Abstract

Fundo

Proteínas e anticorpos matrizes surgiram como uma tecnologia promissora para estudar a expressão da proteína e proteína função de uma forma de alto rendimento. Estas matrizes também representam uma nova oportunidade ao perfil níveis de expressão de proteínas em amostras de pacientes com câncer e identificar biosignatures úteis para o diagnóstico clínico, classificação da doença, previsão, desenvolvimento de medicamentos e assistência ao paciente. Nós aplicamos matrizes de anticorpo para descobrir um painel de proteínas que podem servir como biomarcadores para distinguir entre os pacientes com câncer de ovário e controles normais.

Metodologia /Principais Achados

Usando um desenho de estudo de caso-controle de 34 pacientes com câncer ovariano e 53 controles saudáveis ​​pareados por idade, nós perfilado os níveis de 174 proteínas utilizando tecnologia de matriz de anticorpo de expressão e determinado o nível CA125 usando ELISA. Os níveis dessas proteínas de expressão foram analisados ​​usando 3 métodos discriminantes, incluindo a rede neural artificial, árvore de classificação e análise de pontuação ponto de divisão. Um painel de 5 marcadores de proteína de soro (MSP-alfa, TIMP-4, PDGF-R alfa, e OPG e CA125) foi identificado, o que poderia efectivamente detectar o cancro do ovário com elevada especificidade (95%) e de alta sensibilidade (100%), com AUC = 0,98, enquanto CA125 sozinho teve uma AUC de 0,87.

Conclusões /Significado

o nosso estudo piloto mostrou o conjunto promissor de 5 marcadores sorológicos para a detecção de câncer de ovário.

Citation: Jiang W, Huang R, Duan C, Fu L, Xi Y, Yang Y, et al. (2013) Identificação de cinco marcadores de proteína de soro para detecção de cancro do ovário por Antibody Arrays. PLoS ONE 8 (10): e76795. doi: 10.1371 /journal.pone.0076795

editor: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Centro, Estados Unidos da América

Recebido: 15 Abril 2013; Aceito: 28 de agosto de 2013; Publicação: 08 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Jiang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi em parte apoiada por RayBiotech Biomarcador Descoberta Pilot Grant. Os autores gostariam de expressar o seu agradecimento pelo apoio do projeto cientista principal para o distrito de desenvolvimento económico Guangzhou (2009L-P180); Programa de centenas de líderes inovadores e empreendedores (LCY201111); programa de Guangdong pesquisa inovadora equipa (201001s0104659419) e bolsas de investigação a partir do distrito de desenvolvimento económico Guangzhou (2010Q-P450). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Weidong Jiang, Ruochun Huang e Ruo-Pan Huang são funcionários da RayBiotech, Inc. , que desenvolve e comercializa tecnologias de matriz de proteínas e produtos. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de ovário representa o terceiro tipo de câncer mais frequente e é uma das principais causas de câncer morte entre as mulheres nos Estados Unidos e na Europa [1-3]. A maioria dos sintomas do câncer de ovário são vagos e semelhantes às vezes experientes com condições de saúde mais comuns, não-ameaçador para a vida; estes podem incluir inchaço abdominal ou inchaço, dor pélvica ou desconforto, dor lombar, perda de apetite ou rápida sensação de plenitude, indigestão persistente, gás ou náuseas e alterações no intestino ou bexiga hábitos. Como resultado, quase 80% dos pacientes com cancro do ovário são diagnosticados em fases posteriores. Infelizmente, a taxa de sobrevida em 5 anos para pacientes com câncer de ovário avançado clinicamente é de apenas 15% a 20%, em flagrante contraste com uma taxa de sobrevida em 5 anos de mais de 90% para pacientes com doença em estádio I. Portanto, é urgente descobrir e desenvolver biomarcadores para o rastreio do cancro do ovário e detecção precoce.

Atualmente, CA-125 e imagem são as 2 abordagens mais comuns para testes de rastreio do cancro do ovário. No entanto, estes 2 marcadores, quer utilizado sozinho ou em combinação, não são úteis de triagem ou fins de diagnóstico devido à baixa especificidade e /ou sensibilidade. Por exemplo, soro CA-125 tem sido demonstrado que possuem uma sensibilidade de . 98%, mas uma especificidade de apenas 50-60% para as primeiras fases da doença [4-6]

Vários estudos têm sido relatados para identificar biomarcadores de câncer de ovário soro usando a tecnologia de matriz de anticorpo multiplex [7-9]. O grupo do Dr. Lokshin identificado um grupo de marcadores proteicos 6 no soro, incluindo interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8), factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), a proteína quimiotática de monócitos -1 (MCP-1) e CA-125, que exibiu diferenças significativas nas concentrações de soro entre os grupos de cancro e de controlo do ovário com sensibilidade de 84% a 95% de especificidade [7]. grupo do Dr. Gil Mor identificados um painel de 6 biomarcadores, CA-125, osteopontina (OPN), factor de crescimento tipo insulina 2 (IGF- II), factor inibidor da migração de macrófagos (MIF), leptina e prolactina, que demonstrou uma sensibilidade de 95,3 % e uma especificidade de 99,4% para a detecção de cancro do ovário [8]. O uso de matrizes de anticorpos baseados em biotina humanos, nós analisamos os perfis de 507 proteínas expressão no soro em amostras de soro de 47 pacientes com câncer de ovário, 33 pacientes com tumores ovarianos benignos e 39, controles saudáveis ​​pareados por idade e identificou diferenças significativas na expressão de proteínas entre o normal controles e pacientes com câncer de ovário (

P Art 0,05). Pela análise classificação e análise de pontuação ponto de divisão destes 2 grupos, um painel de 6 por marcadores de proteínas, que consistiu de interleucina-2 receptor alfa (IL2Rα), a endotelina, osteoprotegerina (OPG), vascular factor de crescimento endotelial D (VEGF-D ) e betacelulina (BTC), pode ser utilizado para distinguir pacientes com cancro do ovário a partir de indivíduos normais [9]. Estes estudos sugerem fortemente que a tecnologia de matriz de anticorpo tem mostrado grande promessa na descoberta e desenvolvimento de perfis de biomarcadores do cancro do ovário de soro e sugerem fortemente que os painéis de citocinas no soro podem ser úteis como biomarcadores para a detecção precoce do cancro do ovário.

Neste estudo, utilizamos o nosso 174-marcador, painéis matriz de anticorpo para rastrear amostras de soro de 34 pacientes com câncer ovariano e 53 indivíduos saudáveis ​​e normais, a fim de identificar um painel de marcadores de proteína de soro para a detecção de câncer de ovário sanduíche ELISA-based.

resultados de

Validação de 174-marcador matrizes de citocinas semi-quantitativos (Figuras 1, 2)

Painel a (esquerda) mostra forte correlação intra-ensaio (mesma amostra analisada na mesma lâmina de vidro , testados no mesmo dia); Painel B (meio) mostra uma forte correlação inter-ensaio (mesma amostra ensaiada em diferentes lâminas de vidro, testado em diferentes dias); Painel C (direita) mostra uma correlação pobre entre o cancro e amostras normais ensaiadas nas mesmas lâminas de vidro, testados no mesmo dia

Painel A (à esquerda) mostra imagens representativas do sinal de fluorescência para G6 matriz.; Painel B (médio) mostra imagens de sinais fluorescentes representativos para G7 array; Painel C (à direita) mostra imagens de sinais fluorescentes representativos para G8 matriz.

Neste estudo, foi aplicada tecnologia de matriz de anticorpo para determinar os perfis de 174 citocinas expressão no soro de pacientes com câncer ovariano e à idade pareados controles normais saudáveis. As citocinas neste estudo incluiu citocinas anti-inflamatórias, citocinas pró-inflamatórias, factores de crescimento, factores angiogénicos ou citocinas quimiotáticas, entre outros. Algumas dessas citocinas supostamente são alterados em pacientes com cancro do ovário de nossos próprios estudos e literatura, mas a nossa ampla tela de 174 proteínas também incluiu muitos outros tipos de marcadores como parte de uma abordagem “imparcial” do uso de alto conteúdo, citocina de alto rendimento matrizes de anticorpo para o perfil dos níveis de citocinas no soro de pacientes de cancro do ovário com o objectivo de identificar biomarcadores potenciais de diagnóstico.

primeiro, determinou-se ainda mais a reprodutibilidade do ensaio na análise de soro humano utilizando a análise por dispersão de trama. reprodutibilidade intra-corrediça para as matrizes à base de vidro-lâmina foi avaliada testando replicar aliquotas das mesmas amostras com duas sub-matrizes impressas na mesma lâmina e analisadas ao mesmo tempo. A reprodutibilidade inter-lâmina foi determinada utilizando duas lâminas diferentes impressos com as mesmas matrizes foram ensaiadas utilizando alíquotas duplicados das mesmas amostras em dois dias diferentes. Os coeficientes de correlação de Pearson para intra-slide e inter-slide reprodutibilidade foram 0,923 (

P Art 0,001) e 0,899 (

P Art 0,001), respectivamente, sugerindo alta reprodutibilidade do ensaio. Em contraste, o coeficiente de correlação de Pearson para o câncer vs. amostras normais foram 0,226 (

P Art 0,005)., Sugerindo que as amostras de cancro e amostras normais são de duas populações diferentes

Em seguida, soro de um total de 34 pacientes com câncer ovariano e 53 controles saudáveis ​​foram analisadas para níveis de 174 citocinas com o objetivo de descobrir novos marcadores de diagnóstico para câncer de ovário de expressão. Estas amostras de soro foram obtidas principalmente de nossos colaboradores e foram equivalente em idade e sexo (Tabela 1). Citocinas humana Anticorpo Arrays foram usadas para perfil padrões de expressão para 174 citocinas em amostras de soro todos os 87 dos pacientes. A intensidade do sinal é proporcional ao nível de uma proteína individual em cada amostra de expressão. Os dados da matriz foram então normalizados com base na intensidade de sinal de controlo positivo média de cada matriz. As intensidades de sinal de cada ponto medianos foram então corrigidos para o fundo do local. Para estabelecer um limiar de sinal, a intensidade do sinal do valor de corte foi determinada por +/- 2DP de tampão 10 intensidades de sinal de controlo em branco, em que as matrizes foram incubadas com tampão em vez das amostras de soro do paciente de bloqueio. Quaisquer valores que excedam o limite do sinal foram considerados como sinais reais (isto é, uma detecção positiva da citocina). Os valores mais baixos do que o sinal de corte foi atribuído um valor de 1. Se medidos valores de intensidade de sinal de todas as amostras de uma citocina particular, foram 1, aquelas citocinas foram removidos da lista para análise posterior.

Cancro do ovário

Controle saudável

Número total

3453Mean Age61.751.2Median Age6656.2Age Range26-7928-79

Cancro Characteristis

Histologia

Serous Adenoocarcinoma29Mucous Adenocarcinoma4Germline tumor1

Stage

Stage I4Stage II3Stage III IV25NA2Table 1. características população de estudo.

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Identificação de marcadores de proteína de soro por análise de Redes Neurais Artificiais (Figura 3)

3a. análise de rede neural artificial de 174 marcadores resultados matriz de anticorpo que comparam cânceres de ovário e controles saudáveis. As amostras representativas tanto o conjunto de treinamento e conjunto de previsão estão representados no gráfico.

3-B. Os 8 melhores marcadores com maior impacto na análise de rede neural artificial de matrizes de anticorpo 174-marcador em cancros do ovário e controles saudáveis ​​são apresentados.

Após a normalização e filtração, os dados foram então submetidos a neural artificial rede (ANN) análise. Os dados de intensidade de sinal para pacientes individuais foram divididos aleatoriamente em conjunto de treinamento (N = 51) ou conjunto de previsão (N = 36). Na fase de descoberta previsão, o conjunto de treinamento foi analisada utilizando leave-one abordagem de validação cruzada. Através desta análise, foram identificados um total de 8 preditores. Estes 8 preditores foram então usados ​​para prever o estado da doença, em conjunto previsão. O acordo correta do status da doença prevista utilizando o painel de 8 marcador com diagnóstico clínico no conjunto de treino e predição conjunto foi de 82% e 80%, respectivamente.

Identificação do painel 5-marcador para a detecção do câncer de ovário (Figuras 4 e 5)

Painel A (canto superior esquerdo): histograma Dot com 5-analito ponto de divisão de classificação de pontuação de soros de controles saudáveis ​​(N) e do ovário (CA). Corretamente classificados amostras de soro normais deve ter uma pontuação de 0 a 2, enquanto que amostras de pacientes com câncer ovariano deve ter uma pontuação de 3 a 5; Painel B (canto superior direito): A curva ROC para o painel 5-marcador de análise split-score de câncer de ovário vs. controles saudáveis. O ROC é a curva traçada de sensibilidade (verdadeiro positivo) contra os valores 1-especificidade (falsos positivos); Painel C (inferior direito): Table usando cinco marcador de pontuação ponto de divisão para classificar os pacientes de cancro do ovário. Utilizou-se um ponto de corte de 3.

Em seguida, estes 8 marcadores, nós escolhemos 4, estimulante de macrófagos proteína alfa (MSP-alfa), inibidor tecidual de metaloproteinases-4 (TIMP-4 ), derivado de plaquetas de alfa receptor do factor de crescimento (PDGF-R alfa), e a osteoprotegerina (OPG), por análise de agrupamento hierárquica meio do programa SPSS. Usando o painel de 4-marcador acima, 83% das amostras foram identificadas corretamente (95% dos controles saudáveis ​​e 62% dos cancros do ovário).

Finalmente, todas as 87 amostras foram analisadas por 4 marcadores séricos acima identificados mais CA125 usando análise de pontuação ponto de divisão. Usando a nota de corte de 3, cancro do ovário de 100% e 95% de amostras de controlo saudáveis ​​foram identificadas corretamente, dando o acordo correto total de 96,6%.

Desde CA125 é o marcador mais utilizado para o câncer de ovário, comparamos a AUC entre sozinho CA125 ao do nosso painel de 5-marcador, tal como determinado por curvas ROC. CA125 sozinho tem uma AUC de 0,87. Por outro lado, o nosso painel 5-marcador recentemente identificado tem uma AUC de 0,98. Assim, o nosso estudo-piloto identificou um conjunto promissor de 5 marcadores sorológicos para detecção precoce de câncer de ovário.

Validação do painel 5-marcador para a detecção do câncer de ovário com o ensaio ELISA (Figura 6)

Os níveis de dois marcadores proteicos (MSP-alfa e TIMP-4) identificados como sendo diferencialmente expressos em amostras de cancro do ovário usando matrizes de anticorpos foram confirmadas com ELISA. Os dados de matriz de anticorpo foram completamente concordantes com os dados de ELISA em classificar os soros de pacientes de cancro do ovário e controlos saudáveis. dados de matriz de anticorpo são mostrados como matriz mediana da intensidade de sinal (FI), e os dados de ELISA são apresentados como a concentração de proteína média (ng /mL).

Para confirmar a detecção multiplex dos dados de matriz, foi realizada -alvo única ensaios ELISA para medir quantitativamente os níveis de expressão destas citoquinas individualmente, e estes resultados foram comparados com os dados de matriz. Os níveis de expressão relativos de proteínas medidos por ELISA e a matriz foram semelhantes (ver Figura 6). Todos os 4 marcadores (MSP-alfa, TIMP-4, PDGF-R alfa, e OPG) identificadas por análise e separação ponto-análise pontuação ANN foram confirmados por kits ELISA. Figura 6 mostra dados representativos de dois destes marcadores, MSP-α e TIMP-4.

Discussão

CA125 é um dos mais importantes biomarcadores para o cancro do ovário. Ele é frequentemente usado de forma eficaz para monitorar a resposta ao tratamento e detecção de recorrência de câncer de ovário. No entanto, CA125 por si só não é um marcador de diagnóstico útil para a aplicação clínica devido a sua baixa especificidade; com um valor de corte de referência de 35 UI /ml, CA125 mostrou especificidade limitada de 50-60% com a sensibilidade de 98% para a doença em estágio inicial [4-6]. Elevação de CA125 é detectável em cerca de 0,2-5,9% do sexo feminino saudável e 2.2-27.8% dos pacientes com doenças ovarianas benignas [10]. Elevação de CA125 foi observada em apenas 50% da fase I pacientes com câncer ovariano e aumentou para 90% ou superior, em estágio III e pacientes com câncer de ovário IV [11].

Devido à complexidade e heterogeneidade do cancro do ovário, é pouco provável que um único biomarcador será capaz de detectar todos os subtipos e estágios da doença com uma elevada especificidade e sensibilidade. Ao pesquisar a literatura e outra fonte, Drs. Polanski e Anderson têm compilar uma lista de 1261 proteínas que se acredita ser diferencialmente expressos em câncer humano [12]. Entre eles, 260 biomarcadores candidatos são considerados como “de alta prioridade” porque eles têm sido implicados como potenciais marcadores de cancro em várias publicações na literatura, e porque a maior parte deles têm sido relatados para ser detectável no soro ou plasma. Foram incluídos muitos destes biomarcadores em nosso rastreio biomarcador baseado em anticorpos.

As citocinas são um grupo diverso de proteínas compostas por citocinas, quimiocinas, factores de crescimento, interferões, e linfocinas adipocitoquinas e desempenham muitas funções críticas do fisiológico e patológico processos. É também bem sabido que as citocinas, quimiocinas, factores de crescimento, factores de angiogénese, proteases, factores apoptóticos, receptores, moléculas de adesão e as adipocitoquinas desempenhar papéis importantes no desenvolvimento do cancro, a progressão e metástase. A evidência crescente sugere que uma rede complexa de citocinas está envolvida no cancro do ovário. Um certo número de lacetes de citocinas autócrinos e parácrinos foram identificadas no cancro do ovário e influenciam a biologia deste tumor. Detecção de padrões de múltiplas citocinas expressão pode fornecer novos insights sobre a biologia do câncer, identificar novos alvos moleculares para o tratamento do câncer e descobrir novos biomarcadores para o diagnóstico e prognóstico da doença [13,14].

Neste estudo, nós temos demonstraram a eficácia do rastreio de uma matriz de anticorpo semi-quantitativo, com base em sanduíche a detecção de um painel de 174 marcadores no soro de 34 pacientes com cancro do ovário e 53 controlos saudáveis ​​de idade para identificar um painel de marcadores de proteína 5 do soro, incluindo CA125, que pode eficazmente detectar o cancro do ovário com elevada especificidade (95%) e de alta sensibilidade (100%) com a AUC de 0,98. Estes marcadores foram validados com o ensaio de ELISA.

Observamos que CA125 sozinha tem uma AUC de 0,87, por outro lado, o nosso painel 5-marcador recentemente identificado tem uma AUC de 0,98, indicando uma maior eficiência quando a detecção de CA125 é combinado com outras 4 proteínas biomarcadores putativos para a detecção do cancro do ovário (TIMP-4, OPG, PDGF-R alfa e MSP-alfa).

TIMP-4 pertence à metaloproteinase de matriz (MMP) superfamília. MMPs são elementos essenciais na matriz extraceullular degradação (ECM), incluindo regulação da liberação de citocinas ECM-bound e fatores de crescimento, o que leva a angiogênese, invasão celular e, eventualmente, em muitos tipos de cancro, metástases. Estas MMPs são firmemente controlada e regulada por TIMPs vários, alguns dos quais parecem desempenhar um papel crítico na tumorigénese. O laboratório de Chegini relatou a expressão elevada de TIMP-4 em tecidos de cancro do ovário por análise IHC, que indica a sua potencial papel na tumorigénese do cancro do ovário [15].

OPG pertence à superfamília do TNF e pode ser relacionado com o factor nuclear potenciador da cadeia leve kappa de células activadas B (NFkB) e de necrose tumoral apoptose relacionada com o factor indutor ligando (TRAIL) vias de sinalização. OPG foi primeiro identificado pela sua capacidade para regular a homeostase de remodelação óssea. No entanto, o laboratório de Piche relatado que a OPG pode servir como tal factor de sobrevivência, protegendo a apoptose induzida por TRAIL em células de cancro do ovário, indicando o seu potencial papel no desenvolvimento e progressão do cancro do ovário [16].

PDGF-R alfa é um receptor da superfamília PDGF em. Servindo como factores de crescimento angiogénicos, PDGFs desempenham um papel importante no crescimento de células, a quimiotaxia, a angiogénese e, no contexto do cancro, a reconstrução do microambiente do estroma do tumor. O laboratório de Jakobsen relatado que o PDGF-R alfa mostrou expressão mais elevado em tecidos de cancro do ovário, em comparação com os tecidos normais adjacentes [17]. Também foi relatado que o PDGF-R alpha é expresso com mais freqüência em carcinomas serosos do que nos endometriod e tumor mucinoso [18], o que é consistente com os resultados do nosso estudo, em que a maioria dos tumores testados (29 de 34) foram serosa .

MSP é um fator de crescimento envolvidos na activação de macrófagos estimulante do receptor-1 (MSTR1). A cadeia alfa de MSP (MSP-alfa) é segregada por clivagem da pró-PEM. Existem relatórios mostrando que a via de MSP desempenha um papel importante na metástase tumoral [19].

Em resumo, usando 174-marcador tecnologia de matriz de anticorpo citoquina, foram identificados um painel de marcadores de proteína de soro 5, que pode detectar de ovário câncer tanto com elevada especificidade e sensibilidade elevada, indicando a sua aplicação promissora na medicina personalizada para a detecção de câncer de ovário. Além disso, considerando que uma parte relativamente pequena do tamanho da amostra (N 100) utilizado nesta investigação alcançou uma sensibilidade extremamente alta (100%) e relativamente elevada especificidade (95%), oferecemos alguma esperança de que a validação do painel multi-biomarcador pode um dia ser útil para o rastreio de um câncer mortal que raramente é diagnosticada em seus estágios iniciais.

proteínas e anticorpos matrizes emergiram como uma tecnologia promissora para estudar a expressão de proteínas e função das proteínas de uma forma de alto rendimento. Estas matrizes de proteínas e anticorpos apresentar uma nova oportunidade ao perfil níveis de expressão de proteínas em amostras de pacientes com câncer e identificar biosignatures úteis para o desenvolvimento de medicamentos e assistência ao paciente. O nosso painel 5-marcador pode efetivamente distinguir cânceres de ovário de controles saudáveis ​​Estes 5 marcadores individuais não são exclusivos do cancro do ovário, como mostrado por sua expressão em outros tipos de câncer, incluindo câncer de mama [18-22], cancros do pulmão [23], colorretal cancros [24], os cancros da próstata [25,26], carcinoma hepatocelular [27], cancros pancreáticos [28], etc. por isso, será muito importante e interessante investigar se esta combinação de 5-marcadores pode detectar outros tipos de câncer também. Dois dos componentes mais importantes no programa de descoberta de biomarcadores são de alta qualidade das amostras dos pacientes e tecnologias de alto teor de triagem e de alto rendimento. Portanto, a combinação de tecnologia de detecção baseada em anticorpos comprovada e plataformas de nós e amostras de pré-diagnóstico bem caracterizados de PLCO no National Cancer Institute (NCI), proporcionará uma oportunidade única para a descoberta de biomarcadores e validação [29,30]. Tais investigações não só vai servir para validar o painel de biomarcador específico identificado neste estudo; eles vão ajudar a validar a utilização de matrizes de anticorpo como uma abordagem de alto throuput para identificar biomarcadores de câncer para o rastreio da doença e detecção.

Materiais e Métodos

Este protocolo foi aprovado pela revisão institucional esterlina borda. IRB ID: 3303. O conselho de revisão é o serviço esterlina independente, Inc localizado em 6300 Powers Ferry estrada, suite 600-351, Atlanta, GA 30339. Foi obtido consentimento escrito ao recolher amostras de pacientes e controles saudáveis ​​

Ética Declaração

foi obtido consentimento escrito ao recolher amostras de pacientes e controles saudáveis.

coleta de amostras

As amostras de soro de 34 pacientes com diagnóstico de início de carreira (I e II) ou em estágio avançado (III e IV) cancros do ovário e 53 controles saudáveis ​​pareados por idade incluídos no estudo foram coletadas a partir do hospital filiado, Sun Yat-sen University. Resumidamente, cerca de 2 ml de sangue venoso foi retirada de pacientes. O soro foi recolhido e armazenado a -80 ° C até ser necessário. Informações sobre o diagnóstico de câncer de ovário, estadiamento, histologia, o grau ea idade estava disponível para nós, mas os identificadores de doentes únicas, tais como nome, endereço, dia do nascimento, não foi fornecido.

array Antibody Technology

matrizes de anticorpo à base de sanduíche Semi-quantitativos (RayBio

® citocinas humano matriz G-Series 2000) foram desenvolvidos como 3 matrizes distintas (Human Cytokine Arrays G6, G7 e G8), cada um representando um conjunto único de 54 para anticorpos 60 específicos para o antigénio para detectar um total de 174 marcadores de soro numa matriz de lâmina de vidro. Um par de anticorpos é necessário para detectar cada analito. lâminas de vidro foram impressos como 4 ou 8 sub-matrizes idênticas que consistem em pontos de cada anticorpo apture antígeno-específica para essa matriz. Os anticorpos de detecção correspondentes foram e combinados como um único reagente cocktail para uso posterior marcado com biotina. slides impressos foram colocados em conjuntos de câmaras, para permitir a incubação de cada sub-matriz com uma amostra diferente. Após o bloqueio cada sub-matriz com um tampão de bloqueio, sub matrizes foram incubadas com as amostras de soro. A seguir a uma lavagem exaustiva para remover a ligação não específica, o cocktail de anticorpos de detecção biotinilados foram adicionados às matrizes. Após lavagem extensiva, as lâminas de matriz foram incubadas com um Fluor conjugada com estreptavidina (HiLyte Fluor ™ 532, a partir de Anaspec, Fremont, CA). Os sinais fluorescentes foram então visualizadas utilizando o sistema de scanner a laser (GenePix 4200A, Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) utilizando o canal verde. Para aumentar a precisão, duas repetições por anticorpo foram vistos, e as médias das intensidades de sinal médio para ambos os pontos (menos subtração de fundo local) foram utilizados para todos os cálculos. Através destas melhorias, podemos obter um coeficiente de variação (CV) de cerca de 10%, utilizando nossa plataforma de lâmina de vidro.

análise ELISA

ELISA foi realizada de acordo com o manual RayBio® ELISA (RayBiotech , Inc., Norcross, GA, EUA). Em resumo, pré-revestidas placas de 96 poços de ELISA com anticorpos capturados foram primeiro bloqueadas com um tampão de bloqueio. aliquotas duplicadas (100 microlitros por poço) de soros diluídos e várias diluições (i.e., as concentrações de proteína padrão) foram carregadas numa placa de ELISA. As placas foram então incubadas durante 2 h à temperatura ambiente (RT). os materiais não ligados foram lavados, e o anticorpo de detecção anti-citocina biotinilado foi adicionado a cada poço. As placas foram incubadas durante 1 h a RT. Após a lavagem, 100 microlitros de reagente HRP-estreptavidina conjugada foi adicionada aos poços, e a placa foi incubada durante 30 minutos à TA. Após lavagem extensiva, o desenvolvimento da cor foi realizada por incubação com o substrato HRP. Após a adição de solução de paragem, a densidade óptica (DO) a 450 nm foi determinada para cada poço utilizando um leitor de microplacas, e as concentrações das amostras foram determinadas por comparação com as curvas de concentração padrão.

Análise

Dados

Um t-teste ajustado foi utilizado para testar a significância entre os níveis de expressão de proteína em amostras de cancro do ovário e de controlo saudáveis.

P

valores inferiores a 0,05 foram considerados como sendo estatisticamente significativo.

Para determinar o limiar de sinal, os sinais a partir dos painéis foram medidos na ausência de amostras utilizando tampão (como branco de bloqueio) e repetido 10 vezes. Os sinais gerados usando espaços em branco se a média e calculou-se o desvio padrão (SD). Os sinais com valores mais baixos do que o sinal em branco média + 2xSD foram consideradas como pano de fundo.

Os dados foram também analisados ​​usando a rede neural. Esta poderosa ferramenta permite-nos a encontrar perfis de expressão de proteína comum para prever câncer. Na primeira fase do estudo, 80% das amostras foram aleatoriamente designados para conjunto de treino e os restantes 20% das amostras foram utilizadas como conjunto de teste. A vantagem desta abordagem é o sucesso da previsão irá tornar-se mais preciso ao longo do tempo, como se tornar disponíveis mais dados.

Os dados também foram analisados ​​por análise de pontuação de ponto de divisão. O ponto de divisão divide o espaço amostral em dois intervalos, um para o cancro do ovário e um para controles normais. A melhor pontuação do ponto de divisão de cada marcador foi escolhida para assegurar a minimização de amostras classificadas incorretamente. Para cada marcador, uma pontuação de 0 foi atribuído a uma amostra se caísse no intervalo de controle normal para esse marcador; uma pontuação de 1 foi atribuído a uma amostra se caísse no intervalo de cancro do ovário. No geral, um indivíduo foi atribuída uma pontuação como a soma dessas notas atribuídas para

N

diferentes marcadores. Portanto, a gama de tais placar de 0 a

N

. Um limite determinado (

T

) foi escolhido para o cancro do ovário de forma otimizada separado de controles saudáveis, ou seja, um determinado indivíduo com uma pontuação total

T

está previsto para ter status normal, ao passo que um indivíduo com uma pontuação total .

T

foi diagnosticado como câncer de ovário

a partir dos dados acima, calculou-se a especificidade, sensibilidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN) . Também foi determinado o ROC.

Reconhecimentos

Agradecemos Brett Burkholder para discussões construtivas e edição deste documento.