Abstract
Introdução
O uso dos inibidores da 5-alfa redutase (5-IRA) finasteride e dutasteride para prevenção do câncer de próstata ainda está em debate. A FDA concluiu recentemente que o aumento da prevalência de tumores de alto grau entre 5 tratados-ARI pacientes não deve ser negligenciado, e eles decidiram proibir o uso de 5-IRA para a prevenção do câncer de próstata. Este estudo foi conduzido para verificar os efeitos da finasterida sobre a migração de células de próstata e invasão e os relacionados enzimas /proteínas em linhagens de células prostáticas tumorais humano normal e.
Materiais e Métodos
RWPE-1, As células LNCaP, PC3 e DU145 foram cultivadas a 60% de confluência e expostas durante diferentes períodos de 10 uM, quer 50 | iM ou finasterida que foi diluída em meio de cultura. Os meios condicionados foram recolhidas e concentradas, e MMP2 e MMP9 actividades e TIMP-1 e expressão de proteína TIMP-2 foram determinadas. A viabilidade celular, migração e invasão foram analisados, e os extractos celulares restantes foram submetidos a detecção do receptor de androgénio (AR) através de técnicas de Western blotting. Os experimentos foram realizados em triplicado.
Resultados
A viabilidade celular não foi significativamente afetada pela exposição finasterida. Finasterida significativamente subregulado atividades MMP2 e MMP9 em RWPE-1 e células PC3 e MMP2 em células DU145. TIMP-2 de expressão em células RWPE-1 foi regulada positivamente após a exposição. A invasão de células de todas as quatro linhas celulares testadas foi inibida pela exposição a 50 uM de finasterida, e inibição da migração de células só ocorreu RWPE-1 e LNCaP. AR foi expressa por LNCaP, RWPE-1 e células PC3.
Conclusões
Apesar de o debate sobre a maior incidência de câncer de próstata de alto grau entre os pacientes tratados com 5-ARI sobras, os nossos resultados indicam que a finasterida pode atenuar a agressividade tumoral e invasão, que pode variar dependendo da capacidade de resposta de células andrógeno da próstata do paciente
citação:. Moroz a, FK Delella, Almeida R, Lacorte LM, Fávaro WJ, Deffune e, et ai. (2013) Cell finasterida inibe câncer de próstata humano Invasion através MMP2 e MMP9 regulação negativa. PLoS ONE 8 (12): e84757. doi: 10.1371 /journal.pone.0084757
Autor: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos da América
Recebido: 25 Janeiro, 2013; Aceito: 27 de novembro de 2013; Publicação: 30 de dezembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Moroz et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por um (Conselho de Pesquisa do Estado de São Paulo) FAPESP financiamento (processo n. 2010 /16671-3) e um Ph.D. CAPES Bolsa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de próstata é a neoplasia maligna mais comum em homens e é responsável por US $ 8 bilhões e um custo médio de US $ 81658 por paciente, desde o diagnóstico até a morte, nos EUA [1]. Um número de agentes estão actualmente a ser investigada para a prevenção de cancro da próstata [2]. A finasterida, um tipo 2 reductase 5-alfa (5-ARI), que bloqueia a conversão de testosterona (T) em di-hidrotestosterona (DHT) [3], é um fármaco bem conhecido que é utilizado para o tratamento da hiperplasia benigna da próstata [ ,,,0],4] e tem sido sugerido para actuar como um agente quimiopreventivo de cancro da próstata. O Prevention Trial do cancro da próstata (PCPT) demonstrou uma redução de 24,8% no risco de câncer de próstata de baixo grau em geral e com a administração de finasterida. No entanto, os cânceres de alto grau foram observadas em 6,4% dos doentes tratados com finasterida, em comparação com 5,1% dos homens que receberam um placebo [5], [6]. Esta descoberta levou a uma pergunta importante: se a finasterida provocar cancro de alto grau ou aumentar a sua detecção? Esta questão foi seguido por um intenso debate sobre superestimação factual ou artifactual de casos de alto grau nos pacientes tratados com a finasterida [3], [7], que dividiram urologistas e pesquisadores da próstata. Mais recentemente, o julgamento REDUZIR relatou resultados semelhantes após o tratamento dutasteride 5-ARI. Reconhecendo a importância desta questão, a Food and Drug Administration (FDA) recentemente reanalisados os dados do PCPT e reduzir ensaios e concluiu que a finasterida e dutasterida tratamentos pode aumentar o risco de uma forma mais grave de câncer de próstata. Por isso, eles decidiram proibir o uso desses agentes para a prevenção do câncer de próstata [8]. Além disso, um estudo experimental publicado recentemente revelou resultados semelhantes aos da TPCP e reduzir ensaios [9]. Os autores demonstraram que a incidência do carcinoma pouco diferenciado foi aumentada em ratinhos C57BL /6 ratinhos TRAMP × FVB alimentados com uma dieta suplementada finasterida, e considerou isto como um efeito adverso do tratamento com finasteride, em vez de um efeito de um artefacto [9].
casos de cancro da próstata de alto grau, tais como os observados nos doentes tratados com 5-Ari, são comumente associada com um aumento da expressão das metaloproteinases da matriz (MMPs), uma família de zinco e cálcio endopeptidases dependentes que são responsáveis pela extracelular matriz (ECM) de remodelação, o que contribui para o fenótipo invasivo e metastático de células de cancro da próstata [10] – [13], e a diminuição da expressão do inibidor tecidual de metaloproteinases de matriz (TIMP) [13], uma classe de ocorrência natural inibidores de MMPs que firmemente regulam a sua actividade, e são expressas em uma variedade de tipos de células [11].
Porque a degradação de ECM é conhecido por ser uma importante etapa durante a progressão do cancro [10], [12], [13], o nosso grupo vem investigando os efeitos da finasterida sobre a MMP e TIMP modulação em uma tentativa de explicar por que pacientes finasterida tratados tinha câncer de próstata de alto grau. Anteriormente, demonstrou que o tratamento com finasteride aumentou a expressão de MMP9 e diminuiu a expressão de MMP2 na próstata ventral de ratos [14], [15] e que regulada negativamente os níveis de ARNm de TIMP-1 e TIMP-2 de rato ventral da próstata [ ,,,0],15]. Além disso, demonstraram recentemente que a finasterida também reduz a actividade gelatinolítica da MMP2 numa variedade de linhas de células da próstata humana [16]. Realizamos o presente estudo para determinar se o tratamento finasterida interfere com a migração e potencial invasivo da linha normal de células de próstata humana RWPE-1 e as linhas de células epiteliais tumorais LNCaP, PC3 e DU145, que têm receptor de andrógeno diferente (AR) perfis.
Materiais e Métodos
Cell Cultures
AR Um frasco cada um dos (não-tumoral, tipo selvagem AR
+) RWPE-1, LNCaP (tumoral, mutado
+) e PC3 (tumoral, AR
-) linhas celulares foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC ™). DU145 (tumoral, AR
-), as células foram gentilmente doado pelo Dr. Heloisa Sobreiro Selistre de Araújo, do Departamento de Fisiologia – UFSCar, Brasil (originalmente adquirida da ATCC ™). Embora não isogénica, estas linhas celulares foram seleccionadas para serem representativas dos 3 in vivo situações de exposição finasterida distintos: um paciente com uma próstata normal (representada in vitro pela linha celular RWPE-1), um paciente com cancro da próstata sensível ao androgénio (representada in vitro pela linha celular LNCaP) e de um paciente com cancro da próstata resistente à castração (representada in vitro pelo PC3 e linhas celulares DU145). Os experimentos foram realizados dois meses após a aquisição das linhas celulares. As células RWPE-1 foram cultivadas usando queratinócitos isento de soro Médio (Invitrogen ™) suplementado com 0,05 mg /ml de extracto de pituitária de bovino, 5 ng /de factor de crescimento epidérmico humano recombinante ml (EGF) e 1% de antibiótico /solução antimicótica (Invitrogen ™). As células LNCaP, PC3 e DU145 foram cultivadas usando meio RPMI (Invitrogen ™) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (SFB) (Invitrogen ™) e 1% de antibiótico /antimicótico solução (Invitrogen ™). Todos os procedimentos de cultura de células foram realizados sob condições estéreis e mantido rigorosos dentro de um 5% de CO
2 incubadora (Thermo Scientific ™). O frasco inicial de cada linha celular foi expandida até 10 frascos individualmente e criopreservadas no respectivo meio de cultura de células suplementado com 20% de FBS e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma-Aldrich ™) para constituir o banco de células.
exposição finasterida e viabilidade celular
Todas as linhas celulares foram então descongeladas e individualmente semeadas a 2 x 10
4 células /cm
2 em 6 poços de cultura de placas (TPP ™). Os experimentos foram realizados em triplicado. as concentrações de finasterida foram escolhidos com base em um estudo anterior, em que 10 mM e 50 mM induzida modulação metabólica significativo sobre as células da próstata tumoral [17]. Ao atingir 60% de confluência, as células foram lavadas três vezes com D-PBS estéril (Gibco /Invitrogen ™), e o meio de cultura recomendado (FBS livre) foi adicionado como se segue: 1) o tratamento de controlo – suplementado com 0,1% de DMSO; 2) Tratamento de finasterida baixa dose – suplementado com% DMSO 0,1, acrescido de 10 mM finasteride (Sigma ™); e 3) de alta dose de tratamento finasterida – suplementado com 0,1% de DMSO mais 50 uM finasterida (Sigma ™). Finasterida foi diluída em DMSO, e a solução de DMSO /finasterida foi diluída em meio de cultura. Durante todos os tratamentos de exposição de finasterida, as células foram observadas ao microscópio de contraste de fase invertida (Zeiss ™) para a morfologia geral e a contaminação bacteriana e fúngica. Após 24, 48 e 72 horas de exposição, o meio condicionado (CM) foi recolhido e armazenado individualmente a -80 ° C. As restantes células ligadas foram recuperados individualmente por digestão com tripsina, e uma aliquota foi avaliada quanto à viabilidade por coloração com Azul de Tripano. As restantes células foram centrifugadas individualmente a 1200 rpm durante 10 minutos para se obter uma pelete de células para a produção de extractos de proteína. FBS foi removido durante a exposição finasterida porque se sabe que contém níveis elevados de MMP, os quais iriam interferir com os ensaios subsequentes gelatinolíticas.
Processamento
meio condicionado e extracto celular
O CM foi concentrado 10X usando Centriprep® 10000 MWCO (Millipore ™) tubos de centrifugação a 4900 rpm durante 30 minutos. Os respectivos sedimentos celulares foram submetidos a extracção de proteína utilizando um in-produzido internamente mM de Tris-HCl a 50, 0,2 M de NaCl, CaCl 10 mM
2, 0,1% de Triton X-100 tampão de extracção de proteína suplementado com um cocktail inibidor de protease 1% (Sigma-Aldrich ™) para se obter extractos celulares. O tampão de extracção de proteína foi escolhido após comparação com um tampão disponível comercialmente (tampão RIPA, Thermo Scientific ™), que revelou melhor preservada actividade gelatinolítica de MMP por zimografia (dados não apresentados). Extracção de proteínas foi realizada por pipetagem repetitiva e vórtex, seguido por 1 hora de repouso em gelo e uma última centrifugação a 5000 rpm durante 20 minutos a 4 ° C. Por fim, os extractos de CM e de proteína foram submetidos a quantificação de proteína utilizando um NanoDrop 2000 (Thermo Scientific ™) espectrofotómetro e a proteína A 280 260 /protocolo. É importante ressaltar que o CM foi FBS livre; portanto, todas as proteínas no CM foram produzidos pelas células.
MMP2 e MMP9 Atividade Ensaios
O atividades MMP2 e MMP9 no CM e extratos de células (pro-forma + forma ativa) Total foram medidos usando o Biotrak® Activity Assays (GE Healthcare Life Sciences ™) de acordo com as orientações do fabricante. Resumidamente, quantidades iguais (100 ug) de CM reunidas ou extracto de células (por tratamento triplicado) foram pipetadas para microplacas de 96 poços revestidas com anticorpos anti-humano-MMP2 ou anti-humano-MMP9. Padrões de humano recombinante pró-MM2 ou pro-MMP9 foram pipetadas para os respectivos poços, com valores que variam de 0,19 a 3 ng /ml (para MMP2) e 0,125 a 4 ng /ml (para MMP9) conforme as instruções do fabricante. Após uma incubação durante a noite a 4 ° C e lavagem, de 50 uL de acetato de p-aminof 0,5 mM (APMA) foi pipetada solução em todas as cavidades para activar os pró-formas de MMP2 e de MMP9. (Uroquinase modificada + S-2444 ™ substrato péptido) Subsequentemente, 50 uL de um reagente de detecção foi adicionado a todos os poços. As placas foram incubadas a 37 ° C durante 6 (para MMP2) ou 2 horas (para MMP9), e a densidade óptica integrada (IOD) foi medida a 405 nm utilizando um leitor de placas espectrofotométrico. Finalmente, um gráfico dobrável alteração foi feita dividindo-as IODs obtido a partir do CM /extractos tratados pelos seus respectivos valores de controlo. Alternativamente, as actividades de MMP2 e MMP9 foram avaliadas usando zimografia de gelatina padrão, tal como previamente descrito [16].
TIMP-1 e TIMP-2 Proteína Quantificação
O TIMP-1 e TIMP-2 os níveis de proteína no CM foram medidos utilizando ELISA em fase sólida os ensaios Biotrak® humana (GE Healthcare Life Sciences ™) de acordo com as orientações do fabricante. Resumidamente, quantidades iguais (100 ug) de CM reunidas (por tratamento triplicado) foram pipetadas para microplacas de 96 poços revestidas com anticorpos anti-humanos-TIMP-1 ou anti-humano-TIMP-2. Padrões de recombinante humano TIMP-1 ou TIMP-2 foram pipetados para dentro dos respectivos poços da placa, com valores que variam de 3,13 a 50 ng /ml (para o TIMP-1) e 8 a 128 ng /ml (para o TIMP-2). Após uma incubação de 2 horas a 25 ° C e lavagem, 100 uL de uma solução de conjugado de peroxidase foram pipetados para todos os poços e as placas foram ainda incubadas durante 2 horas a 25 ° C. Subsequentemente, 100 mL de uma tetrametilbenzidina (TMB) /peróxido de hidrogénio solução foi adicionada a todos os poços. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 30 minutos, e a DOI foi medida a 630 nm utilizando um leitor de placas espectrofotométrico um. Finalmente, um gráfico dobrável alteração foi feita dividindo as IODs obtidos a partir dos tratamentos tratados pelos seus respectivos valores de controlo.
Migration Assay
O potencial de migração de todas as linhas de células foi investigada usando o BD BioCoat ™ Migração Insert (BD Biosciences ™). A membrana porosa (8 um de tamanho de poro) foi hidratada com 500 ul de meio à base de bicarbonato isento de soro durante 2 horas. Após a hidratação, a 500 ul de meio RPMI 1640 com FBS a 5% (para LNCaP, PC3 e DU145 células) ou 500 ul de meio de queratinócitos com FBS a 5% (para células RWPE-1) foi adicionada à câmara inferior do 24 poços prato. Estas linhas de células da próstata foram previamente cultivados em 50 uM médio médio ou controlo finasterida durante 72 horas, colhidas e individualmente cultivados em meio isento de soro de 200 ul (com ou sem 50 uM finasterida) na inserção a uma densidade de 1 x 10
5 células totais. As placas foram incubadas com 5% de CO
2 a 37 ° C durante 22 horas de acordo com as orientações do fabricante. As células que não migraram, que foram localizadas na parte superior da membrana de inserção, foram raspadas com um cotonete. As células que migraram através dos poros da membrana, que foram atraídos pelo FBS, foram fixadas em metanol a 100% e coradas com solução de azul de toluidina a 0,1% durante 2 minutos. As células migradas foram fotografadas digitalmente sob uma ampliação de 200X utilizando um microscópio de luz (Nikon ™). Os experimentos foram realizados em triplicado, e 5 campos aleatórios foram fotografadas e sujeitas a contagem celular utilizando o software livre ImageJ®. O índice de migração foi calculada como a média ± SD de células contadas por campo, e as células de controlo foram comparados com as células tratadas com a finasterida. fibroblastos da pele humana (WS1- ATCC) foram utilizadas como controlos positivos e foram expostas às mesmas condições de ensaio tal como as células da próstata.
Cicatrização de Feridas Ensaio
A migração celular foi ainda investigada utilizando um migração diferente ensaio para a PC3 e linhas de células DU145, que foram cultivadas em placas de 6 poços a 4 × 10
4 células /cm
2 até se atingir 100% de confluência. As monocamadas foram feridos (riscado) em uma linha reta em todo o bem com uma ponteira 200 mL utilizando um, de 6 poços tampa placa de cultura estéril, como uma régua, para obter um arranhão regular. As monocamadas foram feridos então lavadas duas vezes com D-PBS (Gibco /Invitrogen ™) para remover os detritos celulares. O meio de cultura com ou sem 50 uM de finasterida foi adicionado aos poços de controlo e de tratamento. A área da ferida foi posteriormente inspeccionado após 24, 48, 72 e 96 horas usando um microscópio de contraste de fase invertida com a câmera digital. A velocidade de cicatrização de feridas foi calculado como o percentual da ferida inicial até o fechamento total da ferida nos diferentes pontos de tempo usando o software livre ImageJ®.
Matrigel Invasion Ensaio
Os potenciais invasivos de tudo quatro linhas celulares foram investigados usando BD BioCoat ™ Matrigel ™ Invasion inserções (BD Biosciences ™). A membrana porosa revestida com matrigel-(8 um de tamanho de poro) foi hidratada com 500 ul de meio à base de bicarbonato isento de soro durante 2 horas. Após a hidratação, a 500 ul de meio RPMI 1640 com FBS a 5% (para LNCaP, PC3 e DU145 células) ou 500 ul de meio de queratinócitos com FBS a 5% (para células RWPE-1) foi adicionada à câmara inferior do 24 poços prato. Estas linhas de células da próstata foram previamente cultivados em 50 uM médio médio ou controlo finasterida durante 72 horas, colhidas e individualmente cultivados em 200 ul de meio isento de soro (com ou sem 50 uM finasterida) na inserção a uma densidade de 1 x 10
5 células totais. As placas foram incubadas num incubador com 5% de CO
2 a 37 ° C durante 22 horas, de acordo com as orientações do fabricante. As células uninvaded na parte superior da membrana inserção foram raspadas com um cotonete. As células que invadiram a matriz Matrigel e migraram para o lado oposto da membrana, que foram atraídos pelas FBS, foram fixadas em metanol a 100% e coradas com solução de azul de toluidina a 0,1% durante 2 minutos. As células invadidas foram fotografadas digitalmente sob uma ampliação de 200X utilizando um microscópio de luz (Nikon ™). Os experimentos foram realizados em triplicado, e 5 campos aleatórios foram fotografadas e sujeitas a contagem celular utilizando o software livre ImageJ®. O índice de invasão foi calculada como a média ± SD de células contadas por campo, e as células de controlo foram comparados com as células tratadas com a finasterida.
Western Blotting
Foram utilizados os extractos de células restantes para determinar Os níveis de expressão de AR. Esta determinação foi realizada devido à literatura discrepantes sobre a expressão destes receptores por estas linhas celulares. Resumidamente, uma amostra de proteína (70 ug), que tinha sido previamente quantificada utilizando o NanoDrop 2000 (Thermo Scientific ™) espectrofotómetro foi carregado num gel de SDS-PAGE a 10% sob condições redutoras. As proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Sigma Co ™), o qual foi subsequentemente bloqueadas com albumina de soro bovino a 5% (BSA) em Tris-HCl a 10 (pH 7,5), NaCl 150 mM e 0,1% de Tween-20 (TBS- T) durante 1 hora. As membranas foram então incubadas a 4 ° C durante a noite com o anticorpo AR (Genetex ™). As membranas foram lavadas 5 vezes durante 5 minutos em TBS-T e incubou-se durante 2 horas à temperatura ambiente com os anticorpos adequados, conjugados com peroxidase secundárias (Abcam ™). Após lavagem em TBS-T, as membranas foram visualizadas utilizando 3,3′-diaminobenzidina e fotografada.
Análise Estatística
Os dados obtidos foram analisados utilizando o software INSTAT ™ usando o bicaudal teste t de Student (P 0,05) para comparar os diferentes tratamentos e seus respectivos controles (viabilidade, migração, invasão), ou por meio do teste post hoc de análise de variância e Dunnet (MMPs e TIMPs ensaios)
resultados
.
exposição e viabilidade celular Finasteride
a viabilidade celular não foi significativamente afectada por qualquer uma das doses de finasterida que foram utilizados na presente investigação. As células não apresentaram aspectos da morte celular ou perda de viabilidade, mesmo após 72 horas de 50 mM exposição finasteride (Figura S1).
MMP2 e MMP9 Atividade Ensaios
Em condições de controle, foi observou-se que as células PC3 secretada o dobro de MMP2 e MMP9 em sua CM como células RWPE-1 (valores IOD – dados não mostrados). células LNCaP não segregam níveis detectáveis de MMP2 MMP9 ou em sua cm (IOD valores dados – não mostrada). No entanto, as células DU145 secretada elevadas quantidades de MMP2 e MMP9 (Figura 1a). Para os extractos de células, nenhuma linha de células apresentou as actividades MMP2 MMP9 ou detectáveis, demonstrando que estas linhagens de células não possuem as MMPs na sua membrana (dados não mostrados).
a) O meio condicionado (CM) de não tratada (controle ) e células DU145 tratados com a finasterida foi recolhido, concentrado e analisado para actividades MMP2 e MMP9 utilizando um ensaio de zimografia de gelatina. (S) Normas, (P) extracto de tecido de uma úlcera gástrica que foi utilizado como um controlo positivo. Estas células segregadas quantidades elevadas de MMP2 e MMP9 em sua CM, como mostrado pelas bandas brilhantes sobre o fundo escuro. b) Altas doses de finasterida (50 M) subregulado atividade MMP2 até 43% após 72 horas de exposição, como quantificados utilizando o software ImageJ ™. Os dados são expressos como um gráfico de dobra-mudança dos valores IOD que foram obtidos a partir das bandas do (a) número para células tratadas com as células de controlo ao longo de finasterida. (**) Os valores estatisticamente significativos com p 0,01. As experiências foram realizadas em triplicado.
Após a exposição finasterida, observou-se que, para RWPE-1 em células a dose empregue baixo (10 pM), 72 horas de exposição era suficiente para induzir a regulação negativa significativa tanto a actividade de ambas as MMPs na CM (Figura 2a); estes valores foram reduzidos em 25% e 30% para MMP2 e MMP9, respectivamente, em relação aos valores de controlo. Por outro lado, para a dose elevada finasterida empregue (50 uM), as actividades de MMP2 e MMP9 foram significativamente regulada negativamente em todos os pontos de tempo que foram testadas, até 90% e 55% após 72 horas de exposição, respectivamente (Figura 2a) .
a) O meio condicionado de não tratada (Controle) e tratados com finasterida células RWPE-1 foram recolhidas, concentradas e analisadas para atividades de MMP2 e MMP9 usando seus respectivos Biotrak® Atividade Ensaios. finasterida-dose baixa (10? M) durante 72 horas de exposição regulada negativamente de MMP2 e MMP9 actividade em 25% e 30%, respectivamente, quando comparados com valores de controlo. Altas doses de finasterida (50 uM) downregulated actividades MMP2 e MMP9 em todos os pontos de tempo testados, até 90% e 55% após 72 horas de exposição, respectivamente. b) meio condicionado de não tratada (controle) e tratou-finasterida células RWPE-1 foram recolhidas, concentradas e analisadas para o TIMP-1 e expressão de proteína TIMP-2 com os respectivos ensaios Biotrak®. finasterida exposição, em ambas as doses, a supra-regulação induzida de TIMP-2 de expressão no ponto de tempo de 72 horas, até 150% mais do que os níveis de expressão de controlo. Os dados são expressos como um gráfico de dobra-mudança dos valores IOD que foram obtidos para as células tratadas com a finasterida sobre os das células de controlo. (*) Os valores estatisticamente significativos com p . 0,05
Na linha de células PC3, a exposição finasterida baixa dose induziu a regulação baixa significativa das actividades MMP2 e MMP9 em apenas o ponto de tempo de 24 horas (Figura 3a ). Por outro lado, em altas doses finasterida induzida significativamente a regulação negativa da MMP2 nos pontos de tempo de 48 horas e 72 horas e de MMP9 em todos os pontos de tempo que foram avaliadas, com uma redução de até 70% (Figura 3a).
a) O meio condicionado de células PC3 não tratados e tratados com a finasterida foi recolhido, concentrado e analisado para actividades MMP2 e MMP9 utilizando os respectivos Biotrak® Ensaios de actividade. Low-dose de exposição finasterida (10 uM) não induziu a regulação negativa das actividades de MMP2 ou MMP9, excepto no ponto de tempo de 24 horas. Altas doses de finasterida a regulação negativa induzida de MMP2 nos pontos de tempo de 48 horas e 72 horas e de MMP9 pontos de tempo em todos avaliados, uma redução de até 70%. b) meio condicionado de não tratado (controlo) e células PC3 tratadas com a finasterida foi recolhido, concentrado e analisado para o TIMP-1 e expressão de proteína TIMP-2 com os respectivos ensaios Biotrak®. finasterida exposição não induziu qualquer modulação significativa de TIMP-1 e TIMP-2 de expressão, excepto para a dose de 10 uM finasterida em 24 horas de exposição. Os dados são expressos como uma dobra-mudança dos valores obtidos para células IOD finasterida tratados em relação às células de controlo. (*) Os valores estatisticamente significativos com P . 0,05
Dado que os resultados das outras linhas celulares mostrou que apenas a finasterida-dose elevada exercida efeitos sobre a actividade de MMP, a única dose elevada de 72 horas foi investigada para a linha celular DU145. Para a linha celular DU145, doses elevadas de finasterida induziu uma regulação negativa significativa das actividades MMP2 de aproximadamente 43% (Figura 1B) (p 0,01). No entanto, as actividades MMP9 não foram significativamente modulada pela exposição finasterida (Figura 1b).
TIMP-1 e TIMP-2 Proteína Quantificação
Quando as linhas de células foram cultivadas sem finasterida, as células PC3 produzido duas vezes mais TIMP-1 do que as células RWPE-1; No entanto, a quantidade de TIMP-2 foi a mesma (valores IOD). células LNCaP produziu baixos níveis de TIMP-1 e TIMP-2 que se aproximava do limite inferior de detecção do ensaio (valores IOD). células DU145 produzidas elevadas quantidades de TIMP-1 (valores IOD – dados não mostrados)
Após a exposição finasterida da linha celular RWPE-1 testados, ambas as doses induziu significativamente sobre-regulação da expressão de TIMP-2 no 72 horas. ponto de tempo, o que era até 150% mais expressão do que o tratamento de controlo (Figura 2b). Como para as células PC3, TIMP-1 e TIMP-2 não mostraram expressão de modulação significativa, excepto para a dose de finasterida 10 uM às 24 horas de exposição (Figura 3B). Finasteride não induziu quaisquer alterações significativas na expressão de TIMP-1 ou TIMP-2 em linhas celulares de LNCaP ou DU145 (dados não mostrados).
Migração Ensaio
em meio de cultura normal, o linhas celulares testadas exibiram diferentes potenciais de migração. células RWPE-1 migrou mais (média de 32 células /campo) do que as células PC3 (média de 24 células /campo), que, por sua vez, migraram mais do que as células LNCaP (média de 8 células /campo). DU145 foi a linha celular mais investigada Migração (média de 85 células /campo) (Figura 4). Após 72 horas de exposição a finasterida (50 uM), a migração foi significativamente inibida em células RWPE-1 (p 0,01) e células LNCaP (p 0,05). PC3 e migração de células DU145 foi ligeiramente inibida; No entanto, a inibição não era significativa (p 0,05) (Figura 4). fibroblastos WS1 Humano (controlo positivo) migrou prontamente através das membranas (figura 4).
As linhas de células da próstata foram previamente cultivados em 50 uM finasterida ou meio de controlo, durante 72 horas e cultivadas individualmente em 200 ul de isento de soro meio (com ou sem 50 uM finasterida) no inserto migração a uma densidade de 1 x 10 5>
Cicatrização Ensaio
Para confirmar que os potenciais de migração de linhas celulares PC3 e DU145 não foram influenciados pela exposição finasteride, uma pessoa diferente ensaio de migração foi realizada para estas linhas celulares. Após a área da ferida foi infligida sobre as monocamadas, foi possível observar que, para ambas as linhas celulares, finasteride migração celular ligeiramente inibida (Figura 5a e 5c); No entanto, esta diferença não foi significativa (Figura 5b e 5d), que confirmou os resultados que foram obtidos a partir do ensaio de migração inserção anterior (Figura 4).
As células foram cultivadas em placas de 6 poços a 4 x 10
4 células /cm
2 até 100% de confluência foi alcançado. As monocamadas foram riscados em uma linha reta, e as monocamadas feridos foram, então, dado meio de cultura com ou sem 50 mM finasterida. A área ferida foi inspeccionado após 24, 48, 72 e 96 horas usando um microscópio de contraste de fase invertida com uma câmera digital. a) Imagens representativas mostrando o fecho de feridas de células PC3 tratadas com a finasterida e de controlo, a 0 a 72 horas. Red destacou áreas representam a área da ferida aberta. Barra de escala = 50 mm. áreas b) destacou o vermelho inicial foram medidos utilizando o software ImageJ ™, e as áreas restantes foram calculadas como uma percentagem da área inicial ferida. Um gráfico ferida-fechamento foi feito dividindo-se os valores da área que foram obtidos nos pontos de tempo indicado para o controle e células tratadas com finasterida. Finasterida inibiu ligeiramente a migração celular; no entanto, essa diferença não foi estatisticamente significativa (p 0,05). c) Imagens representativas mostrando o fecho de feridas de células DU145 tratados com a finasterida e de controlo, a 0 a 72 horas. Red destacou as áreas representam a área ferida aberta. Barra de escala = 50 mm. d) Tal como observado para as células PC3, finasteride migração celular ligeiramente inibida (p . 0,05)
Matrigel Invasion Ensaio
No meio de cultura regular, as linhas de células exibiram diferentes potenciais de invasão . DU145 e PC3 células foram as linhas de células mais invasiva, com um meio de 97 células /campo e 75 células /campo, respectivamente (Figura 6). A linhagem de células LNCaP, que foi também tumoral, curiosamente exibiu um potencial invasivo de baixo, com uma média de 5 células /campo (Figura 6). A linha celular não tumoral RWPE-1 também exibiu baixo potencial invasivo, como esperado, com uma média de 9 células /campo (Figura 6).
As linhas de células da próstata foram previamente cultivados em 50 uM finasterida ou controle meio durante 72 horas e cultivadas individualmente em 200 ul de meio isento de soro (com ou sem 50 uM finasterida) no inserto invasão de Matrigel® a uma densidade de 1 x 10 5>
Finasteride invasão celular inibida em todas as linhas celulares testadas. DU145 e invasão de células PC3 foi significativamente reduzida (p 0,001), seguido de RWPE-1 (p 0,01) e LNCaP (p 0,05). (Figura 6)
Western Blotting
AR