Abstract

Purpose

A instabilidade de microssatélites (MSI) é utilizado para rastrear câncer colorretal (CRC) para a Síndrome de Lynch, e para prever o resultado ea resposta ao tratamento. A técnica actual para a medição do MSI requer ADN a partir de tecidos normais e neoplásicas, e não consegue identificar tumores com específica de reparação de emparelhamentos incorrectos do ADN (MMR) defeitos. Testamos um painel de cinco marcadores mononucleótido repetição quase monomórficas amplificados numa única reacção de PCR multiplex (pentaplex PCR) para detectar MSI.

Experimental Design by

Nós investigamos uma coorte de 213 pacientes com CCR, composta por 114 MMR-deficiente e 99 tumores MMR-proficientes. análise imuno-histoquímica (IHQ) avaliaram a expressão de genes MLH1, MSH2, PMS2 e MSH6. estatuto MSI foi definida por diferenças na quasi-monomorphic faixa de variação (QMVR) de um conjunto de amostras de DNA normais, e medir as diferenças de comprimentos de alelos em ADN do tumor.

Resultados

A amplificação de 426 alelos normais permitiu a optimização da QMVR em cada marcador, e eliminado o requisito de ADN de referência ajustados para definir MSI em cada amostra. Usando ≥2 /5 marcadores instáveis ​​como os critérios de MSI resultou em uma sensibilidade de 95,6% (IC 95% = 90,1-98,1%) e um valor preditivo positivo de 100% (Cl 95% = 96,6% -100%). Detecção de MSH6-deficiência foi limitado utilizando todas as técnicas. A análise dos dados com um painel de três marcador (BAT26, NR21 e NR27) foi comparável em sensibilidade (97,4%) e valor preditivo positivo (96,5%) para o painel de cinco marcador. Ambas as abordagens foram superiores à abordagem padrão para medir a MSI.

Conclusões

Um pentaplex otimizado (ou triplex) PCR oferece um ensaio fácil, robusta, muito barato, altamente sensível e específico para o identificação do MSI no CRC

Citation:. Goel a, Nagasaka T, Hamelin R, Boland CR (2010) An Pentaplex PCR Otimizado para Cânceres que detecta o DNA Mismatch Repair deficiente colorretal. PLoS ONE 5 (2): e9393. doi: 10.1371 /journal.pone.0009393

editor: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de novembro de 2009; Aceito: 03 de fevereiro de 2010; Publicação: 24 de fevereiro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Goel et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O presente trabalho foi apoiado por subsídios SR1 CA 72851 (para CRB) e SR1 CA 129286 (para AG e CRB) a partir do National Cancer Institute, National Institutes of Health, e os fundos do Instituto de Investigação Baylor. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

microssatélites instabilidade (MSI), que é definida como a acumulação de mutações de inserção-deleção de sequências de DNA repetitivas curtas (ou “microssatélites”) é uma característica das células cancerosas com reparo incompatível DNA (MMR) deficiência [ ,,,0],1]. Inactivação de qualquer um dos vários genes MMR, incluindo

MLH1

,

MSH2

,

MSH6

e

PMS2

, pode resultar em MSI. Originalmente, a MSI foi mostrado para correlacionar com defeitos germinativas em genes MMR em pacientes com síndrome de Lynch (LS), onde 90% dos pacientes de câncer colorretal (CRC) exibem MSI [2], [3]. Mais tarde, foi reconhecido que a MSI também ocorre em -12% dos CRCs esporádicos ocorridos em pacientes que não possuem mutações germinativas MMR e MSI nesses pacientes é devido ao promotor de silenciamento induzido por metilação do

MLH1

expressão do gene [4 ]. Determinação do status MSI no CRC tem uso clínico para a identificação de pacientes com defeitos de linha germinativa que predispõem à MMR-deficiência. Além disso, o status MSI tem implicações prognósticos e terapêuticos, porque MSI CRCs normalmente têm um prognóstico melhor, e estes cancros são menos sensíveis à quimioterapia adjuvante com 5-FU [5].

Desde a sua descoberta inicial de mais de uma década atrás , os métodos e critérios para determinar MSI no CRC têm evoluído constantemente. No entanto, ainda existe uma falta de consenso sobre a utilização de vários ensaios de MSI que são mais robusto, baixo custo e resultariam em MSI análises que melhor representa MMR-deficiência em laboratórios em todo o mundo [6]. Em um esforço para unificar análise MSI no CRC, em 1997, um National Cancer Institute (NCI) workshop recomendou usando um painel de referência de cinco marcadores MSI que consistiu de 2 marcadores mononucleotídicos repetição (BAT26 e BAT25) e 3 marcadores dinucleótido de repetição (D2S123, D5S346 e D17S250) [7]. Numa oficina NCI-seguimento, o painel reconheceu algumas das limitações dos marcadores originais, principalmente devido à inclusão das 3 marcadores dinucleotídicos [8]. Em primeiro lugar, foi reconhecido que os marcadores de dinucleótido de repetição foram mais adequado para identificar tumores MSI-L, enquanto que os marcadores de repetição mononucleotídicos eram mais específicos e sensíveis para a determinação da MSI (ou MSI-H) CRCs [9]. Em segundo lugar, devido à natureza dos marcadores polimórficos dinucleotidicos, estes necessária a disponibilidade de tumor, mas não apenas ADN normais correspondentes de cada indivíduo para interpretar os resultados MSI. Demonstrou-se que um painel de cinco marcadores de quase-monomórfica mononucleótido de repetição numa PCR pentaplex obviar a necessidade de ADN normal a partir de cada paciente CRC, e podem oferecer uma melhor especificidade e sensibilidade do que os marcadores de painel NCI-[10].

Infelizmente, apesar dos seus pontos fortes óbvios, a abordagem MSI pentaplex ganhou aceitação limitada para a triagem baseada em MSI dos CRCs. Pode haver várias razões para isso, incluindo uma falta de compreensão clara sobre os aspectos técnicos e validação independente deste ensaio. Este estudo aborda esta preocupação, validando a precisão dos marcadores de tela pentaplex em uma grande série de CRCs MMR-proficientes e deficientes através da análise de perfis de PCR-amplificados de cada marcador em ambas tumor e combinando DNA normal. Aqui, nós demonstramos um ensaio de PCR pentaplex altamente sensível e específico que requer otimização de um tempo de quasi-monomorphic faixa de variação (QMVR) para cada marcador no DNA normal. Os dados mostram que uma optimizado pentaplex ensaio de PCR deve ser o método preferido para a avaliação MSI em laboratórios clínicos e de investigação, uma vez que é rápida, económica, altamente sensível e específico para a detecção de CRCs MMR-deficientes e obvia a necessidade de ADN normais de referência.

consentimento Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os pacientes desde escrito informado e o estudo foi aprovado pelos conselhos de revisão institucional da universidade de Baylor Medical Center, Dallas, EUA; Universidade de Heidelberg, Heidelberg, Alemanha; e do Hospital Universitário Okayama, Okayama, Japão

Tissue espécimes

DNA do tumor e da linha germinal correspondente foi coletada de 213 pacientes diagnosticados com CRC em três instituições diferentes:. 1) Baylor University Medical Center, Dallas , TX, EUA 2) Universidade de Heidelberg, Heidelberg, Alemanha e 3) Universidade de Okayama Hospital, Okayama, Japão. Entre este grupo, 114 tumores foram MMR-deficiente, e incluiu 50 CRCs com perda de MLH1, 48 com perda de MSH2 e 8 casos cada um com a perda exclusiva de proteínas PMS2 ou MSH6. Os restantes 99 casos foram MMR-proficientes.

Protein MMR Imunohistoquímica

Nós examinamos a expressão da proteína de MLH1, MSH2, PMS2 e MSH6 em 213 tecidos tumorais por imuno-histoquímica (IHQ) coloração utilizando DAKO EnVision sistema de HRP-kit de sistema de polímero (Dako Cytomation Inc., Carpinteria, CA). As secções de tecido foram sondadas com diluições apropriadas de anticorpos monoclonais de ratinho contra MLH1 (clone 13271A, BD Pharmingen, San Diego, CA), MSH2 (clone FE11, Oncogene Research Products, Boston, MA), PMS2 (A37 clone, BD Pharmingen San Diego, CA), e proteína MSH6 (clone 44, BD Transduction Laboratories, Lexington, KY). As células tumorais foram marcados negativo para a expressão da proteína MMR apenas se as células epiteliais dentro do tecido do tumor faltava coloração nuclear, enquanto que as células estromais circundantes ainda mostrou coloração positiva.

Microdissecção e DNA amplificação

As secções em série (5 mm) a partir de tecidos normais e tumorais combinados embebidas em parafina fixadas com formalina foram rotineiramente coradas, e regiões normais e tumorais representativos foram identificados por exame microscópico. O DNA genômico foi isolado a partir de tecidos embebidos em parafina usando o QIAamp DNA mini-kit (Qiagen, Valencia, CA) seguintes separação de tumor e tecido normal por microdissection manual.

Pentaplex PCR e Quasi-Monomórfico Variação Range (QMVR ) Definição de análise

MSI foi realizada utilizando alvos de repetição de microssatélites cinco mononucleotídicos (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 e NR-27) em um sistema de PCR pentaplex [10]. As sequências dos iniciadores foram descritos anteriormente, e cada iniciador de sentido directo foi fim-marcado com um dos marcadores fluorescentes: FAM, HEX ou NED [11]. Pentaplex PCR foi realizada num termociclador MJ Research DNA multicycler 200 (Biorad, Hercules, CA). As condições de PCR consistiram em um passo de desnaturação de 15 min inicial a 95 ° C, seguido de 35 ciclos a 95 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 30 s, com uma extensão final a 72 ° C durante 10 min. Os produtos de PCR amplificados foram diluídos com formamida, e executado num Applied Biosystems 3100 Avant capilar automatizada sequenciador de ADN de electroforese. tamanhos alélicas para cada um dos marcadores foram estimadas usando GeneMapper 3.1 software (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Para a determinação e validação da faixa de variação quasi-monomorphic (QMVR) para cada um dos cinco MSI marcadores, perfis de amplificação por PCR foram marcados individualmente, e o tamanho de ambos os alelos foi determinada para cada marcador e para cada tumor individual como descrito anteriormente [11]. Para efeito de cálculo, devido à natureza monomorphic desses marcadores, foram calculados cada tamanho alelo duas vezes em amostras de homozigotos.

Determinação das Variações alélicas no DNA do tumor comparada com DNA normal

Em seguida, investigamos se a disponibilidade de ADN correspondentes a partir de um paciente normal, CRC iria melhorar o desempenho do rastreio de PCR em pentaplex MMR CRCs deficiente. Foram calculadas as diferenças de comprimentos alélicas entre tumor e DNA normal para cada paciente e cada marcador MSI. Em cada caso, considerado o alelo mais curto presente no tumor ou DNA normal para fins de cálculo, utilizando a seguinte fórmula:

(diferença de comprimento alelo) =