Abstract

Um CpG ilha methylator fenótipo (CIMP) é exibido por um subconjunto distinto de cancro colorectal com uma elevada frequência de a hipermetilação do ADN em um grupo específico de ilhas de CpG. Estudos recentes têm demonstrado que uma mutação ativadora do

BRAF

(BRAF

V600E) está fortemente associado com CIMP, levantando a questão de saber se BRAF

V600E desempenha um papel causal no desenvolvimento de CIMP ou se CIMP proporciona um ambiente favorável para a aquisição de BRAF

V600E. Nós empregamos a tecnologia metilação Illumina GoldenGate DNA, que interroga 1.505 locais de CpG em 807 genes diferentes, para estudar ainda mais esta associação. Em primeiro lugar, examinar se a expressão de BRAF

V600E provoca hipermetilação DNA expressando estavelmente BRAF

V600E no CIMP-negativos,

BRAF

do tipo selvagem COLO 320DM linha de células de cancro colo-rectal. Determinou-se 100 locais CpG CIMP-associados e examinadas as alterações da metilação do DNA em oito clones transfectados estavelmente mais de múltiplas passagens. Descobrimos que BRAF

V600E não é suficiente para induzir CIMP no nosso sistema. Em segundo lugar, considerando a possibilidade alternativa, identificamos genes cuja hipermetilação DNA foi intimamente ligada ao BRAF

V600E e CIMP em 235 tumores colorretais primários. Curiosamente, os genes que mostraram o elo mais significativa incluem aqueles que medeiam várias vias de sinalização implicadas na tumorigênese colorretal, tais como

BMP3

e

BMP6

(sinalização BMP),

EPHA3

,

KIT

, e

FLT1

(receptores tirosina-quinase) e

SMO

(Hedgehog sinalização). Além disso, identificou-se a hipermetilação do ADN CIMP-dependente de

IGFBP7

, o que foi mostrado para mediar BRAF

senescência celular induzida por V600E e apoptose. a hipermetilação do ADN do promotor de

IGFBP7

foi associado com o silenciamento do gene. inactivação específica do CIMP de BRAF

induzida por V600E senescência e apoptose vias por

IGFBP7

hipermetilação DNA pode criar um contexto favorável para a aquisição de BRAF

V600E no CIMP + câncer colorretal. Nossos dados serão úteis para investigações futuras para a compreensão CIMP no cancro colorectal e ganhar insights sobre o papel da hipermetilação DNA aberrante na tumorigénese colorectal

Citation:. Hinoue T, Weisenberger DJ, Pan F, Campan M, Kim M , novo J, et al. (2009) Análise da associação entre CIMP e BRAF

V600E no cancro colorectal por DNA metilação Profiling. PLoS ONE 4 (12): e8357. doi: 10.1371 /journal.pone.0008357

editor: Chun Ming Wong, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 06 de setembro de 2009; Aceito: 20 de novembro de 2009; Publicação: 21 de dezembro de 2009

Direitos de autor: © 2009 Hinoue et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

financiamento:. Institutos Nacionais de Saúde (NIH) concede R01 CA118699-02 (PW Laird), R01 CA075090-09 (PW Laird). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Peter Laird é um consultor para Epigenomics AG e pela Celgene Corporation. Os outros autores não revelou qualquer interesse potencial concorrente. Este trabalho não foi apoiado por qualquer Epigenomics AG ou Celgene Corporation. Estas empresas não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Introdução

metilação do DNA aberrante em ilhas CpG tem sido amplamente observado em câncer. Promotor de hipermetilação ilha CpG associado a inativação de genes supressores de tumores selecionados parece ser crítica em tumores de criação até a manutenção do fenótipo tumoral [1]. subgrupos distintos de vários tipos de cancros humanos têm sido propostos para ter um fenótipo ilha CpG methylator (CIMP) em que uma excepcionalmente elevada frequência de hipermetilação do ADN específico do cancro encontra-se [2], [3]. Embora este conceito tem sido controversa [4], que confirmaram a existência de CIMP no câncer colorretal em um estudo de grande escala global [5].

CIMP no câncer colorretal pode surgir através de uma via distinta provenientes de certos subtipos de pólipos serrilhados [6] e é observado em aproximadamente 15% de todos os casos de câncer colorretal [5], [7]. Características associadas com CIMP no câncer colorretal incluem sexo (feminino), localização proximal, e histologia pouco diferenciado ou mucinoso [3], [5], [7], [8]. Nosso estudo usando um painel de marcadores CIMP recentemente desenvolvido em câncer colorretal demonstrou que esporádica instabilidade de microssatélites (MSI +) ocorre como consequência da CIMP-associado

MLH1

hipermetilação DNA [5]. Além disso, verificou-se uma forte associação de CIMP com a presença de uma forma mutante activado de

BRAF

(BRAF

V600E) [5]. Ambos CIMP e

BRAF

mutações foram relatadas nos primeiros estágios da neoplasia colorretal: CIMP na mucosa aparentemente normal de pacientes predispostos a múltiplos pólipos serrilhados [9] e

BRAF

mutações nos focos de criptas aberrantes [10].

A via de sinalização RAS-RAF-MEK-ERK é frequentemente hyperactivated no cancro colorectal.

KRAS

mutações ocorrem com mais frequência em 30-40% de todos os cânceres colorretais [11] e

BRAF

mutações estão presentes em uma freqüência de 5-22%, em que o BRAF constitutivamente activado

variante V600E responsável por ~ 90% de todos os

BRAF

mutações [12]. Mutações no

KRAS Comprar e

BRAF Quais são geralmente mutuamente exclusivas, implicando efeitos a jusante equivalentes em tumorigênese [13]. No entanto, estudos recentes têm indicado que as mutações desses genes podem desempenhar papéis distintos na iniciação e /ou manutenção [10] tumor, [14].

A associação extremamente apertado entre a BRAF

V600E e CIMP levanta a questão de saber se BRAF

V600E desempenha um papel causal no desenvolvimento de CIMP ou se hipermetilação do promotor CIMP associada proporciona um ambiente favorável para a aquisição de BRAF

V600E. Neste estudo, buscamos possíveis explicações moleculares para a associação entre BRAF

V600E e CIMP usando a plataforma de metilação do DNA Illumina GoldenGate, que examina o estado de metilação de DNA de 1.505 locais de CpG localizados em 807 genes. O ensaio de metilação do DNA GoldenGate tem sido amplamente utilizada em vários estudos e é agora um método padrão para a análise de metilação de ADN [15] – [24]. Resultados obtidos a partir do comercialmente disponível “GoldenGate metilação Cancer Panel I”, em particular, foram validados utilizando várias outras técnicas [15] – [17], [22], [23], tornando-se uma fonte confiável para medições de metilação do DNA em todo 1.505 loci. Nós não fomos capazes de demonstrar uma contribuição causal de BRAF

V600E para CIMP no nosso sistema de cultura celular. No entanto, foram identificados genes cuja hipermetilação DNA foi significativamente associada com BRAF

V600E em tumores colorretais primários. Inactivação destes genes específicos no contexto da CIMP pode conduzir a aquisição de BRAF

V600E no CIMP + tumores colorretais.

Resultados

Caracterização de 21 linhas celulares de cancro colorrectal humano

em primeiro lugar, procurou determinar se a expressão de BRAF

V600E induziria hipermetilação DNA em locais CpG associados com CIMP em um

in vitro

sistema de cultura celular. Como as células epiteliais do cólon primários não foram prontamente disponíveis, nós selecionados para linhas celulares de cancro colorectal que não têm a metilação do DNA substancial em loci CIMP definidoras e carregam formas de tipo selvagem de ambos

BRAF

e

KRAS

. Tais linhas celulares serviria como sistemas adequados para a introdução de BRAF

V600E. Foram selecionados 21 linhas celulares de cancro colorrectal, caracterizada seus perfis de metilação do DNA, e determinou a sua

BRAF

e

KRAS

estado de mutação (Figura 1). Utilizou-se MethyLight para avaliar o estado de metilação do DNA de cinco marcadores CIMP definidoras identificadas anteriormente no nosso laboratório [5]. Usando um PMR (percentagem de referência metilado) de ≥10 como um limite para a metilação positivo, foram identificadas seis linhas de células que não tinham a metilação do DNA para todos os marcadores específicos cinco CIMP-(Figura 1). Para testar nossa hipótese, inicialmente escolheu o

BRAF Comprar e

KRAS

do tipo selvagem Caco-2 e COLO 320DM linhas celulares para a sua facilidade de cultivo e transfecção. No entanto, o estudo descrito abaixo está limitada a células COLO 320DM, uma vez que não foram capazes de isolar quaisquer transfectadas estavelmente Caco-2 clones que apresentaram nível detectável de BRAF

expressão V600E (dados não mostrados).

MethyLight foi utilizada para avaliar o estado de metilação do DNA de cinco marcadores CIMP definidoras. Um PMR de ≥10 foi utilizado como um limite para a metilação positivo. caixas pretas indicam PMR ≥10 e caixas brancas indicam PMR 10. As frequências de metilação do DNA dos cinco marcadores CIMP aumentar a partir de cima para baixo. estado de instabilidade de microssatélites para cada linha de células é listado como estável microssatélite (MSS) ou instabilidade abrigando (MSI). O estado de mutação do

BRAF

exão 15 e

KRAS

exão 2 estão listados.

transfecção estável de BRAF

V600E em células COLO 320DM

Nós transfectadas células COLO 320DM com uma marcada com HA BRAF

V600E de cDNA e clones isolados resistentes a G418. O nível de BRAF

V600E expressão foi determinado por western blotting utilizando um anticorpo contra o epitopo de HA (Figura 2A). A actividade de BRAF

V600E foi confirmada por análise de activação de ERK1 /2, utilizando um anticorpo contra fosforilada ERK1 /2 (Figura 2A). Oito clones estavelmente transfectadas que apresentam elevada expressão de BRAF

V600E, bem como uma forte activação de ERK1 /2, foram cultivados individualmente em cultura, e o ADN genómico foi isolado em várias passagens (entre 2 e 27) a partir destes clones. Quatro clones transfectados com vector vazio (EVCs) foram cultivadas nas mesmas condições e utilizados como controlos.

(A) Expressão de BRAF

V600E e ERK1 /2 em células COLO fosforilação 320DM transfectadas de forma estável. As manchas foram sondadas com anticorpos anti-HA para HA-BRAF

V600E, anti-fosfo-ERK1 /2, e anti-ERK1. Os asteriscos indicam os oito BRAF

V600E transfectadas clones que foram submetidos a análise de metilação do DNA em várias passagens celulares. perfis (B) de metilação do DNA de células COLO 320DM, não transfectadas com vector vazio e BRAF

V600E clones transfectados 320DM COLO, como determinado pelo ensaio de metilação Ilumina GoldenGate ADN. Os dados de metilação de ADN foram pontuadas como valores p como definido anteriormente [16]. Cada linha corresponde a um locus CpG individual e os dados foram ordenados por β-valor médio em todas as amostras. Cada clone é ordenada da esquerda para a direita no aumento do número de passagens. EVC: empty-vector clones transfectados

DNA análise de metilação do gene BRAF

V600E Transfectados COLO 320DM Clones

A seguir, determinou o estado de metilação do DNA de 1.505 locais de CpG localizados em. 807 genes diferentes em cada um dos oito BRAF

clones V600E e quatro EVCs usando a plataforma Illumina GoldenGate Cancer Panel metilação 1 (Figura 2B). Descobrimos que os beta-valores de metilação do DNA em todos os 1.505 locais de CpG nos clones BRAF

V600E transfectadas (independentemente da sua

nível de expressão V600E BRAF) foram muito semelhantes aos dos clones de controle vazia por vetores e relativamente estável ao longo do Tempo. Isto sugere que não houve aumento global da hipermetilação do DNA em BRAF

V600E transfectadas clones na alvos CpG analisados ​​(Figura 2B).

A seguir, determinar se a expressão estável de BRAF

V600E especificamente aumentou a metilação de ADN de apenas marcadores CIMP-associados nos locais CpG 1,505 interrogados. Estes locais foram determinados por triagem 58 amostras de tumor colorectal primário usando a plataforma de metilação do DNA Illumina GoldenGate (Dataset S1). O estado de mutação do

BRAF

e

KRAS

nestas amostras tinha sido determinado anteriormente [5] (Tabela S1). análise de agrupamento bidimensional sem supervisão dos valores beta de metilação do DNA revelou um conjunto distinto de 11 amostras de tumores, a maioria das quais continha BRAF

V600E e mostrou metilação do DNA freqüente de marcadores CIMP-associados conhecidos, incluindo

CDKN2A, IGF2

, e

MLH1

(dados não mostrados). Nós definidos neste subgrupo como tumores CIMP-positivos (Figura 3). Em seguida, identificou um total de 100 locais CpG que têm níveis significativamente mais elevados de metilação do DNA em tumores CIMP-positivo (CIMP +) versus CIMP-negativo (CIMP-) (

P Art 0,001 após correção para comparações múltiplas, consulte a secção Materiais e Métodos) (Tabela S2). Deve notar-se que as reacções de três dos marcadores CIMP baseados em MethyLight (

CACNA1G

,

NEUROG1

, e

SOCS1

) anteriormente identificado no nosso laboratório não são incluídas na a plataforma Illumina GoldenGate Cancer Panel metilação 1. O

RUNX3

reações Illumina GoldenGate não demonstrou comportamento específico de CIMP. Uma possível explicação para esta discrepância pode ser que essas reações são projetados em torno do local de início da transcrição da

RUNX3

isoforma 1, enquanto o nosso específico do CIMP

RUNX3

reacção MethyLight é projetado na CpG ilha promotor do RUNX3

isoforma 2 [5]. Não vimos qualquer diferença aparente na metilação do DNA entre BRAF

V600E transfectadas clones e EVCs nesses locais CpG CIMP-associados (Figura 3). Curiosamente, observou-se que a metilação do ADN-β significativo valor dos loci 100 CIMP-específica aumentada em função da passagem de células (Figura 4A e 4B). No entanto, este aumento não se correlacionam com os níveis de BRAF

expressão V600E e também foi observado em células transfectadas com o vector de controlo (Figura 4B). Este aumento geral da média β-valor é específico para loci CIMP-associado, uma vez que a média β-valor a partir de diversos conjuntos de 100 locais CpG seleccionados aleatoriamente não mostram uma tendência semelhante (Figura 4C e 4D). Portanto, concluiu-se que, embora CIMP-associado ilhas CpG pode ser propenso a adquirir a metilação do DNA em certas condições de cultura, BRAF V600E

não especificamente induzem CIMP em células COLO 320DM.

CIMP + tumores e o CIMP loci -associated em 58 amostras de tumores primários foram definidos como descrito na secção Materiais e Métodos. Cada linha corresponde a um locus individual de painel do locus de 100, e os dados foram classificados pela média β-valor de cada locus sobre todas as amostras de tumores primários 58. Cada BRAF

V600E clone transfectado e EVC é ordenada da esquerda para a direita no aumento do número de passagens. Tumores com

BRAF

e

KRAS

mutações são indicadas por um círculo e um triângulo, respectivamente. X: estado de mutação não está disponível. Cada BRAF

V600E clone transfectado e EVC é ordenada da esquerda para a direita no aumento do número de passagens. “P” indica os perfis de metilação do DNA de células COLO 320DM untransfected pai.

As linhas pretas indicam BRAF

V600E expressar clones e linhas cinzentas representam empty-vector transfectadas clones de controle. Cada ponto representa graficamente significa valores de ß em todos os locais CpG indicados do ensaio de metilação Illumina GoldenGate DNA em várias passagens para cada clone. (A) Todos os 1.505 CpG loci do ensaio Illumina GoldenGate. (B) Apenas 100 loci CIMP-associados estão perfiladas. (C) Cento escolhidos aleatoriamente loci CpG. (D) Cento CIMP não loci, que mostram significar valores de beta semelhantes ao loci 100 CIMP-associado.

identificação de genes que são significativamente metilatados Colorectal Tumores Harboring BRAF

V600E

Nós também considerou a hipótese alternativa de que metilação do promotor de genes alvos específicos proporciona um ambiente favorável para a aquisição de

BRAF

mutação no CIMP + cânceres colorretais. Nós previamente identificado o status CIMP e

BRAF

estado de mutação de 235 amostras de tumores colorretais primários [5]. Encontramos BRAF

V600E em 33 tumores (14,0%); 31 deles foram classificados como CIMP + e apenas 2, conforme CIMP-. Foi realizado o ensaio de metilação Illumina GoldenGate DNA nestas amostras, e identificaram 60 genes, representadas por 89 locais de CpG, que são significativamente metilados (

P Art 0,001) nos 33 BRAF

tumores V600E-positivos (Tabela S3). Estes genes são candidatos a CIMP específica inativação, o que pode estreitamente sinergia com a V600E BRAF

promover tumorigênese.

Para validar os dados gerados usando a plataforma de metilação do DNA GoldenGate, analisamos o estado de metilação do DNA de quatro genes específicos do CIMP (

CALCA

,

EPHA3

,

KIT

, e

SLC5A8

) em um subconjunto de quatro CIMP-positivos e 16 CIMP tumores -negative na plataforma metilação Illumina Infinium DNA. Estes quatro genes foram selecionados por ambas as plataformas analíticas interrogar o estado de metilação do DNA do dinucleótido CpG idênticos. Em seguida, examinou a concordância de metilação do DNA em cada um desses loci entre as duas plataformas, e encontraram um coeficiente de correlação alta em todos os casos (

CALCA

: 0,94,

EPHA3

: 0,95,

KIT

: 0,95,

SLC5A8

:. 0,86), dando mais apoio à nossa tela de metilação do DNA inicial baseada em GoldenGate

Foram confirmadas as associações recentemente observados entre hipermetilação DNA de

BMP3

e

MCC

com CIMP + e BRAF

V600E no cancro colorectal [25], [26]. Encontramos também CIMP específica hipermetilação DNA de

BMP6.

A inativação epigenética simultânea de

BMP3

e

BMP6

foi mostrado para ser associado com a ativação da RAS-RAF via de sinalização -MEK-ERK no cancro do pulmão de não-pequenas células [27]. Além disso, encontramos uma associação de

SLC5A8

e

TIMP3

metilação do DNA com BRAF

V600E em nossas amostras de tumores colorretais, como havia sido relatado em carcinomas papilares [28]. A conseqüência funcional da hipermetilação DNA desses genes supressores de tumores relacionados com o CIMP + e BRAF

V600E permanece especulativa [25] – [28].

Além disso, descobrimos que a metilação do DNA de

SMO

, um componente de sinalização de Hedgehog (Hh), foi fortemente ligado aos tumores colorretais com BRAF

V600E (Tabela S3). Curiosamente, tem sido relatado recentemente que a expressão aumentada de

SMO

contribui para a tumorigénese colorrectal [29]. No entanto, Arimura et al. também mostrou que as linhas celulares de cancro colorrectal abrigando BRAF

V600E, incluindo COLO 205, HT-29 e RKO, não parecem mostrar a expressão de

SMO

[29]. Nossos dados indicam que a hipermetilação DNA promotor CIMP específicas do pode estar envolvido na repressão da

SMO

em tumores colorretais transportando BRAF

V600E (Tabela S3).

Promotor DNA hipermetilação e silenciamento transcricional de

IGFBP7

em

BRAF

Mutant CIMP + colorectal Cancer

Identificamos o BRAF

IGFBP7

CpG ilha promotor como um alvo para a metilação do DNA em tumores colorretais abrigando

V600E (

P

value = 3.1 × 10

-9, Odds ratio = 12). BRAF

V600E foi mostrado para induzir a senescência celular [30] – [32]. induzida pelo oncogene senescência (OIS) tem sido reconhecido como um importante mecanismo supressor de tumores [33]. O mecanismo molecular subjacente de BRAF

senescência e apoptose induzida por V600E foi elucidado em um estudo recente [34]. Tem sido demonstrado que a expressão de

IGFBP7

é necessário e suficiente para induzir a senescência e a apoptose mediada por BRAF

V600E. Curiosamente,

IGFBP7

foi mostrado para ser epigenetically silenciado por CpG promotor ilha hipermetilação especificamente em amostras de melanoma primário transportando BRAF

V600E, indicando que a perda de

IGFBP7

expressão é fundamental para o desenvolvimento de BRAF

melanoma V600E-positivos [34].

o Painel Cancer Illumina GoldenGate metilação 1 plataforma contém dois

sondas IGFBP7

(IGFBP7_P297_F e IGFBP7_P371_F) que interrogar o estado de metilação do DNA de dois distintos dinucleótidos CpG no

IGFBP7

promotor CpG ilha (Figura 5A). Descobrimos que estes dois locais CpG no

promotor IGFBP7 Quais são câncer especificamente metilado (Figura 5B) e fortemente associada tanto BRAF

V600E (Wilcoxon teste rank-sum,

P

value = 2.0 × 10

-10) e CIMP (

P

valor = 3,6 × 10

-9) (Figura 5C). Tem sido relatado que os tumores colo-rectais com

KRAS

mutações também mostram a hipermetilação do ADN em marcadores CIMP-associados, ainda que a uma frequência baixa, e tem elevados níveis de metilação do DNA de genes que se submetem a hipermetilação do ADN associada à idade. Estes tumores têm sido descritos como CIMP-baixo ou CIMP2 [35], [36]. Nós não encontrou uma associação entre

IGFBP7

hipermetilação do DNA e

KRAS

mutações quando excluídos os tumores com mutante

BRAF

(

P

value = 0,85) . De acordo com estas observações, descobrimos que a hipermetilação DNA de

IGFBP7

é principalmente presente em linhas celulares de cancro colorrectal que abrigam BRAF

V600E e mostram metilação do DNA frequente do painel de marcadores específicos de CIMP a cinco gene anteriormente descrito (Figura 6). Análise em tempo real RT-PCR de linhas celulares de cancro colorrectal mostrou que

IGFBP7

expressão de mRNA foi inversamente relacionada com hipermetilação DNA, como linhas celulares com

IGFBP7

hipermetilação mostrou pouca ou nenhuma

IGFBP7

expressão de gene (Figura 6). Entre as células CIMP- nós examinados, apenas COLO 320DM mostrou hipermetilação DNA do

IGFBP7

promotor ilha CpG com nível mínimo de expressão. Em retrospectiva, essa característica única de células COLO 320DM em comparação com as outras linhas celulares CIMP- poderia ter habilitado estas células de tolerar mutante

BRAF

superexpressão, e pode explicar as dificuldades na obtenção de BRAF

V600E expressar clones em outra linha celular de cancro colorectal, tais como células Caco-2.

(a) mapa genómico de

IGFBP7

ilha CpG associados-promotor, local de início da transcrição (TSS) e o exão 1 com base no genoma UCSC navegador (2006 assembléia de março). A localização dos locais de CpG interrogados pelo ensaio de metilação de ADN Ilumina GoldenGate é indicado pelas setas verticais. níveis (B) de metilação do DNA dos dois dinucelotides CpG no

IGFBP7

CpG ilha promotor. P-valores de cada local de CpG em 10 tumores (cinco tumores CIMP- com o tipo selvagem

BRAF Comprar e cinco CIMP + tumores com mutante

BRAF

, barras pretas) e adjacentes tecidos não tumorais ( barras cinzentas) são listados. (C)

IGFBP7 Terrenos caixa de promotor de metilação do DNA de 235 tumores colorretais humanos estratificados por

BRAF

estado de mutação (esquerda) e CIMP + status (direita) no

IGFBP7

P371 lócus. Nos diagramas de caixa, as extremidades da caixa são os quartis 25 e 75. A linha de dentro da caixa identifica o β-valor mediano. Os traços acima e abaixo da caixa de estender ao máximo de 1,5 vezes a IQR. O estado CIMP de cada amostra de tumor colorretal é determinado conforme descrito na secção Materiais e Métodos.

análise em tempo real RT-PCR quantitativa de

expressão IGFBP7

.

IGFBP7

níveis de expressão são apresentados em relação à expressão

PCNA

. As barras de erro indicam o desvio padrão de medições em triplicado técnicas. O número de loci metilado entre os cinco CIMP marcadores e mutação estatuto de

BRAF

e

KRAS

listados na Figura 1 são fornecidos.

Discussão

CIMP no cancro colorectal proporciona uma oportunidade única para estudar os mecanismos moleculares que levam a mudanças epigenéticas no cancro e as contribuições destas mudanças no desenvolvimento da doença [3], [37]. As características distintas encontradas em CIMP são pistas importantes para a compreensão deste fenótipo [3], [5], [7], [8]. Particularmente notável é a associação extremamente apertado entre a CIMP e BRAF

V600E [5]. Mecanismos que ligam epigenética (CIMP) e genética de juros (

BRAF

mutação) eventos e a sequência temporal em que estes dois eventos ocorrem atraíram [37].

Neste estudo, usando o de alto rendimento Illumina GoldenGate plataforma de metilação do DNA, foi investigada a relação entre CIMP e BRAF

V600E no cancro colorectal. Em primeiro lugar, testou se expressão de BRAF

V600E provoca hipermetilação DNA expressando estavelmente BRAF

V600E no CIMP-negativos,

BRAF

do tipo selvagem COLO 320DM linha de células de cancro colo-rectal. Examinamos as mudanças de metilação de DNA em 100 locais CpG CIMP-associados, e descobriu que BRAF

V600E não é suficiente para induzir a hipermetilação DNA nesses locais. Uma ressalva do nosso sistema é que BRAF

V600E poderia desempenhar um papel na indução de metilação do DNA unicamente no início tumorigênese colorretal, como

BRAF

mutações têm sido descritas na fase mais precoce do desenvolvimento do tumor [10], [ ,,,0],38], [39]. É possível que um único conjunto de alterações genéticas e /ou epigenéticas que ocorreram nas células COLO 320DM poderia ter criado um ambiente desfavorável para BRAF

V600E para induzir hipermetilação DNA. Experiências semelhantes aos descritos acima, utilizando células Caco-2, que também mostram CIMP- e carregam

BRAF

tipo -wild, não foram bem sucedidas. Nós não fomos capazes de obter quaisquer clones estavelmente transfectadas que apresentaram níveis detectáveis ​​de BRAF

V600E (dados não mostrados). Sustentada BRAF

expressão V600E pode ser incompatível com a proliferação de células Caco-2 devido à senescência celular ou apoptose induzida por BRAF

V600E. Vale ressaltar que a nossa análise RT-PCR mostrou a expressão robusta de

IGFBP7

, um mediador de BRAF

senescência ou apoptose, no induzida por V600E Caco 2 células em contraste com as células COLO 320DM.

Anteriormente, descrevemos metilação CIMP-associado da

MLH1

como a base subjacente para a deficiência de reparo incompatível (MSI +) em câncer colorretal esporádico [5]. Minoo

et al.

Relatou

MLH1

metilação do DNA por transfecção estável de BRAF

V600E para a linha celular NCM460 [40]. No nosso sistema, nós não detectar um tal aumento em

MLH1

metilação do DNA (dados não mostrados). Além disso, dos 33 BRAF

tumores primários V600E examinamos apenas 42% (14/33) mostrou

MLH1

hipermetilação DNA. Portanto, BRAF

V600E pode afetar hipermetilação DNA de

MLH1

mas apenas em determinadas circunstâncias. Curiosamente, na via serrilhada proposto para tumores CIMP +,

BRAF

mutações e CIMP + foram observadas nas lesões precursoras iniciais, ao passo que não tem MSI + [6], [10], [41]. Assim, a inactivação de

MLH1

pode ocorrer em um estágio posterior de desenvolvimento do tumor. Minoo e seus colegas observaram a hipermetilação DNA de

CDKN2A Comprar e 15 outros marcadores CIMP-associados (

IGFBP7

não foi examinada) em células-mãe NCM460, o que limitou a sua capacidade de aprofundar o estudo do papel da BRAF

V600E induzir CIMP em seu sistema experimental [40].

Curiosamente, observamos que o nível global de metilação do DNA do loci específicos do CIMP em nossas células transfectadas de forma estável aumenta em função da passagem celular. É interessante notar que uma droga selecção em células cultivadas foi descrita para resultar em alterações na estrutura da cromatina mundial [42], e um processo semelhante pode ser associada com as nossas observações aqui.

Além disso, encontramos variação relativamente grande inter-clonal (entre clones diferentes) nos níveis de metilação do DNA em nossas experiências de transfecção (Figuras 2B e 3), com uma média de R

2 correlação calculado com base em quatro EVCs de 0,88 ± 0,01 (± SD). Nossa intra-clonal (dentro de clones em diferentes passagens) R média

2 de correlação é de 0,97 ± 0,01 e R

2 correlação entre repetições técnicas na análise de metilação Illumina GoldenGate DNA é 0,98 ± 0,02 [16]. Consequentemente, encontramos algumas grandes diferenças na metilação do DNA em vários loci mesmo entre clones de controle (Figuras 2B e 3). Isso enfatiza a importância do uso de vários clones para este tipo de estudos.

Como alternativa, a forte associação entre CIMP e BRAF

V600E pode surgir se CIMP prevê especificamente um contexto celular favorável para BRAF

V600E para promover a tumorigênese. No segundo conjunto de experiências, determinamos genes cuja hipermetilação DNA foi fortemente ligado ao BRAF

V600E e CIMP + no cancro colorectal. Curiosamente, foi observada CIMP-dependente hipermetilação do ADN e inactivação transcricional de

IGFBP7

, o que foi mostrado para mediar BRAF

senescência celular induzida por V600E e apoptose [34]. BRAF

V600E foi mostrado para induzir a senescência celular em células humanas de cultura e primários [30], [31], bem como modelo de rato [32]. induzida pelo oncogene senescência (OIS) tem sido reconhecido como um importante mecanismo supressor de tumores [33]. Para que BRAF

V600E para promover seus efeitos oncogênicos, eventos cooperativos adicionais são necessárias para contornar a senescência [33]. Recentemente, a base molecular do BRAF

senescência induzida por V600E e a apoptose foi estudada em detalhe. Wajapeyee et ai. identificada

IGFBP7

como um mediador da BRAF

senescência induzida por V600E em fibroblastos primários humanos utilizando uma tela shRNA de todo o genoma. Suas descobertas posteriores sugerem que

IGFBP7

expressão é necessário e suficiente para induzir a senescência e apoptose em melanócitos primários humanos e melanoma, respectivamente. Além disso, eles observaram perda de

IGFBP7

em BRAF

amostras de melanoma V600E-positivos primários e concluiu que o silenciamento de

IGFBP7

expressão é um passo crítico no desenvolvimento de um melanoma abrigar BRAF

V600E [34].

associada a hipermetilação do promotor de ADN ilha CpG de

IGFBP7

foi avaliado em linhas celulares de cancro colorrectal humano bem. O inibidor da metilação do DNA 5-aza-2′-desoxicitidina foi mostrado para restaurar a

expressão IGFBP7

em linhas celulares de cancro colorrectal, indicando que a hipermetilação do ADN desempenha um papel importante no silenciamento deste gene no cancro colo-rectal [43 ]. No entanto, sua associação com a

BRAF

mutação e CIMP + estado cancro colorectal humanos ainda não foi explorada. Neste estudo, verificou-se que

IGFBP7

hipermetilação DNA é e firmemente associado com tumores colorretais transportando BRAF

V600E e exibindo CIMP específicos do tumor. Além disso, verificou-se que

IGFBP7

hipermetilação do ADN está associada à perda de expressão em CIMP + linhas celulares de cancro colorrectal. inactivação específica do CIMP de BRAF

senescência e via de apoptose por

IGFBP7

hipermetilação DNA pode criar um contexto favorável para a aquisição de BRAF

V600E no CIMP + câncer colorretal.

importante,

IGFBP7

hipermetilação DNA não foi observado em todos os

BRAF

tumores colorretais mutantes. Lin

et al

. examinaram a sequência de DNA do promotor e das regiões de ex�icas

IGFBP7

em dez linhas celulares de cancro colorrectal.