Sumário

Fundo

A ciglitazona pertence à classe das tiazolidinodionas família antidiabético e é um ligando de alta afinidade para o receptor γ proliferador de peroxissoma activado (PPARy). Para além da sua actividade anti-diabética, esta molécula mostra eficácia antineoplásica em numerosas linhas celulares de cancro.

Metodologia /Principais Achados

Usando RT4 (derivado de uma classe bem diferenciada I papilares tumor) e T24 (derivado indiferenciadas a partir de um carcinoma de células de grau III) de cancro da bexiga, investigámos o potencial de ciglitazona para induzir a morte celular por apoptose e caracterizados os mecanismos moleculares envolvidos. Em células RT4, a induzida por drogas G2 /M parada do ciclo celular caracterizada por uma sobre-expressão de p53, p21

WAF1 /CIP1 e p27

KIP1 em concomitância com uma diminuição de ciclina B1. Pelo contrário, em células T24, que desencadeou a apoptose

via

vias extrínseca e intrínseca. a paragem do ciclo celular e indução de apoptose ocorreu em concentrações elevadas por meio de vias independentes de activação de PPARy-. Mostramos que

in vivo

tratamento de ratinhos nus por ciglitazona inibe o desenvolvimento de xenoenxerto de cancro da bexiga de alto grau. Identificamos um novo mecanismo pelo qual ciglitazona mata as células cancerosas. Ciglitazona-regulada TRAIL solúvel e ligada à membrana e deixar células T24 TRAIL-resistentes para responder a trilha através de ativação da caspase, receptor de morte via de sinalização e clivagem Bid. Nós forneceram evidências de que a apoptose induzida por TRAIL é parcialmente impulsionado por ciglitazona mediada por down-regulação dos níveis de c-FLIP e proteína survivina através de um mecanismo de degradação dependente de proteassoma.

Conclusões /Significado

Portanto , ciglitazona poderia ser clinicamente relevante como quimiopreventivo ou agente terapêutico para o tratamento de cânceres urothelial alto grau TRAIL refratário

Citation:. Plissonnier ML, Fauconnet S, Bittard H, Lascombe I (2011) antidiabético drogas ciglitazona Induz células alto grau cancro de bexiga da apoptose por meio do aumento da regulação do TRAIL. PLoS ONE 6 (12): e28354. doi: 10.1371 /journal.pone.0028354

editor: Laszlo Buday, da Academia de Ciências da Hungria, Hungria

Recebido: 16 de Agosto de 2011; Aceito: 07 de novembro de 2011; Publicação: 12 de dezembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Plissonnier et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação Ligue Nationale Contre Cancer le (Comité du Doubs). M. L. Plissonnier foi apoiado por uma bolsa da Cancéropôle du Grand-Est. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma urotelial das contas da bexiga para ~ 5% de todas as mortes por câncer em seres humanos. A maioria dos tumores da bexiga (75%) são não músculo-invasivo no momento do diagnóstico e após a terapia cirúrgica local, têm um alto risco de recorrência e uma propensão para o progresso no grau ou estágio [1]. tumores invasivos musculares (25%) apresentam um pior prognóstico [2] uma vez que 50% dos pacientes recaída com doença metastática no prazo de 2 anos de tratamento. Apesar dos avanços com a cirurgia e imuno intravesical e quimioterapia no tratamento de pacientes e, apesar de novos agentes quimioterápicos (inibidores da tirosina quinase, agentes anti-angiogénicos …) são usados, nenhuma melhoria na sobrevida foi observada. Assim, o desenvolvimento de novos esquemas quimioterápicos eficazes e com menos efeitos secundários são absolutamente necessárias para diminuir a morbidade ea mortalidade do carcinoma urotelial.

As tiazolidinedionas (TZD), incluindo rosiglitazona, troglitazona, pioglitazona e ciglitazona são uma classe de insulina sensibilizante drogas. Além disso, a rosiglitazona e a pioglitazona estão actualmente em uso clínico, para o tratamento da diabetes tipo II para milhões de pacientes. Estes TZD são de alta afinidade de ligandos quimicamente sintetizados de proliferador de peroxissoma-Activated Receptor γ (PPARy) [3], [4]. PPARy é um factor de transcrição activados por ligandos da superfamília de receptores nucleares de hormonas. Em adição ao seu papel na regulação conhecida do metabolismo e inflamação, PPARy também tem sido implicado na carcinogénese com base em estudos que mostram a sua capacidade para modular a diferenciação celular, proliferação e apoptose. Para além da sua actividade antidiabética, TZD provocar efeitos inibidores de crescimento

in vitro

em células de câncer de diversas origens de tecidos e

in vivo

[5]. Alguns estudos indicam que a pioglitazona ou troglitazona exibiram atividades antiproliferativos ou pró-apoptóticos contra linhas celulares de cancro da bexiga [6] – [9] e no urotélio de ratos [10]. Apenas um estudo relatou que a ciglitazona exibiu efeitos inibidores sobre o número de células de uma série de linhas de células de carcinoma de células transicionais modelar metastático da bexiga (TSU-PR1 TSU-Pr1-B1 e TSU-Pr1-B2) [6].

a apoptose ocorre

através de dois mecanismos separados ainda que interligados de sinalização: a via de receptor de morte induzida por extrínseca activado por sinais do receptor proapoptotic na superfície celular, e a via mediada por mitocôndrias intrínseca activados por sinais a partir do mitocondriais células [11]. Os principais mediadores da apoptose, as caspases são uma família de cisteína proteases que clivam um conjunto crítico de proteínas celulares próximos resíduos de ácido aspártico específicos.

Entre potenciais tratamentos anticancro eficazes, TRAIL (ligando indutor de apoptose relacionado com o TNFa) é uma promissor agente anti-neoplásico porque induz a apoptose em células cancerosas com apenas efeito desprezível sobre as células normais [12]. TRAIL desencadeia cascata das caspases

através do circuito apoptótico

extrínseca através de interacção com receptores de TRAIL-responsivo morte (DR), tais como DR4 e DR5, que conduz à formação do complexo de sinalização (DISCO) indutores de morte, o recrutamento e activação rápida da caspase 8. em tipo de células I, induzida por TRAIL-R caspase-8 activação resulta diretamente na ativação da caspase jusante e apoptose, enquanto que em células tipo II caspase-8 activação é ineficaz e o sinal deve ser amplificado através de caspase 8-clivagem da proteína Bid pro-apoptótico e a activação da via apoptótica mitocondrial [13] por meio da caspase 9 activação. Ambas as caspases 8 e 9 activar a caspase verdugo 3, que é o principal activador de fragmentação de ADN apoptótico e leva a apoptose de células de cancro [14].

Survivina e FLICE proteína inibidora celular (c-FLIP) estão a jusante e reguladores anti-apoptóticos a montante da cascata apoptótica de sinalização, respectivamente.

tal como outros inibidores de apoptose (IAP), survivina actua a jusante das mitocôndrias para prevenir a transformação ou a activação de caspase-9 iniciadora, que conduz à inibição da actividade das caspases efectoras. No entanto, o papel de survivina não se limita à inibição da apoptose, mas também envolve a regulação da divisão celular [15]. C-FLIP é a principal proteína que impede caspase 8 de activação por receptores de morte através da ligação a domínio de morte Fas-associated e caspase 8, no DISC. Apesar de várias isoformas de splicing de mRNA c-FLIP já foram descritas, apenas dois deles, c-FLIP

S e c-FLIP

L, foram significativamente estudou no nível de proteína. Ambas as proteínas podem ser recrutadas para o complexo de sinalização indutor de morte e inibir a apoptose mediada pelo receptor de morte [16]. Ambos c-FLIP

L e c-FLIP

S são proteínas rápidos volume de negócios; Assim, os seus níveis estão sujeitos a regulamentação por ubiquitina /degradação mediada por proteassoma [17], [18].

Os resultados de estudos pré-clínicos com TRAIL recombinante demonstraram suas atividades significativas anti-tumorais, indicando o potencial de utilizar TRAIL como um agente anticancerígeno [19]. Apesar deste papel pró-apoptótica de TRAIL nas células transformadas, muitas células cancerosas desenvolvem resistência a apoptose induzida por TRAIL. Assim, tem sido relatado que linhas celulares de cancro da bexiga, tais como T24 e HT1376, são TRAIL-resistentes [20]. Identificação de drogas ou de agentes que podem superar a resistência TRAIL e sensibilizar células cancerosas no sentido de apoptose induzida por TRAIL é, portanto, extremamente importante para alvejar as células cancerosas TRAIL-resistente. A combinação de TRAIL com radiação e alguns agentes quimioterapêuticos [21], [22] ter fornecido um sucesso limitado, porque esta combinação também resultou num aumento da toxicidade sistémica.

O presente estudo relataram os efeitos da ciglitazona sobre RT4 (derivado de uma classe bem diferenciada I tumor papilar) e T24 (derivado de uma indiferenciados grau III carcinoma) linhas celulares de cancro da bexiga. A escolha destes particularmente linhas celulares de cancro da bexiga é relevante uma vez que em células RT4, P53 é de tipo selvagem e o marcador mesenquimais N-caderina não é expresso enquanto que o marcador de E-caderina epitelial é detectado. Inversamente, em células T24, P53 é mutado e E-caderina está ausente e substituído por N-caderina [23]. Assim, dependendo do estado diferenciado das células, que mostrou que o tratamento individual induzida ciglitazona /M paragem do ciclo celular G2, mas fase desencadeada apoptose apenas em células cancerosas da bexiga T24 alto grau por meio de mecanismos independente de activação-PPARy. Além disso, pela primeira vez, a nosso conhecimento, o tratamento de ratinhos nus por ciglitazona prejudica seriamente o crescimento de xenoenxertos de tumor da bexiga de alto grau confirmando nossos

in vitro

resultados. O mais interessante, a combinação de ciglitazona e TRAIL exibida que ciglitazona deixe células T24 TRAIL refratário para responder a TRAIL. Pela primeira vez em células cancerosas da bexiga, que revelou que a ciglitazona mediada por sobre-regulação de TRAIL e uma diminuição acentuada de c-flip e survivina mediada, em parte, através de um processo de degradação proteossomal contribuir para ciglitazona induzida morte celular e para o efeito sensibilizante desta TZD na apoptose induzida por TRAIL.

Resultados

blocos ciglitazona RT4 (baixo grau) e T24 (high grade) células em fase G2 /M, mas induz a apoptose apenas em células T24 através caspase activação

para investigar o efeito da ciglitazona RT4 em T24 e células cancerosas da bexiga apoptose, as células foram tratadas com concentrações variáveis ​​de fármaco (5-60 uM), durante 24 h e avaliados quanto a iodeto de propídio teor de ADN por citometria de fluxo utilizando coradas análise. Como mostrado na Figura 1A, em células RT4, a droga induziu um aumento dependente da dose de células na fase G2 /M do ciclo celular em associação com um aumento do nível de p53 expressão, p21

Cip1 /WAF1 e p27

KIP1 e um declínio do nível de proteína B1 ciclina (Figura 1B). Mas não houve aumento significativo da população sub-G1 em comparação com células de controlo não tratadas (Figura 1C), indicando que um tratamento de 24 h-ciglitazona não induziu a apoptose destas células, mesmo a uma alta concentração de fármaco 60 ^ M. Além disso, ciglitazona não induziu a clivagem de caspase 3 e o seu substrato de PARP (Figura 1D).

As células foram tratadas durante 24 h com ou sem ciglitazona nas concentrações indicadas. (A) percentagem de células que mostram a distribuição do ciclo celular. conteúdo (C) DNA hipodiploidia (pico sub-G1). (B), (D) Após o tratamento, as células foram colhidas e os extractos de proteína total foram sujeitas a imunotransf erência para a detecção de procaspase 3, PARP, p53, p21

Cip1 /WAF1, p27

KIP1 e ciclina B1. β-actina foi utilizado como um controlo de carga interna. Os dados apresentados são representativos de 3 expericias independentes realizadas em triplicado.

Tal como observado para as células RT4, houve um aumento dependente da dose de G2 /M fracção de células T24 (dados não mostrados), mas ao contrário RT4 as células, a análise da distribuição de DNA nuclear em células T24 mostrou um aumento dependente da dose da população sub-G1 com ~ 40% de morte celular a partir de 40 pM de concentração (Figura 2A). Para caracterizar a via de morte celular desencadeada por ciglitazona, a clivagem de caspases 9, 8, 3 foi determinada por análise de transferência de Western. A partir de uma concentração de 40 uM de fármaco, uma melhorada processamento considerável tanto de caspase 9 e caspase 8 aos seus fragmentos activos foi detectado (Figura 2B). Caspase 3, que representa o enzima execução jusante clássica de caspase 8 e 9 foi clivado na sua forma activa (20/18 kDa). Activação de caspase 3 foi confirmada por clivagem do pro-forma de PARP (116 kDa) para a forma inactiva (85 kDa) (Figura 2B). Tal como mostrado na Figura 2C, enquanto que os níveis de expressão de p53 e Bax foram inalterados, Bcl-2 foi drasticamente reduzido e Bid foi truncado. Estes resultados indicaram que as células T24 poderia amplificar o sinal apoptótico através da mitocôndria e comportam-se como células de tipo II após a exposição ciglitazona.

As células foram expostas durante 24 h para veículo ou ciglitazona nas concentrações indicadas. (A) A percentagem de células que mostram o teor de ADN hipodiploidia (pico sub-G1) foi avaliada por análise de citometria de fluxo. (B), (C) A clivagem de caspases 9, 8, 3 e PARP, assim como a expressão de proteínas pro- e anti-apoptóticas foram determinados por análise de transferência de Western. (D,

esquerdo

) As células foram pré-incubadas 1 h com 50 mM caspase 8 (Z-IETD-FMK) ou 9 (Z-LEHD-FMK) inibidor específico antes do tratamento com ciglitazona 40 mM durante 12 h e avaliação de caspases 8, 9, 3 e processamento Bid foi analisado por western-blotting. β-actina foi utilizado como um controlo de carga interna; (D,

direito

) Após os tratamentos indicados, as células foram coradas com PI para análise de DNA fragmentação por citometria de fluxo. Os dados são médias ± desvio padrão de 3 experiências independentes realizadas em triplicado. *

P Art 0,05, diferenças significativas em comparação com células não tratadas; **

P Art 0,05., Diferenças significativas em comparação com células tratadas com ciglitazona com o uso de

t

teste bicaudal de Student não pareado

A caspase ativação em cascata é um evento chave para o processo de apoptose. Como esperado, a incubação com caspase 8 (Z-IETD-FMK) ou 9 (Z-LEHD-FMK) inibidores específicos bloqueados caspases 8 ou 9 processamento (Figura 2d, painel da esquerda) e diminuiu a apoptose induzida por ciglitazona tal como evidenciado por um diminuição significativa da população sub-G1 (Figura 2D, painel da direita) associado com um menor clivagem de caspase 3 (Figura 2D, painel esquerdo). Estes dados indicam que RT4 e células T24 não tinha uma resposta similar ao tratamento ciglitazona. Com efeito, a apoptose induzida por ciglitazona foi restrita a células T24 embora bloqueado células T24 e RT4 na fase G2 /M do ciclo celular. Além disso, as duas principais vias apoptóticas, o receptor de morte e vias mitocondriais, parecem ser activado em células T24.

A ciglitazona não actuam através de PPARy activação transcricional

Para determinar se era PPARy transactivação necessária para a paragem do ciclo celular promovido-ciglitazona ou apoptose, células RT4 e T24 foram tratados durante 24 h em 40 ^ M de fármaco por si só ou em combinação com 80