Abstract

Reconstituição do desenvolvimento de tumores em ratinhos imunodeficientes a partir de células tumorais humanas primárias desagregados é sempre um desafio. O objetivo principal do presente estudo é estabelecer um sistema de ensaio de confiança que nos permitiria reconstituir reprodutível de regeneração do tumor de próstata humana em ratos usando células individuais derivadas de tumores de pacientes. Usando muitos dos sem tratamento do cancro da próstata humana primária 114 (HPCA) amostras que temos trabalhado, aqui vamos mostrar que: 1) o subcutâneo representa o local mais sensível que permite que a enxertia das peças HPCA implantados; 2) células primárias HPCA por si só não conseguem regenerar tumores em hospedeiros imunodeficientes; 3) quando co-injectado em Matrigel com rUGM (rato urogenital mesênquima sinus), CAF (fibroblastos associados a carcinoma), ou células HS5 (osso imortalizado medula estromal derivada), as células HPCA primário falhar para iniciar tumores em série transplantáveis ​​em camundongos NOD /SCID; e 4) no entanto, as células HPCA co-injectado com as células HS5 em mais imunodeficientes NOD /SCID-IL2Rγ

– /- (NSG) ratos prontamente regenerar tumores em série transplantáveis. O HPCA /HS5 reconstituído tumores da próstata ” apresentam uma morfologia epitelial geral, são de origem humana, e contêm células positivas para AR, CK8 e racemase. A análise citogenética fornece uma evidência adicional quanto à presença de células HPCA cariótipo anormais nos tumores HPCA /HS5. De importância, tumores de xenoenxerto HPCA /HS5 conter EpCAM

+ células que são clonogênica e tumorigénico. Surpreendentemente, todos os tumores HPCA /HS5 reconstituídas são indiferenciado, mesmo para células HPCA derivados de Gleason 7 tumores. Nossos resultados indicam que as células HPCA primários co-injectado com as células estromais HS5 imortalizadas gerar tumores indiferenciados em camundongos NSG e nós fornecemos evidências de que indiferenciadas células HPCA pode ser

as células

que possuíam tumorigênico potencial e regeneradas tumores de xenoenxerto HPCA /HS5.

Citation: Chen X, Liu B, Li Q, Honorio S, Liu X, Liu C, et al. (2013) células cancerosas da próstata dissociado primária Humano co-injectado com as culas imortalizadas HS5 de Medula Óssea do estroma Gerar indiferenciado tumores em NOD /SCID-γ. PLoS ONE 8 (2): e56903. doi: 10.1371 /journal.pone.0056903

editor: Amit Singh, da Universidade de Dayton, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de outubro de 2012; Aceito: 15 de janeiro de 2013; Publicação: 22 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas do NIH (R01-CA155693-01A), Departamento de Defesa (W81XWH-11-1-0331), o financiamento CPRIT (RP120380) e do Centro de Câncer MD Anderson Cancer Center for Epigenética e Laura e John Arnold Foundation RNA Centro concessão piloto (a DGT) e por dois Grants Center (CCSG-5 P30 CA016672-34 e ES007784). XC foi apoiada por Cockrell bolsa do Departamento de Molecular Carcinogênese, M.D. Anderson Cancer Center. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. O autor correspondente, o Dr. Dean Tang, é atualmente um editor Acadêmico de PLOS ONE e que co-autor Dr. Dean Tang é um membro do PLOS ONE Editorial Board. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de próstata (PCA) é o tumor maligno líder com estimados ~241,740 novos casos e ~ 28,170 mortes nos EUA, em 2012 [1]. A etiologia para CaP permanece enigmática e as células de origem do PCA resistente à castração (ou seja, CRPC), a doença letal que mata a maioria dos pacientes permanece mal definida. cancros humanos abrigar uma população de células estaminais de cancro, como operacionalmente denominado cancro de células estaminais (CSCs), que se crê ser responsável pela iniciação do tumor, promoção, progressão, metástase, e resistência ao tratamento [2]. Trabalho de nosso laboratório e muitos outros ‘sugere que CaP humano também contém células cancerosas tronco-like [3] – [32]. Como CSCs em outros tumores [33], CSCs próstata são heterogênea contendo muitos subconjuntos com capacidade de regeneração do tumor distinto. De nota, CSCs próstata relatados por vários grupos são menos diferenciada expressando pouca /nenhuma AR (receptor de androgénio) e PSA (antígeno específico da próstata). Recentemente, usando um repórter GFP lentiviral-driven promotor PSA, temos purificado out diferenciado (PSA

+) e indiferenciadas (

PSA – /lo) células PCA para perfil de expressão gênica e estudos funcionais e descobriu que o PSA

– população de células /lo abriga células-propagação do tumor a longo prazo que resistem à castração [25]. Nosso estudo sugere que a PSA indiferenciado

– população de células /lo CaP provavelmente representa um pré-existente de células de origem para CRPC [25]

Uma pergunta sem resposta fundamental é saber se semelhante estaminais-como CaP. células com propriedades melhoradas de propagação do tumor também existem em amostras humanas primárias PCA (HPCA). A razão que esta questão importante tem evitou uma resposta definitiva reside no fato de que ainda temos de estabelecer um sistema de ensaio de confiança que pode reprodutível e fielmente reconstituir a regeneração do tumor a partir de células individuais HPCA dissociadas [14]. modelos CaP mais usados ​​atualmente são derivados a partir de qualquer camundongos geneticamente modificados onde os genes específicos são sobre-expressos ou nocauteado ou de xenoenxertos utilizando linhas celulares de cancro humanos ou peças tumorais inoculadas ortotopicamente ou ectópica em ratos imunodeficientes [34]. Por muitas razões, modelos de ratos com CaP possuem características histopatológicas que não são inteiramente representante do CaP humano, que são muitas vezes caracterizada por múltiplas alterações genéticas que estão além da capacidade de qualquer modelos geneticamente modificados podem recapitular. Além disso, uma mutação genética específica pode resultar em fenótipos biológicos e histológicos distintos em animais em relação ao tempo humano [35]. Em contraste, os modelos de xenoenxerto são amplamente estudados para a facilidade de utilização. Eles são de origem humana e, portanto, acredita-se melhor recapitular tumores humanos em termos das características histopatológicas e moleculares [34]

Vários xenotransplantes CaP amplamente utilizados, tais como a série LAPC e LuCaP [36] -. [ ,,,0],38], foram estabelecidas através da implantação de pedaços de tumor de próstata humanas em camundongos. xenoenxertos CaP também podem ser criados por injecção de linhas de células estabelecidas tais como CaP PC3, DU145, LNCaP e [39]. Devido ao facto bem conhecido que as células CaP localizada ou PCA raramente formar tumores em ratinhos imunodeficientes [39], os exemplos acima mencionados de xenoenxertos ou linhas celulares foram estabelecidos a partir de metástases, e eles representam apenas uma minoria de CaP humano cirurgicamente removido e não reflecte completamente a heterogeneidade da doença [40]. Recentemente, têm sido feitos esforços para gerar xenoenxertos CaP por enxerto de peças localizadas CaP [41], [42] ou células primárias de CaP recombinado com mesênquima rato neonatal [43] na cápsula renal. Os xenoenxertos regeneradas parecem assemelhar-se, histologicamente, os tumores doador paciente, mas se eles poderiam ser passadas em série é desconhecida.

O principal objetivo do nosso projeto atual é estabelecer um sistema de ensaio de confiança que nos permitiria reproducibly e reconstituir fielmente a regeneração do tumor de próstata humano em ratos usando células únicas derivadas HPCA-tumorais do doente. Nós fizemos anteriormente alguns esforços para atingir este objectivo, mas a maioria dos nossos protocolos de reconstituição falhou completamente para regenerar tumores [14]. Aqui, nós utilizamos muitas das 114 amostras de prostatectomia não tratados, variando de classificação de Gleason (GS) de 6 a 10, para preparar as células cancerosas epiteliais individuais, os quais foram então recombinados com diferentes células estromais incluindo rUGM, fibroblastos associada a carcinoma (FAC), células ou osso imortalizadas derivadas da medula do estroma (HS5), e implantado em diferentes sítios anatômicos em qualquer NOD /SCID ou NOD /SCID-IL2Rγ

– ratinhos (NSG) – /. A seguir, apresentamos os resultados de nossos estudos abrangentes.

Materiais e Métodos

Todos os estudos relacionados a animais deste projecto foram aprovadas pelo MD Anderson Cancer Center IACUC (Institutional Animal Care e do Comitê Use ; ACUF # 08-05-08132). A pesquisa atual não envolve seres humanos (ou seja, indivíduos que vivem ou informações pessoais identificáveis), embora isso envolve amostras HPCA primários obtidos a partir de nossos médicos que colaboram sob a cobertura do IRB (Institutional Review Board) Número do protocolo LAB04-0498. Todos os outros estudos aqui apresentados foram o e não necessitam de aprovação de outros órgãos reguladores.

Cells, reagentes e Animais

PC3, DU145, foram obtidos LNCaP e células Swiss 3T3 iniciado pelo investigador a partir de ATCC. A linha celular de HS5, que foi gerado a partir de medula óssea humana e imortalizadas por transdução com vírus do papiloma humano E6 /7 genes [44], foi gentilmente cedido pelo Dr. M. Andreeff (M.D Anderson Cancer Center). fibroblastos de carcinoma associado (FAC) foram preparados como descrito anteriormente [45]. Todas as células foram cultivadas em meios contendo recomendadas inactivado com calor 7% de FBS, 100 ug /ml de estreptomicina, e 200 U /mL de penicilina (Gibco). A testosterona foi adquirida a Sigma. A linha de xenotransplante TRPC foi fornecido pelo Dr. Palapattu [46]. ratinhos imunodeficientes (NOD /SCID, NSG, RAG2;. ver ref 14 sobre as propriedades dessas linhagens animais) foram inicialmente comprados a partir do Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) e as colónias reprodutoras foram estabelecidos em nosso biotério e mantidos em padrão condições de acordo com as diretrizes institucionais. Os anticorpos utilizados neste estudo são apresentados na Tabela S1.

histológica e imuno-histoquímica (IHC) Análises

tecidos tumorais recolhidas a partir de tumores de doentes e xenoenxertos reconstituídos foram fixados em 10% de formalina tamponada neutra por 24 h seguido por 70% de etanol e inclusão em parafina. Secções (4 mm) foram cortadas e coradas com hematoxilina e eosina (HE). Para IHC, as secções foram desparafinadas e a actividade da peroxidase endógena e hidratado foi bloqueada com 3% H

2O

2 em água durante 10 min. Antigénio de recuperação foi realizado com 10 mM de tampão de citrato (pH 6,0) durante 10 min num forno de microondas seguido por um 20-min arrefecer e lavagem completa. As lâminas foram incubadas com Biocare reagente bloqueador (# BS966M com caseína no tampão) durante 10 minutos para bloquear a ligação não específica. As lâminas foram incubadas com vários anticorpos primários durante 30 minutos à temperatura ambiente, e lavou-se duas vezes em tampão fosfato e em seguida incubadas em biotinilado de cabra anti-coelho ou IgG de murganho (Vector Laboratories, Burlingame, CA) a uma diluição 1:500 durante 30 min à temperatura ambiente. Depois de lavagem exaustiva, elas foram incubadas com SA-HRP (BioGenex, San Ramon, CA) durante 30 min à temperatura ambiente, seguido por lavagem. Finalmente, essas lâminas foram incubadas com substrato BioGenex DAB (desenvolvimento de cor cuidadosamente monitorizados sob um microscópio) e ligeiramente contrastadas com hematoxilina. As imagens foram capturadas usando uma câmera MagnaFire, e montar toda lâminas foram digitalizados usando um sistema Aperio ImageScope.

Aperio assistida Morphometric Análise

HE ou IHC manchado lâminas de vidro contendo paciente ou xenotransplante de tumores eram digitalizados usando a plataforma de imagem ScanScope Aperio (Aperio Technologies, Vista, CA, EUA), com um objectivo de 20 × em um período de amostragem espacial de 0,47

μ

m por pixel. escorregas inteiros imagens foram vistos e analisados ​​usando computadores pessoais de mesa equipados com o software ScanScope livre.

Purificação de células tumorais a partir de amostras de pacientes primários e Xenoenxerto Tumores

Os procedimentos básicos foram recentemente descrita [14 ]. amostras de CaP primários foram obtidos a prostatectomia radical com o consentimento dos pacientes de acordo com as diretrizes MDACC Institutional Review Board (IRB LAB04-0498). Nenhum dos pacientes recebeu qualquer tratamento antes da cirurgia.

para amostras de pacientes

, tecidos tumorais obtidos de fresco a partir de prostatectomia foram cortados em fragmentos de ~ 1 mm

3 peças e tecidos são submetidos a digestão enzimática (colagenase de tipo I, mais ADNase a 50 U /ml) durante 8-10 h a 37 ° C. Após a digestão, Organóides epiteliais são enriquecidas por uma breve centrifugação seguida por digestão com tripsina (0,05%, Gibco) num agitador rotativo a 37 ° C durante 15-30 minutos para libertar as células epiteliais.

Para xenoenxertos

, tecidos de tumor foram incubadas com 1 × Accumax (1200-2000 U actividade proteolítica /ml contendo colagenase e ADNase; Innovative Cell Technologies, Inc.) em 10 ml por grama de tecido durante 30 minutos à temperatura ambiente sob rotativa condições. suspensão de uma única célula foi obtido por filtração do sobrenadante através de um pré-humedecido 40 mícrons filtro de células e a suspensão de células foi então suavemente carregado sobre uma camada de Histopaque-1077 (Sigma) passo de purificação gradiente para remover a maioria das células vermelhas do sangue, morto as células e detritos. Finalmente, a mistura de células resultante foi sujeita a um kit para a depleção de células MACS linhagem (Miltenyi Biotec) e o cocktail (anti-CD3, 14, 16, 19, 20, 45, 56, e 140b para os tumores do paciente; H2K

d para xenoenxertos) para remover o Lin

+ células incluindo hematopoiética, endotelial, e outras células do estroma (músculo liso, células mioepiteliais, fibroblastos, etc) para amostras de pacientes, ou células do estroma rato para tumores de xenoenxerto, respectivamente.

Experiências Tumor Transplante

células purificadas CaP (acima), isoladamente ou em combinação com células auxiliares incluindo rUGM, FAC, ou células HS5, são implantados por via subcutânea (sc) ou sob a cápsula renal (KC) de ratinhos imunodeficientes. Como alternativa, pedaços ou fragmentos de HPCA foram enxertados subcutaneamente, sob a KC, ou na próstata do rato anterior (AP). Os procedimentos básicos para estes transplantes foram previamente descritos [14]. Resumidamente,

para implantes s.c

, as células tumorais foram injectadas, em 40 ul de meio contendo 50% de Matrigel, por via subcutânea em 6-8 semanas de idade murganhos machos suplementadas com testosterona exógena.

Para transplantes KC

, as células CaP foram misturadas com 250.000 células rUGM e recombinantes de tecido foram feitas em colágeno rato-cauda e incubadas durante a noite. Os recombinantes de tecido foram transplantadas manhã seguinte sob a cápsula renal de ratos receptores masculinos suplementadas com peletes de testosterona.

Para AP enxertia

, pequenos pedaços de tecidos HPCA foram diretamente implantado. Em alguns casos, as células HPCA em números diferentes foram primeiro misturadas com colagénio de rato e incubou-se em uma placa de cultura de tecidos a 37 ° C durante 10-15 min. Em seguida, as peletes de células foram solidificados delicadamente cobertos em meio e cultivadas durante 4 h até durante a noite antes da implantação. Uma incisão transversal foi feito na parte inferior do abdómen para expor o AP, puxando parcialmente a bexiga, da próstata e das vesículas seminais para fora da cavidade abdominal. Uma incisão de 2-3 mm foi feita no AP através do túbulo entre as duas condutas principais com o auxílio de uma agulha de calibre 22. Utilizando uma ponta de pipeta de vidro arredondada-fogo, os pontos de colagénio foram inseridos num bolso formado no âmbito do túbulo próstata. Depois, os órgãos foram substituídos e a parede do corpo e pele fechada.

Em todas as experiências acima, o desenvolvimento do tumor foi monitorizado a partir da segunda semana. Tumorigenicidade foi medida essencialmente por incidência de tumores (isto é, o número de tumores /o número de injecções), latência (isto é, o tempo de injecção para a detecção de tumores palpáveis), o volume do tumor e peso do tumor de extremidade.

Western Blotting

lisados ​​celulares totais foram preparados em tampão RIPA completo (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM, 1% de Nonidet P-40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,5% de Triton X-100, 10 mM EDTA) contendo mistura de inibidor de protease. As concentrações de proteína foram determinadas pelo kit de MicroBCA (Pierce). Várias quantidades de proteínas foram carregados em um 15% de SDS-PAGE. Western blotting foi realizado como padrão utilizando ECL Plus (PerkinElmer).

Transcrição Reversa (RT) -PCR Análise

O ARN total foi extraído a partir de pedaços de tumor ou células de cancro cultivadas utilizando Trizol (Invitrogen), e utilizado em análise de RT-PCR. Os iniciadores de PCR incluíram AR humana (sentido directo: 5′-GCTAAAGACTCGGAGGAAGCAAG-3 ‘; anti-sentido: 5′-TGGGGGAAAACAGAGGGTTC-3′); PSA (sentido: 5’-TGGGAGTGCGAGAAGCATTC-3 ‘; anti-sentido: 5′-GCTGTGGCTGACCTGAAATACC-3′); β-actina (sentido: 5’-CTGGCACCACACCTTCTACAATG-3 ‘; antisense: 5’AATGTCACGCACGATTTCCCGC-3’)

Cariotipagem e Instabilidade Genômica

As células foram expostas a Colcemid (0,04

μ

g /ml) durante 25 min a 37 ° C e, em seguida, a uma solução hipotónica (0,075 M de KCl) durante 20 min à temperatura ambiente. As células foram fixadas numa mistura de metanol e ácido acético (03:01 em volume) durante 15 min, e lavou-se três vezes no fixador. As lâminas foram secas ao ar, de forma óptima idade, e G-unida utilizando uma solução de tripsina e corados em Giemsa seguindo o procedimento de rotina. As imagens foram capturadas usando um microscópio Nikon 80i equipado com software cariotipagem da Applied Spectral Imagem (ASI) Inc. (Vista, CA). e um mínimo de 15 metafases G-faixas foram cariotipadas.

células activadas por fluorescência (FACS) e Purificação de EpCAM

+ Células

HPCA /HS5 células tumores de xenoenxerto foram tratados com agente bloqueador de FcR (Miltenyi Biotec) durante 10-15 min a 4 ° C e coradas com PerCP-eFluor 710 de anticorpo anti-EpCAM e conjugado biotinilado de rato H-2K

d anticorpo durante 30 min a 4 ° C. As células foram então lavadas com PBS e marcadas com Alexa Fluor 405 conjugado com estreptavidina (Invitrogen, S-32351) durante 10 min a 4 ° C. EpCAM

+ e EpCAM

– as células foram ainda purificados utilizando FACS [21], [25]. Pós-análise revelou purezas de ambas as populações sendo . 98%

Sphere ensaios de formação de

Os procedimentos básicos para ensaios de formação de esfera foram previamente descritos [21], [25]. Nós purificado EpCAM

+ células dos tumores de xenoenxerto HPCA /HS5 via MACS, e cultivaram-se em epiteliais da próstata sem soro meio basal (PrEBM) contendo B27 (Invitrogen), 20 ng /ml de EGF e bFGF em Purecol (Advanced BioMatrix, # 5005-B) revestido frascos T-25. Quando estas células foram confluentes, as células que colhidas através de 0,05% de tripsina /EDTA, e plaquearam-se as células individuais em placas de 6 poços-ULA a uma densidade de 5.000-10.000 células /poço. Esferas foram marcados no ~ 2 semanas. Para os ensaios de formação de esfera em série, as esferas de primeira geração foram colhidas com 0,025% de tripsina /EDTA, triturou-se com uma agulha de 27 G, filtrada através de um filtro de 40 mícrons, e novamente plaqueadas como acima. Este processo foi repetido por até 3-4 gerações.

Análise Estatística

frequências das células iniciadoras de tumores foram comparados por meio de testes de razão de verossimilhança. As diferenças na taxa de tumor-take foram determinados pelo teste de proporção. A significância estatística foi definida como

P

. 0,05

Resultados

HPCA pedaço do tumor xenotransplantes apresentam maior Toma a subcutânea local do que em outros locais

A nossa laboratório funcionou até agora em 114 amostras de pacientes recém-obtidas de prostatectomia. Algumas destas amostras foram usados ​​nos nossos estudos anteriores [13], [14], [21], [22], [25], [31] e a maioria deles foi usado no projecto actual (Tabela S2). Das amostras HPCA 114, 15,8% tinham combinado Gleason Score (GS) 6, 52,6% GS7, 11,4% GS8, e 20,2% GS9. Em geral, as amostras foram usadas HPCA em 2 tipos de experiências:. Transplantado quer, como pequenos pedaços, em ratos imunodeficientes macho para gerar xenoenxertos ou utilizadas células individuais isoladas de fresco para in vitro e estudos in vivo (Fig. 1)

Para os estudos de xenotransplante, implantamos peças tumorais (~2-3 mm

3) em três locais diferentes anatômicas [14], ou seja, tecido subcutâneo (SC), cápsula renal (KC), ou anterior da próstata (AP) em uma das linhagens de camundongos de três imunodeficientes, ou seja, NOD /SCID, RAG2

– /- ou NOD /SCID-IL2Rγ

– /- (NSG) camundongos. NOD /SCID carecem de ambas as células T e B e têm déficit funcional (embora não deficiência completa) em células NK e RAG2

– /- ratos também não possuem células T e B ao passo que os ratinhos NSG são as mais imunodeficiente falta T, B células, e NK [14], [47]. Conforme resumido na Tabela 1 e detalhado na Tabela S3, em cada estirpe de ratinhos e com cada grau de HPCA, os implantes s.c apresentou a maior tumor tomar em comparação com KC e AP xenotransplantes. Além disso, em ratinhos NOD /SCID, que foram usadas na maioria das vezes, observou-se o aumento de tumores leva com o aumento do grau do tumor em s.c. e locais de KC (Tabela 1; Tabela S3). Curiosamente, o aumento associado de grau do tumor em tomada de tumor não foi observada em ratinhos RAG2 e NSG, e amostras HPCA xenotransplantadas em ratinhos NSG não exibiram um aumento no tumor leva em comparação com os implantados em ratinhos NOD /SCID (Tabela 1; Tabela S3 )

células HPCA, ao contrário HPCA Pieces, Falha de Re-iniciar tumores em ratinhos NOD /SCID:. Não apresentou efeitos significativos com rUGM, FAC, e (medula óssea) do estroma (culas imortalizadas Humanos osso HS5)

Subsequentemente, foi perguntado se células HPCA isolados de fresco, em vez de pedaços de tumor, também poderia regenerar tumores em qualquer um dos ratinhos imunodeficientes. No início, nós recombinados células HPCA com rUGM para transplantes KC [48] – [50] ou misturado as células HPCA em 50% Matrigel para injecções s.c. em NOD sexo masculino /SCID [14]. Em 3 GS6 HPCA (HPCa9, 10, e 16) amostras, quando 10.000 a 100.000 células recombinadas com HPCA rUGM foram implantados sob a KC, observou-se 0/30 excrescência (ver Tabela 4 na ref. 14). Da mesma forma, em 2 GS7 HPCA (HPCa11 e 14) amostras, quando 10.000 a 200.000 células HPCA recombinados com rUGM foram implantados sob a KC, observou-se 0/17 excrescência (Tabela 4 na ref. 14). Finalmente, quando 1 milhão de células HPCa18 (GS7) foram injectados s.c. em 50% de Matrigel, não houve único tumor de 4 injecções (Tabela 4; Ref. 14). Nós então purificado CD44

+, CD133

+ ou CD44

+ CD133

+ (e correspondente marcador negativo) HPCA células a partir de 4 tumores GS6 (HPCA 9, 10, 13 e 16), 4 tumores GS7 (HPCa4, 6, 8, e 12), e um tumor GS9 (HPCa42) e implantadas aumento do número de células (de 1.000 a 2.000.000) por via subcutânea (para as células GS9 HPCA) ou na KC ou AP (para o resto) dos ratinhos NOD /SCID machos e observou-se 0/225 excrescências (Tabela 6 na ref. 14). Também purificado CD44

+ /CD44

– células HPCA de 3 GS8 (HPCa25, 32, e 33) e uma GS9 primário (HPCa24) (1 °) xenoenxertos e implantados 1.000 a 500.000 células em 50% de Matrigel em o local mais sensível, ou seja, tecido subcutâneo de ratos NOD /SCID machos. Mais uma vez, nós não observamos a regeneração do tumor de 52 implantes (Tabela 6 na ref. 14). Finalmente, quando as células HPCA não triados purificado a partir de 3 tumores GS6 (HPCa2, 10, e 16), 4 tumores GS7 (HPCa3, 11, 14, e 18), 2 tumores GS8 (HPCa15 e 37), e 2 tumores GS9 (HPCa5 e 21), quer injectados por via subcutânea sozinho em Matrigel ou recombinada com rUGM e depois transplantadas sob a KC, deu origem a 0/92 tumores (Tabela 7 na ref. 14). Em todos estes experimentos de transplante, os ratos NOD /SCID machos foram suplementados com pelotas exógenos de testosterona.

Em seguida, co-injetaram células HPCA indiferenciados ou ordenadas por marcadores com FAC, que têm sido relatados para promover o desenvolvimento do tumor em alguns sistemas experimentais [51], por via subcutânea ou sob a KC de camundongos NOD sexo masculino /SCID com suplemento de testosterona. Observamos 3 excrescências de um total de 56 injecções (Tabela S4). No entanto, os 3 outgrowths não estavam em série transplantáveis ​​(Tabela S4).

Recentemente, osso humano medula derivada estromais mesenquimais (ou STEM) células (MSCs) foram mostrados para integrar-se no estroma associado ao tumor e promover mama a metástase de células de cancro [52]. Nós se perguntou se MSCs pode facilitar a reconstituição do tumor por células HPCA primários. A linha celular de HS5, gerado a partir de medula óssea humana, foi imortalizada por transdução com vírus do papiloma humano E6 /7 genes [44], e tem sido demonstrado para suportar a proliferação de células em culturas de CaP [53], [54]. Assim, por via subcutânea co-injectado (isto é, CD44) células HPCA (de 2 GS6, 3 GS7, 4 GS8 e 1 tumores GS9) com 100.000 células HS5 em NOD camundongos não triados ou classificadas-marcador /SCID. Observou-4 tumores em um total de 54 injecções (Tabela S5). Mais uma vez, os 4 tumores regeneradas não poderia ser transplantadas em série (não mostrado). células HS5 sozinho não gerar tumores em ratinhos NOD /SCID a ≤ 100.000 células (dados não apresentados).

Tomados em conjunto, o nosso anterior (Ref. 14, Tabelas 4, 6, e 7) e corrente (Tabela ) estudos S4 e S5 indicam que

in NOD /SCID não são permissivas para a reconstituição de tumores transplantáveis ​​a partir de células primárias HPCA, mesmo na presença de rUGM, FAC, ou MSC, tais como HS5

.

células HS5 induzir as células HPCA para iniciar transplantáveis ​​tumores em ratos NSG

E se nós utilizamos ratos NSG mais imunodeficientes? Nós primeira injetado recém-purificado células HPCA primárias a partir de 5 tumores de pacientes (2 GS7, 1 GS8, 2 GS9) por via subcutânea em ratinhos NSG. Em um total de 37 injecções, não observamos qualquer crescimento tumoral após 8 meses (Tabela 2). Como as células HS5 aumentou ligeiramente a regeneração do tumor de células HPCA em NOD /SCID (Tabela S5), que por via subcutânea co-injectado células HPCA não ordenados a partir de 9 amostras de pacientes com células HS5 em ratos NSG e, curiosamente, este modificado “protocolo de recombinação ‘induziu a formação de tumores em 41/59 (isto é, ~ 70%) injecções (Tabela 3). HPCA células derivadas a partir de 3 GS9, 1 GS8, e 4 tumores GS7 todos os tumores regenerado quando co-injectado com células HS5 (Tabela 3). Também estabelecemos 1 ° xenoenxertos em ratinhos RAG2 de pedaços de 3 outras amostras HPCA (isto é, HPCa57, 58 e 70). Quando o 1 ° células de xenotransplante foram purificados para fora e co-injectado com células HS5 em masculino RAG2 ou ratos NSG, prontamente obtido o 2 ° xenotransplantes [21, 25; dados não mostrados]. No total, nós estabelecemos a 11 HPCA /HS5 xenoenxertos de 7 GS7 (HPCa57, 58, 70, 83, 84, 85, e 92), um GS8 (HPCa91), e 3 GS9 (HPCa80, 87, e 96) os tumores. Estes resultados parecem sugerir que as células HS5 promover altamente eficiente regeneração do tumor em ratos NSG de células HPCA frescos.

O

reconstituído

tumores foram altamente tumorigénico e poderia ser várias passagens indefinidamente (Tabela S6; dados não mostrados). Além disso, os tumores foram regeneradas capaz de dar origem a tumores transplantáveis ​​de forma independente de células HS5 (Tabela S6). Além disso, não triados ou classificadas-CD44 (ambos CD44

+ e CD44

-) células HPCA foram capazes de re-iniciar tumores tanto por via subcutânea e na próstata dorsal (DP) e, significativamente, as células HPCA purificada a partir de xenoenxertos estabelecida inicialmente em camundongos NSG poderia regenerar tumores em NOD /SCID (Tabela S6; dados não mostrados)

reconstituídos tumores “próstata” são de origem humana e apresentar uma indiferenciado e epitelial Morfologia:. IHC, bioquímicos, e caracterizações moleculares

primeiramente foi realizada histológicos e IHC caracterizações dos tumores reconstituídos. Como esperado, o tumor exibiu paciente HPCa57 histologia típica GS7 com glândulas tumorais aglomerado, em que a maioria das células coradas positivas para luminal das células epiteliais da próstata marcadores PSA, AR nuclear, e citoqueratina 8 (CK8) (Fig. 2A). Além disso, as glândulas tumorais apresentaram coloração positiva para racemase (alfa-methylacyl-CoA-racemase, também conhecido como AMACR ou P504S; codificado pelo

gene AMACR

), negativo (ou fracamente positivo) coloração para CK5 (basal próstata marcador epitelial), e coloração negativa para p63 (um outro marcador de células basais) (Fig. 2A). Os tumores HPCa57 /HS5 reconstituídos em camundongos NSG apareceu completamente indiferenciado e faltou estruturas glandulares e expressão PSA (Fig. 2B). As células epiteliais olhou geral, tal como apoiada pela presença de alguns CK8

+ e CK5 esporádica

+ células (Fig. 2B). Curiosamente, espalhadas AR

+ e p63 pode ser observada

+ células (Fig. 2B). A coloração com anticorpos específicos humanos contra mitocôndria e Ki-67, ambos os quais não manchar tecidos de ratinho (Fig. S1), confirmou a origem humana do tumor HPCa57 regenerado (Fig. 2B). Foram observados os padrões similares de morfologia e marcador de expressão em HS5-reconstituído HPCa58 (Fig. 3) e outras 9 amostras HPCA, ou seja, HPCa70, 80, 83, 84, 85, 87, 91, 92, 96 (dados não mostrados).

(a) coloração de HE, AR, PSA, CK8, CK5, p63 e Racamase em HPCa57 amostra do paciente. (B) de tumor de xenoenxerto HPCa57P1, derivados de co-injecção com 100.000 células HS5, foi usada para fazer cortes seriados, que foram coradas para HE, Hu-Mito, Hu-Ki67, AR, PSA, CK8, CK5 e p63. De baixo (ou seja, 100x) e de alta potência (ou seja, 400x) ampliações foram mostrados. A seta indica CK5

+ células.

(A) Coloração de HE, AR, PSA, CK8, CK5, p63 e Racamase em HPCa58 amostra do paciente. (B) de tumor de xenoenxerto HPCa58P1, derivados de co-injecção com 100.000 células HS5, foi usado para fazer secções em série foram coradas para HE, Hu-Mito, Hu-Ki67, AR, PSA, CK8, CK5 e p63. De baixo (ou seja, 100x) e de alta potência (ou seja, 400x) ampliações foram mostrados. A seta indica CK5

+ células.

De acordo com os resultados IHC, análise de RT-PCR usando primers específicos-humana revelou que nenhum dos xenotransplantes HPCA /HS5 expressas

PSA

mas a maioria expressa diferentes níveis de humano

AR

mRNA (Fig. 4A). Notavelmente, cultura de fibroblastos murino (Swiss 3T3) e células HS5 foram negativos para ambos

AR

e

PSA

mRNAs (Fig. 4A). experimentos de transferência Western para marcadores de células luminais 4, racemase, PSA, AR, e CK18 confirmada falta de expressão PSA e revelou níveis variados de outros 3 marcadores em diferentes xenotransplantes (Fig. 4B-D). Note-se que as células cultivadas e HS5 HS5 tumores (ver abaixo) não expressaram CK18 (Fig. 4D, seta), embora eles expressa níveis baixos de racemase (Fig. 4B). Ocasionalmente, foram encontrados tumores HS5 para expressar baixos níveis de proteína AR (Fig. 4C), embora eles expressa apenas detectável

AR

ARNm (Fig. 4A). A maioria dos xenoenxertos HPCA /HS5 expressaram níveis mais elevados de racemase de células PC3 (Fig. 4B). Curiosamente, Western blotting para p63 revelou níveis muito elevados, em células PC3 e LNCaP, expressão prontamente detectável na HPCa57 HPCa96 e xenoenxertos, e níveis muito baixos em vários outros xenoenxertos HPCA (HPCa58, 70, e 91) (Fig. 4B). Estes resultados em geral sugerem que o

HPCA /HS5 xenotransplantes conter células epiteliais prostáticas humanas

. Como suporte adicional, Western blotting de AR e CK18 em uma série de tumores de xenoenxerto HPCa57 /HS5, a partir da geração de um ° (P1) para a geração de 4 ° (P4), derivado de SC ou implantes DP, mostraram que todos estes tumores eram positivo para a AR e CK18 (Figura 4E).

(a) Os resultados de RT-PCR de AR, PSA, e β-actina utilizando iniciadores específicos de humanos. LNCaP, trpC (cancro da próstata refractário a tratamento; 46) e DU145 células foram usadas como controlos. (B-D) de transferência de Western Racemase, PSA, p63, CK18 e AR em tumores de xenoenxerto HPCA-HS5 e as esferas derivadas de células tumorais. GAPDH e β-actina foram utilizados como controlos de carga.