 mg /kg de Zoletil (Laboratórios Virbac, Carros, França) e 3 mg /kg de xilazina (Laboratórios Calier, Barcelona, ​​Espanha), e perfusão transcardial foi realizada . Durante a autópsia, o cérebro, o timo, coração, pulmão, fígado, baço, rins e testículos foram removidos. Tumores na superfície todo o pulmão foram contadas, e os diâmetros das lesões foram medidos com paquímetro digital sob um microscópio, como descrito anteriormente [8].

O exame histopatológico, imuno-histoquímica e imunocitoquímica

Tissue As amostras foram fixadas em 10% de formalina tamponada, embebidos em parafina e cortada a uma espessura de 5 mm, com secções recolhidas em lâminas de vidro carregadas (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA). Para análise histopatológica, as secções foram desparafinadas e re-hidratadas em xileno através de uma série gradual de álcool, em seguida, coradas com hematoxilina e eosina (H E; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA). Para imuno-histoquímica, os cortes foram desparafinados em xileno e re-hidratadas através de uma série gradual de álcool, lavou-se e, em seguida, incubadas em 3% de peróxido de hidrogénio (Applichem, Darmstadt, Alemanha) durante 30 minutos para extinguir a actividade da peroxidase endógena, e depois lavadas em fosfato tamponado solução salina (PBS) e incubou-se com 3% de albumina de soro bovino em Tris /solução salina tamponada com Tween durante 1 h à temperatura ambiente para bloquear a ligação não específica. Os anticorpos primários contra o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) (PC10, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) e caspase-3 (# 9662S; Abcam, Cambridge, MA, EUA) foram aplicados a seções em 1: 200 e 1 : 1000 diluições, respectivamente, durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, as secções foram lavadas e incubadas com anticorpos de peroxidase de rábano conjugado secundário (1:50) durante 1 h à temperatura ambiente. Após a lavagem, as secções foram contrastadas com hematoxilina de Mayer (DakoCytomation, Carpinteria, CA, EUA) e lavou-se com xileno, e montadas utilizando Permount (Fisher Scientific). As lâminas foram vistos com um microscópio de luz (Carl Zeiss, Thornwood, NY, EUA). Para imunocitoquímica, os núcleos foram coradas com 1 ug /ml de DAPI depois de bloqueio e lavar três vezes com PBS. Um anticorpo contra a proteína da cadeia leve 1A /1B associada a microtúbulos (LC) 3 foi aplicado a 1: 400 de diluição durante a noite a 4 ° C. As secções foram lavadas, incubadas com anticorpo secundário conjugado com isotiocianato de fluoresceína, e, em seguida, montadas em lâminas de vidro, utilizando meio de montagem aquoso Faramount (DakoCytomation). intensidade da coloração foi avaliada através da contagem do número de células positivas em campos selecionados aleatoriamente usando um contexto de software versão 3.01 (Pixera, San Jose, CA, EUA).

análise de Western blot

concentração de proteína total em amostras de pulmão homogeneizados foi determinado utilizando o reagente de ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Western blotting foi realizado de acordo com um procedimento previamente descrito [9], utilizando anticorpos contra as proteínas seguintes: acetil coenzima (Co) A (# 3676), fosforilado (p) acetil-CoA (# 3661), LC3 (# 2275), autofagia proteínas (ATG) 5 (# 2630), fosforilada (p) -p70 S6 Kinase

Thr389 (# 9205), 4EBP1 (# 9644S) e p-Akt

Thr308 (# 2965) (todos da Cell Signaling tecnologia, Danvers, MA, EUA); succinato complexo desidrogenase, subunidade A (SdhA) (ab14715) e citocromo c oxidase subunidade (COX) -IV (ab33985) (ambos a partir de Abcam); citocromo c (A-8), Rieske (A-5), linfoma de culas B (BCL) -2 promotor morte (C-2), Bcl-2 associada (mau) (C-7), Bcl-2- associada proteína X (Bax) (B-9), eIF4E (P-2), factor de crescimento de fibroblastos (FGF) -2 (147), antigénio nuclear de células em proliferação (PCNA) (PC10), N-caderina, e actina (I -19) (todos da Santa Cruz Biotechnology); e da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (LF-PA0212; AbFrontier, Seul, Coreia do Sul). bandas de proteínas foram detectadas utilizando o LAS-3000 analisador de imagem luminescente (Fujifilm, Tóquio, Japão) e quantificado usando a versão multi calibre 2.02 software (Fujifilm).

qRT-PCR análise

qRT-PCR a análise foi realizada através do isolamento de ARN utilizando ARN total foi isolado utilizando o kit de ARN QuickGene (Sistema de Ciências da vida da Fujifilm, Tóquio, Japão). DNA complementar foi produzido com a SuPrimeScript RT Premix (Genet Bio, Cheonan, Coréia). As reações foram criadas em triplicado com o primeiro-Q-Mastermix (Genet Bio) e executado em CFX96T sistema em tempo real (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). As expressões de genes são apresentados como a expressão relativa à actina. As sequências dos iniciadores que foram utilizados para a qPCR foram como se segue rato E-caderina, para a frente (5′-TCGAGGAAATCTGCATTCATACTC-3 ‘), reverso (5′-TCTCCGCTGCCATTTCTAAC-3’), de ratinho β-actina, para a frente (5 ‘ – TTTCCAGCCTTCCTTCTTGGGTATG-3 ‘), e reverter (5’CACTGTGTTGGCATAGAGGTCTTTAC-3’)

Detecção de elementos traço no tecido

A ablação por laser em espectrometria de massa de plasma (LA-ICP. MS) foi realizada utilizando um sistema de ablação a laser New Wave Research UP-213 (Kenelec Technologies, New South Wales, Austrália) equipado com um laser granada de ítrio e alumínio dopado com neodímio que emite um pulso de laser nanossegundo na quinta harmônica com um comprimento de onda de 213 nm . O laser foi ligado a um 7500ce ICP-MS (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EUA) por tubagem de Tygon. Os detalhes dos métodos analíticos foram previamente publicados [10]. Resumidamente, o feixe de laser foi rastered ao longo da superfície da amostra em linha recta. Os dados foram adquiridos com um tamanho de ponto de laser de 65 mm, laser velocidade de digitalização de 20 mm s

-1 e ICP-MS tempo de integração total de 0,325 s. Para análise elementar ICP-espectrometria de emissão óptica (ICP-OES), amostras de tecidos foram digeridos em ácido sulfúrico e peróxido de hidrogénio. Todos os reagentes químicos eram de grau analítico. Água (resistividade de 18,2 mohms) foi desionizada com um sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EUA). Ácido nítrico (65% v /v) e ácido sulfúrico (95% -97% v /v) (tanto do Samchun Chemical Co., Seul, Coreia do Sul) foi usada para a preparação da amostra. digestão ácida de amostras de tecido foi diluída com água Milli-Q utilizando uma concentração de ácido de 0,2% foi realizada a 70 ° C durante 24 h, seguida de peróxido de hidrogénio (70 ° C) durante a noite a digestão. As concentrações de Mn elementar, Fe, Cu, e Zn foram quantificadas pelo ICP-MS e concentrações de Na elementar, Ca, S e P foram determinados por ICP-OES. condições operacionais para ambos os procedimentos são apresentados na Tabela 2.

A análise estatística

O Student

t

-test foi utilizado para avaliar diferenças entre os dois grupos (GraphPad Software , San Diego, CA, EUA). Asteriscos (*) indicou diferenças estatisticamente significativas ao ND.

Resultados

O elevado consumo de Pi acelera tumorigênese em estágios iniciais em um modelo de cancro do pulmão

Para investigar o efeito da alta ingestão de Pi no crescimento das células do cancro do pulmão, tumores na superfície do pulmão foram medidos em ratinhos e HPD- ND-alimentados (Fig 1A). Todos os ratos alimentados com HPD-exibiram adenocarcinoma progressiva e adenoma, como observado por H E a coloração (Figura 1C). Um alto consumo de Pi induziu o desenvolvimento de câncer de pulmão em períodos de 1, 2 e 4 meses (Tabelas 3 e 4). O número e o tamanho dos nódulos tumorais foram maiores no HPD do que no grupo ND em 1 e 2 meses (P 0,05), apesar de a diferença entre os dois grupos não era estatisticamente significativa em 4 meses (Figura 1B). O volume tumoral também foi maior em ratinhos que consomem uma HPD do que em ratinhos ND, mas apenas nos grupos 2 e 4 meses (Figura 1B). Um exame histopatológico revelou um aproximadamente 2 vezes maior incidência de adenocarcinoma e adenoma nos grupos HPD 1- e 2-mês do que os seus homólogos em ND. No entanto, no grupo de HPD 4 meses, as incidências de adenocarcinoma e adenoma foram comparáveis ​​ao do grupo ND em 4 meses (Tabela 4), o que sugere que a taxa de formação do tumor tinha diminuído neste ponto de tempo.

Ratos (n = 6 por grupo) foram alimentados com uma ND (0,3% de PI) ou HPD (1% pi) durante 1, 2, ou 4 meses. (A) O adenocarcinoma e adenoma no tecido pulmonar. (B) Número total de tumores, número de tumores com diâmetro 1,5 mm, e o volume do tumor em nd- e ratos HPD-alimentados. Os resultados são a média ± desvio padrão (DP) de seis medições independentes. barra de erro representam SD. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001. (C) Os tumores nos pulmões de ratinhos nd- e HPD-alimentado, como visualizado por H E de coloração. Barra de escala:. 100 mm

Alterações no pulmão níveis de íons são induzidas por um HPD

Alterações nos níveis de vários íons foram determinados por ICP-MS , o ICP-OES, e LA-ICP-MS. Em contraste com os ratinhos no grupo ND, os níveis de iões marcadamente mais elevados foram detectados em ratinhos HPD-alimentados: P, S, Fe, Mn, e Zn foram elevados no fígado e dos pulmões, e do nível de Ca foi também mais elevada nos pulmões em quatro meses (Tabela 5 e Figura 2). As diferenças nos níveis de íons de pulmão entre os grupos ND e HPD também foram detectados em 1 e 2 meses, no entanto, mais vivas diferença existia entre o grupo ND e HPD em quatro meses. Estes resultados implicam que a ingestão elevada de Pi durante um período prolongado altera não só a homeostase P, mas também os níveis de outros íons.

LA-ICP-MS analisa representam valores médios obtidos em três ensaios de solução ICP-MS /dados ICP-OES (n = 6 por grupo). A barra vertical na cor graduada de azul para vermelho representa o nível de íons de baixa a alta, respectivamente.

Pi induz a produção de energia através do ciclo de TCA na

fígado

para investigar os efeitos de uma HPD sobre o metabolismo celular, os níveis de CoA total e p-acetil, e complexos de II, III, e IV foram avaliadas por transferência de western. A regulação negativa da expressão de p-acetil-CoA no fígado foi observada no grupo de HPD em relação aos murganhos de controlo aos 4 meses, enquanto que a expressão de acetil-CoA foi quase ausente (Fig 3). Por outro lado, os níveis de complexos de II, III, e IV foram regulados positivamente em 1, 2, e 4 meses no grupo de HPD, em comparação com os do grupo de ND no fígado. Além disso, o nível do complexo de Fe-S Rieske estava aumentada no grupo de HPD em relação ao grupo ND. Estes resultados indicam que a ingestão de alto Pi provoca uma desregulação do metabolismo celular, levando a uma maior produção de ATP.

A expressão de proteínas de p-acetil-CoA, acetil-CoA, SdhA (complexo II), citocromo c (complexo III), COX IV (complexo IV), e Rieske (Fe-S complexo) em relação ao da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) em homogenatos de tecido de fígado de K-ras

ratinhos LA1 alimentado um ND ou HPD durante 1, 2, ou 4 meses (n = 6 por grupo), tal como determinado por western blotting e quantificado por densitometria. Os resultados são a média ± DP. barra de erro representam SD. * P 0,05; ** P 0,01.

Um HPD aumenta a autofagia e de transição epitelial-a-mesenquimal nos pulmões

Os resultados anteriores indicaram que o alto consumo de Pi inicialmente promove mas depois inibe tumorigênese. Para determinar se as mudanças consistentes com supressão de tumor ocorrem como resultado do consumo prolongado alta Pi, foram examinados para marcadores autofagia e epitelial-mesenquimal-a transição (EMT). A expressão do LC3 marcadores autophagosomal e Atg5 foi aumentada nos pulmões dos ratinhos HPD-alimentadas, em comparação com ratos alimentados ND aos 4 meses, conforme detectado por Western blotting (Figura 4A). Em amostras de tecido pulmonar, os sinais LC3 ocasionais foram observados nos grupos HPD 1- e 2 meses por imunocitoquímica (dados não apresentados), enquanto que em 4 meses, o sinal fluorescente foi significativamente maior no HPD do que no grupo ND (Fig 4B ). Além disso, a expressão do marcador de EMT N-caderina foi maior no HPD do que nos grupos de ND, embora a diferença entre as duas condições dietéticas foi maior em 4 meses (Figura 4C). Na análise de qRT-PCR, a expressão do marcador epitelial E-caderina foi menor no HPD do que nos grupos ND (Fig 4D). Estes resultados sugerem que a progressão do tumor é suprimida por um elevado consumo de Pi em fases posteriores devido à activação de autofagia e EMT.

(A) A expressão da proteína do LC3 marcadores autophagy e Atg5 em homogenatos de tecido de pulmão, tal como determinado por Western blotting, utilizando actina como um controlo de carga. (B) a expressão LC3 (verde) em cortes de tecido pulmonar foi avaliada por imunocitoquímica. A imunorreactividade mais elevada foi observada no 4 meses HPD grupo em relação ao grupo de controlo correspondente (ND). Barra de escala: 10 ^ m. (C) A expressão da proteína da EMT marcador de N-caderina em homogeneizados de tecidos de pulmão de K-ras

ratinhos LA1 alimentado um ND ou HPD durante 1, 2, ou 4 meses (n = 6 por grupo), tal como determinado por Western blotting, utilizando actina como um controlo de carga. Os resultados são ± média desvio padrão SD. barra de erro representam SD. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001. (D) Análise de qRT-PCR de marcadores epiteliais, E-caderina. Os resultados são ± média desvio padrão SD. barra de erro representam SD. * P 0,05; *** P 0,001.

consumo de HPD aumenta a tradução da proteína nas fases iniciais de desenvolvimento do tumor

A via mTOR regula a tradução da proteína através de fator de inibição eucariótica 4E ligação fosforilação de proteínas 1 (eIF4E-BP1) eo 70 kDa da proteína ribossomal S6 quinase (p70S6K), afectando assim a proliferação de células tumorais. Um aumento significativo na expressão de eIF4E e p70S6K foi observada em amostras a partir dos 1- e 2-mês grupos HPD em relação ao grupo de controlo (Figura 5). Em contraste, os níveis de ambas as proteínas foram reduzidas em 4 meses no grupo de HPD, em comparação com o grupo ND. Estes dados sugerem que a tradução da proteína foi transitoriamente estimulada por Pi durante as fases iniciais do desenvolvimento do tumor.

A expressão das proteínas relacionadas com a tradução p70S6K, eIF4E, p-4E-BP-1/2, e 4e- BP-1/2 de pulmão homogeneizados de tecidos de K-ras

ratinhos LA1 alimentado um ND ou HPD durante 1, 2, ou 4 meses foi determinado por western blotting e quantificado por densitometria (n = 6 por grupo) em relação ao nível de expressão de actina. Os resultados são ± média desvio padrão SD. barra de erro representam SD. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.

Um HPD estimula a proliferação celular e angiogênese em estágios iniciais de desenvolvimento do tumor

O efeito do Pi na progressão do tumor foi também investigada por avaliar a proliferação celular e angiogênese em K-ras

camundongos LA1. Os níveis de expressão de PCNA e FGF-2-marcadores de proliferação e angiogénese, respectivamente, nos pulmões de ratinhos nos grupos de HPD 1- e 2 meses foram aumentadas, em comparação com aqueles nos grupos ND correspondentes, como determinado por Western blotting (Figura 6A). Em contraste, uma diminuição significativa dessas proteínas foi observada no grupo de HPD 4 meses. Estes resultados foram também confirmados por imuno-histoquímica, a qual revelou uma maior imunorreactividade em amostras de PCNA os 1- e 2-mês grupos HPD do que naqueles a partir do grupo HPD 4 meses (Figura 6B). Estes resultados demonstram que a proliferação de células tumorais e angiogénese foram aceleradas por Pi em fases iniciais, mas que estes efeitos foram suprimidas com o consumo Pi prolongada.

Proliferação e angiogénese foi avaliada em pulmões de K-ras

LA1 os ratos alimentados com uma ND ou HPD durante 1, 2, ou 4 meses (n = 6 por grupo). (A) Expressão de proteínas associadas com a proliferação (PCNA) e a angiogénese (FGF-2) em homogeneizados de tecido pulmonar foi avaliada por Western blotting, utilizando actina como um controlo de carga. (B) As células que expressam PCNA na região do tumor (canto superior direito de cada painel) foram visualizadas através de imuno-histoquímica. Barra de escala: 20 ^ m. Os resultados são ± média desvio padrão SD. barra de erro representam SD. * P 0,05; ** P 0,01.

Pi reduz a apoptose mediada por mitocôndrias nos pulmões

Evasão de apoptose é um fator que contribui para carcinogênese, a progressão do câncer, ea aquisição de resistência à terapia. Para investigar se o consumo Pi afecta a apoptose mediada por mitocôndrias, os níveis de Bad, Bax expressão, proteínas e citocromo C no pulmão foram avaliadas por transferência de Western. Todas as três proteínas foram regulados negativamente nos ratos alimentados com HPD em todos os pontos de tempo (Fig 7A). Além disso, a actividade da caspase-3 na região do tumor também foi reduzido em 1, 2, e 4 meses no grupo de HPD, em comparação com o grupo ND (Fig 7B). Estes resultados indicam que um HPD pode reduzir a apoptose mediada por mitocôndrias nos pulmões de K-ras

ratinhos LA1.

A apoptose nos pulmões foi analisado em K-ras

LA1 ratinhos alimentados com uma ou ND HPD para 1, 2, ou 4 meses (n = 6 por grupo). (A) A expressão das proteínas relacionadas com a apoptose mitocondrial Bad, Bax, e do citocromo C foi avaliada por transferência de Western de homogenatos de tecido de pulmão, com a actina utilizada como um controlo de carga. (B) Análise imunohistoquímica da expressão da caspase-3 na região do tumor. Barra de escala: 20 ^ m. Os resultados são ± média desvio padrão SD. barra de erro representam SD. * P 0,05; ** P 0,01.

Discussão e Conclusão

progressão neoplásica envolve uma perturbação do controle homeostático da proliferação celular, morte celular e reparo do DNA resultante de fatores endógenos ou exposição a substâncias químicas cancerígenas exógenos [ ,,,0],11]. Pi actua como uma molécula de sinalização que regula global de expressão de genes em bactérias, fungos, plantas e, assim como vários tipos de células em animais [12] em processos, tais como minerais ou metabolismo intermediário e transferência de energia. Além disso, o Pi é um componente essencial de fosfolípidos e os nucleótidos, e é necessária para a fosforilação da proteína [13]

A inibição de Na-2b dependente de co-transportador de fosfato suprimiu o crescimento do cancro do pulmão.; A proteína também foi encontrada para ser altamente expressa nos estádios I e III amostras de tecido de cancro do pulmão humano [14]. Num modelo de ratinho de cancro do pulmão, a ingestão de alta Pi tem sido associada a tradução dependente de tampão melhorada, bem como a tumorigénese através da via de sinalização de Akt no cérebro, pulmão, fígado e [6,15-17]. No entanto, os efeitos do consumo prolongado de alta Pi na progressão do câncer pulmonar não foram previamente relatada; este foi investigada neste estudo em K-RAS

LA1 ratinhos alimentados com uma HPD ao longo de um período de 1, 2, ou 4 meses.

Os ratos consumiram uma versão modificada da dieta AIN-93, que carece de Ca e de P. a composição dos peletes foi modificado com base na dieta AIN-93G, substituindo os elementos em falta (por exemplo, por adição de fosfato de sódio para P) para satisfazer ND (0,5% de Ca, 0,3% de P) e HPD (0,5% de Ca, 1% P) condições. O consumo diário de Pi foi aumentada, enquanto ingestão diária de alimentos manteve-se inalterada (Tabela 3). Além disso, não houve diferença no peso corporal entre os grupos de valores medidos e de HPD (S1 FIG). No entanto, marcou mudanças nos níveis de vários iões, incluindo P, foram observados no grupo de HPD de 4 meses, em relação ao grupo ND (Tabela 5).

O fígado é um órgão importante para a digestão assim como o metabolismo de xenobióticos. O sangue que sai do estômago e intestinos passa através do fígado, o que divide os componentes nutricionais [18]. Uma vez que este processo envolve a alterações nos níveis de iões, uma análise quantitativa foi realizada para avaliar as alterações nas concentrações dos vários iões em ratos alimentados com uma HPD. Uma análise do complexo de Fe-S Rieske por LA-ICP-MS revelou mais elevados níveis de Fe e S nos fígados de ratos alimentados com HPD-do que os ratos de controlo que foram provavelmente devido ao aumento do metabolismo celular. O nível de P foi também aumentado em todos os grupos HPD. A ingestão de ião metálico mais elevada aumenta o risco de cancro por estimular a proliferação celular ou inibir supressores de tumor, tais como p53. Por exemplo, citoplasmáticos Ca

2+ actua como um agente mitogénico [19]. ocorrência do cancro também tem sido associada ao aumento da absorção e diminuição do efluxo de Fe [20]. Por outro lado, um alto teor de Fe

3+ nível activa Fe

3 + dependentes de proteínas que aumentam a proliferação das células [21]. Os macrófagos no microambiente tumoral pode acelerar o crescimento do tumor em parte proporcionando células tumorais com Fe [22], enquanto elevada de Fe

3+ níveis podem aumentar o risco de cancro. Alta Zn

2+ níveis pode induzir a perda de potencial mitocondrial e resultam na degradação de Bcl-2 [23]; Zn

2 + desempenha um papel fundamental na regulação negativa genes relacionados com a apoptose, tais como

Bax

,

Bcl-2

, e

survivin

, o que leva a Tumorigênese [ ,,,0],24]. Danos para Bcl-2 é um factor causal em vários cancros, incluindo melanoma, da mama, do pulmão, e cancro da próstata, leucemia linfocítica crónica e [25]. Estes resultados, juntamente com os resultados do presente estudo sugerem que um elevado consumo de Pi durante um longo prazo altera os níveis de iões metálicos específicos e podem induzir a tumorigénese. trabalho adicional está em andamento para determinar o papel exacto destes íons no desenvolvimento e progressão do câncer.

O ciclo TCA é uma via metabólica de geração de energia que começa com a transferência de um grupo acetil-dois de carbono a partir de acetil CoA a oxaloacetato [26]. Complexos de jogo I-IV papéis importantes na respiração celular e a produção de ATP [27]. Descobrimos que a taxa metabólica basal foi maior no HPD do que no grupo ND, sugerindo que o Pi activado o ciclo de TCA no fígado através de um rápido consumo de acetil-CoA. Com efeito, uma HPD induzida a regulação positiva de proteínas associadas a cadeia de transporte de electrões, tais como SdhA, citocromo c, a COX-IV, e Rieske (Figura 3). A maioria dos cancros primários e metastáticos são caracterizadas por um aumento da glicólise, que leva a um aumento de consumo de glucose [28]. glicólise intermediários são usados ​​para a biossíntese de células cancerosas, que, portanto, necessitam de mais ATP do que as células que não se dividem [29]; células cancerosas podem também usar glicólise aeróbica de metabolizar a glucose, um fenómeno conhecido como o efeito de Warburg [28]. Um estudo recente relatou que o retículo endoplasmático enzima ectonucleoside trifosfato difosfohidrolase 5 estimula o consumo de ATP e favorece a glicólise aeróbica, promovendo, assim, a sobrevivência de células de cancro [30]. Os resultados do presente estudo indicam que a alta Pi aciona o metabolismo celular e leva a uma maior produção de ATP.

activação Autophagy é observada tanto sob fome e condições de hipóxia no microambiente do tumor [31]. Autophagy promove a sobrevivência de células sob a fome de nutrientes transiente e a retirada do factor de crescimento [32], em resposta à baixa captação de glicose e a glicólise, o que leva a uma diminuição da taxa de tradução da proteína [33]. Em condições de hipóxia, as células cancerosas apresentam características metabólicas alteradas, como uma regulação positiva da glicólise e oxidativa resposta ao estresse. biossíntese contínuo de lactato a partir de glicose em condições aeróbias representa uma adaptação a condições de hipóxia esporádicos em lesões pré-malignas e promove a dormência de células de câncer [34], em que as células no interior do tumor entrar em um estado de repouso desencadeada pela baixa disponibilidade de nutrientes e hipóxia. autophagic actividade, como evidenciado pela expressão LC3-II, é induzido como uma resposta adaptativa [35], enquanto que a expressão de proteínas específicas EMT está correlacionada com a agressividade do tumor [36]. No presente estudo, assumiu-se que os tumores adaptado para os altos níveis de Pi que prolongaram a estado metabólico baixo consumo de energia, resultando em imobilidade célula de tumor em ratos no grupo de HPD de 4 meses. Durante adaptação metabólica à alta concentração de Pi, as células cancerosas também podem desenvolver resistência aos medicamentos e tornar-se mais agressivo [37]. Aqui, observa-se que a expressão dos marcadores autophagy LC3-II e Atg5, bem como a do marcador EMT N-caderina foi elevada nos pulmões dos ratos do grupo de HPD 4 meses (Figura 4C); este achado é consistente com os de estudos recentes que mostraram que a ativação da autofagia está correlacionada com a adaptação do tumor e um consequente aumento da agressividade do câncer [38].

Outro estudo recente descobriu que a via mTOR-Akt foi activado em aproximadamente 90% das células de cancro do pulmão de células não pequenas, o que confere a sobrevivência e resistência à terapia com [39]. A proteína ribossomal p70S6K regula a tradução da proteína por meio da via mTOR, e a sua inactivação suprime o crescimento das células [40]. Além disso, a tradução e a fosforilação de 4E-BP1, que é expresso numa variedade de malignidades, está estreitamente relacionada com a progressão do tumor. de iniciação da tradução é inibida pela ligação de 4E-BP1 e eIF4E, levando ao recrutamento do complexo de tradução de ARNm [41]. O conjunto do complexo eIF4F é completado pela liberação de hyperphosphorylated 4E-BP1 de eIF4E, que permite a tradução para prosseguir [42]. de iniciação da tradução é o passo limitante da velocidade da síntese de proteínas, e as taxas de conversão são determinadas pelos níveis de proteína eIF4E [43]. No presente estudo, pP70S6K e eIF4E foram altamente expresso nos pulmões de ratinhos nos grupos de HPD 1- e 2 meses, sugerindo que a rotatividade de proteínas e progressão tumoral nestes ratinhos eram mais elevados do que em ratinhos que consomem alta Pi ao longo de um período mais longo