Sumário

Fundo

do receptor do factor de crescimento dos ceratinócitos (KGFR) é uma variante de splicing do gene FGFR2 expressa em células epiteliais. A activação de KGFR é um factor-chave na regulação de processos fisiológicos em células epiteliais, tais como a proliferação, a diferenciação e a cicatrização de feridas. Alterações de sinalização KGFR têm sido associados a patogênese de diferentes tumores epiteliais. Tem sido também a hipótese de que o seu ligando específico, KGF, pode contribuir para o desenvolvimento de resistência ao 5-fluorouracilo (5-FU) em cancros epiteliais e tamoxifeno em cancros da mama positivos ao estrogênio.

Metodologia /Apreciação Principais

sirna foi transfectado para uma linha celular de queratinócitos humanos (HaCaT), uma linha celular derivada de cancro da mama (MCF-7) e de uma cultura primária de queratinócitos (KCs) para induzir a regulação negativa selectiva da expressão de KGFR. Foi observada uma redução forte e altamente específico de expressão KGFR tanto RNA (redução = 75,7%,

P

= 0,009) e nível de proteína. KGFR silenciados células mostraram uma capacidade de resposta reduzida ao tratamento com KGF, avaliada pela medição taxa de proliferação (14,2% versus 39,0% das células de controlo,

P

0,001) e a migração celular (24,6% versus 96,4% do controlo células,

P

= 0,009). Em células pseudo-transfectadas células MCF-7, KGF neutraliza a capacidade de 5-FU para inibir a proliferação celular, enquanto que em KGFR células silenciados KGF fracamente interfere com efeito antiproliferativo 5-FU (11,2% versus 28,4% das células de controlo,

P

= 0,002). A capacidade de 5-FU para induzir a morte celular é revogada através do co-tratamento com KGF, enquanto que em células KGFR silenciados 5-FU eficientemente induz a morte celular ainda combinado com o KGF, como determinado por avaliação da viabilidade celular. Da mesma forma, a capacidade de tamoxifeno para inibir a MCF-7 e proliferação KCs é altamente reduzida por tratamento com KGF e é completamente restaurado em KGFR silenciados células (12,3% versus 45,5% das células de controlo,

P

0,001) .

conclusões /Significado

Estas descobertas sugerem que a inibição seletiva da via KGF /KGFR pode fornecer uma ferramenta útil para melhorar a eficácia das estratégias terapêuticas para certos tumores epiteliais.

Citation: Rotolo S, Ceccarelli S, Romano F, Frati L, silenciamento de crescimento de queratinócitos Receptor do factor Restaura 5-fluorouracil e Tamoxifen Eficácia em células de câncer Responsive Marchese C, Angeloni A (2008). PLoS ONE 3 (6): e2528. doi: 10.1371 /journal.pone.0002528

Autor: Stefan Maas, da Universidade Lehigh, Estados Unidos da América

Recebido: 14 de maio de 2008; Aceito: 27 de maio de 2008; Publicação: 25 de junho de 2008

Direitos de autor: © 2008 Rotolo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado por doações do MIUR, Cofin 2005 e de concessão Regione Lazio emitido para Progetto di Ricerca Finalizzata 2005. os financiadores não estavam directa ou indirectamente envolvidos na concepção ou realização do estudo em qualquer parte.

interesses concorrentes os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

receptor do factor de crescimento de queratinócitos (KGFR /FGFR2-IIIb) é uma proteína tirosina quinase que pertence à família do fator de crescimento de fibroblastos. receptores (FGFR). KGFR representa uma variante de transcrito de splicing do gene FGFR2 e é expressa em células epiteliais de diferentes órgãos. A isoforma de splicing alternativo, conhecido como FGFR2-IIIc, é encontrada em células de linhagens mesenquimais [1], [2]. KGFR desempenha um papel fundamental no controlo do crescimento epitelial e diferenciação, realizando os seus efeitos biológicos de uma forma parácrina [3] por meio de ligação de afinidade elevada para os seus ligandos específicos, isto é, factor de crescimento de queratinócitos (KGF /FGF7), FGF10 e FGF22 [4 ]. Entre eles, o KGF, não só actua como um agente mitogénico potente para queratinócitos humanos primários, mas também a promoção do seu programa de diferenciação [5] e protegendo-os contra a indução de apoptose [6], [7]. Além disso, KGF está envolvido em ambos experimental [8], [9] e

in vivo

[10] ferida modelos de cura, estimulando a migração de queratinócitos [11], [12] e induzindo reorganização do citoesqueleto de actina, portanto, aumentando a motilidade celular epitelial [13].

recentemente, tem havido um interesse crescente sobre o papel potencial das alterações de KGF /KGFR sinalização na tumorigênese epitelial. O aumento da expressão de ARNm de KGFR foi detectada numa grande variedade de tumores de origem epitelial, tais como pulmão, do cólon, gástrico, do pâncreas e próstata. Em alguns casos, como um aumento da expressão parece estar associada com a transformação celular e, talvez, a progressão maligna [14]. Além disso, a administração de KGF tenha sido demonstrado que o aumento da motilidade celular no receptor de estrogénio (ER), células de tumor da mama -positivas [15], [16], a ser potencialmente envolvidos na progressão e metástase [17] do cancro da mama e para aumentar o potencial invasivo de carcinoma gástrico linhas celulares derivadas que sobre-expressam KGFR [18].

Outros estudos conduziram a hipótese de que o KGF pode exercer actividade anti-apoptótico em determinadas células cancerosas, bem como a inibição da apoptose induzida pelo fármaco quimioterapêutico 5-fluorouracilo (5-FU ) [19] – [22]. O desenvolvimento de células cancerosas de resistência aos agentes quimioterápicos tradicionais, tais como 5-FU, é frequentemente observada e continua a ser um grande obstáculo para o sucesso do tratamento de câncer e uma causa importante de recorrência do tumor após a quimioterapia [23].

Além disso, tem sido sugerido que as alterações das vias que envolvem receptores cognatos FGF e pode representar um dos mecanismos de resistência ao tamoxifeno que finalmente se desenvolve em muitos cancros da mama ER-positivo [24] – [27]. No entanto, esta hipótese não está completamente apurado e o papel específico desempenhado pelo grande família do FGF está longe de ser compreendido.

A abordagem baseada em downregulation seletiva de proteínas envolvidas em processos celulares correlacionados com a progressão do tumor representa um fronteira promissora para o tratamento do câncer. A transfecção de pequenos RNAs específicos interferentes (siRNAs) é uma ferramenta poderosa para conseguir um knockdown específicos do gene e representa uma estratégia terapêutica potente para o tratamento de várias doenças, tais como infecções virais, distúrbios neurológicos e cancros [28].

A especificidade alvo exclusivo de siRNA contra mRNAs doença relevante é um pré-requisito essencial para a utilização desta tecnologia. Neste estudo, foram regulados negativamente selectivamente ARNm KGFR e a expressão da proteína em três linhas de células epiteliais, queratinócitos HaCaT, MCF-7 de células de cancro da mama e queratinócitos primários em cultura (KCS), por uma nova abordagem de desenho de siARN, com base na utilização de endonuclease de DICER substrato dsRNAs 27-mer para provocar interferência de RNA (RNAi). Esta técnica fornece eficácia e uma maior duração de ARNi melhorada, em comparação com os siRNAs tradicionais 21-mer, permitindo o uso de concentrações mais baixas de ARNi em células alvo, o que reduz grandemente os efeitos colaterais. Além disso, permite o direcionamento de sites que são refratários à supressão com siRNAs 21-mer [29].

Foram analisados ​​os efeitos da KGFR siRNA nas características bio-parâmetros, tais como a viabilidade celular, proliferação, apoptose e migração das linhas celulares testadas. Finalmente, avaliou-se a regulação negativa da expressão KGFR é capaz de inibir a 5-FU e resistência ao tamoxifeno induzido por KGF em culturas de células.

Resultados

A inibição da expressão de ARNm de KGFR por ARNsi

Não existem regras claras sobre a escolha do local de destino siRNA para seqüências de mRNA específicos. No entanto, dentro de uma sequência de ARNm único moléculas siRNA diferentes mostram uma variabilidade dramáticas em termos de eficácia e especificidade do silenciamento do gene. Aqui usamos programas laboratorial e baseado na web, de acordo com os critérios descritos anteriormente (https://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html), para selecionar três sequências siRNAs dirigidos contra o gene FGFR2. Sabe-se que os mesmos códigos de genes para dois transcritos alternativos, designados como KGFR /FGFR2-IIIb e IIIc-FGFR2, que diferem por um trecho de divergência de 49 aminoácidos no seu domínio extracelular e exibem diferentes características de ligação ao ligando. Assim, para realizar um knockdown específico da transcrição KGFR, que seleccionado siRNAs sequências-alvo no interior do exão 8 do gene FGFR2, que é longitudinalmente apenas na isoforma KGFR (Fig. 1A). Todas as sequências de siRNAs foram inseridos em uma pesquisa BLAST para garantir que não havia homologia significativa com outros genes. Como relativo a expressão relativa das duas isoformas FGFR2 em nossos modelos experimentais, as células HaCaT têm sido anteriormente mostrado para expressar a variante de FGFR2-IIIc de FGFR2 em duas ordens de grandeza menor quantidade do que a variante de splicing FGFR2-IIIb [30]; em células MCF-7, anteriormente demonstrado que expressam ambas as isoformas de [31], que demonstraram que a expressão FGFR2-Illb é muito mais elevada do que a de FGFR2-IIIc (11 vezes de aumento) (Fig. 1B). A capacidade de cada ARNsi concebido e de um conjunto reunido de três duplexes especificamente para reduzir os níveis de ARNm de KGFR, sem afectar a expressão da isoforma de FGFR2-IIIc, foi ensaiada em células MCF-7 e células HaCaT. As transfecções transientes foram usadas para entregar cada siRNA e as células incubadas com o vector sozinho lipossomal (transfeco simulada) foram usados ​​como controle. A concentração óptima para ARNsi transfecção foi experimentalmente determinada como sendo de 5 nM (dados não mostrados), de acordo com as recentes observações de que indicaram mecanismos tóxicos, efeitos fora do alvo e a estimulação da resposta imune induzida por doses elevadas de síntese de RNAi

in vitro Comprar e

in vivo

[32]. A capacidade dos diferentes ARNsi para reduzir a quantidade de ARNm de KGFR foi estimada por Q-RT-PCR. Em células MCF-7 que também avaliada a especificidade dos siRNAs personalizados. níveis KGFR e FGFR2-IIIc de ARNm foram normalizados para os níveis de ARNm de p-actina. 48 h após a transfecção, as células MCF-7 transfectadas com o conjunto reunido de siRNA-1, -2 e -3 expressa uma quantidade reduzida estatisticamente significativo de mRNA KGFR em comparação com as células pseudo-transfectadas (0,243 vezes, redução = 75,7%,

P

= 0,009) (Fig. 2A). Um efeito menos evidente foi obtida por transfecção com os duplexes individuais: siRNA-1 (0,613 vezes, a redução = 38,7%,

P

= 0,168), siRNA-2 (0,405 vezes, a redução = 59,5%,

P

= 0,068) e 3-siARN (0,406 vezes, redução = 59,4%,

P

= 0,061) (Fig. 2A). Por outro lado, nem os siRNAs individuais, nem o siRNA-piscina mostrou qualquer efeito inibidor sobre os níveis de FGFR2 IIIc-mRNA (siARN-1: 0,902 vezes, redução = 9,8%,

P

= 0,71; siRNA-3: 0.914 vezes, redução = 8,6%,

P

= 0,36; si-RNA-3: 0,943 vezes, a redução = 5,7%,

P

= 0,52; siRNA-pool: 1.028 vezes, diferença = 2,8% ,

P

= 0,85) (Fig. 2B).

(a) desenho esquemático representando o splicing alternativo de FGFR2-IIIc e KGFR /FGFR2-III-B. A inserção (*) apresenta a sequência de ADNc (nucleótidos de 1590 a 1698) que corresponde a todo o exão 8, com as sequências visadas pelos três siRNAs (caixas cinzentas). (B) Os níveis de expressão e KGFR FGFR2-IIIc ARNm foram determinados por Q-RT-PCR, e normalizado para p-actina níveis de mRNA. ARNm KGFR em células MCF-7 foi determinada como se dobra em relação ao ARNm de FGFR2-IIIc. O gráfico mostra a variação interquartil de três experimentos independentes (caixas), média (barras pontilhadas horizontal) e 95% Intervalo de Confiança (IC) (bigodes).

t

Student dois lados foi utilizado para comparar KGFR contra expressão FGFR2-IIIc: *

P Art 0,001. Os relatórios de tabela de acompanhamento significa nível de expressão, erro padrão (SE) e IC 95% para cada amostra analisada.

(A, B) células MCF-7 foram falsamente transfectadas ou transfectadas com 5 nM siRNA -1, -2, -3, ou com um conjunto reunidas deles, e o ARN total foi extraído de 48 h após a transfecção. Os níveis de KGFR (A) e a expressão de ARNm FGFR2-IIIc (B) foram determinados por Q-RT-PCR, e normalizados para níveis de ARNm de p-actina. KGFR (A) ou FGFR2-IIIc (B) mRNA em células transfectadas com ARNsi foram determinados como se dobra em relação ao que expressa em células transfectadas por simulação. Para cada tratamento, os gráficos mostram a variação interquartil de três experimentos independentes (caixas), média (barras pontilhadas horizontal) e 95% Intervalo de Confiança (IC) (bigodes).

t

Student dois lados foi utilizado para comparar siKGFR-transf contra células transfectadas por simulação: *

P

= 0,009. As tabelas anexas relatam um tempo médio nível de expressão, erro padrão (SE) e IC 95% para cada amostra analisada.

Portanto, todos os experimentos subsequentes foram realizadas por transfecção do siRNA-piscina, que corresponde os critérios normalmente adoptados eficiência de siARN ( 70% de redução no ARNm alvo). Além disso, desde que o conjunto apresenta uma elevada especificidade para a isoforma KGFR, que será referida como siKGFR no resto do manuscrito.

Curso de tempo de KGFR mediada por siRNA silenciamento

Para avaliar a duração e eficácia de KGFR silenciamento, realizamos ensaios de curso de tempo em células HaCaT transfectadas com siKGFR, determinando a quantidade de ARNm de KGFR por Q-RT-PCR em 6, 24, 48, 72 e 96 h após a transfecção (fig. 3A). Uma redução da expressão de ARNm de KGFR observada foi de 24 h após a transfecção, em comparação com células transfectadas por simulação (1,127 contra 2,730 vezes, diferença = 58,7%,

P

0,001), enquanto que a eficácia completa foi alcançada em 48 e 72 h (1.127 contra 4.779 vezes, diferença = 76,4%,

P Art 0,001 e 1,079 contra 4,463 vezes, diferença = 75,8%,

P Art 0,001, respectivamente) a partir de transfecção . 96 h após transfecção, uma forte diminuição na expressão de KGFR observada foi também no controlo. No entanto, em células transfectadas, downregulation de expressão KGFR ainda era significativa (1.215 contra 1.963 vezes, diferença = 38,1%,

P

= 0,017). Sobre as bases dos resultados do curso de tempo e de acordo com relatórios anteriores que mostram que o pico da expressão da proteína KGFR é atingida em 72 horas após inanição [30], resolvemos realizar todos os experimentos posteriores a 72 h após siKGFR transfecção.

células HaCaT (a) foram falsamente transfectadas ou transfectadas com 5 nM siKGFR, e o ARN total foi extraído das células transfectadas 6, 24, 48, 72 e 96 h mais tarde. Os níveis de expressão de ARNm de KGFR foram determinados por Q-RT-PCR, e normalizados para níveis de ARNm de p-actina. A quantidade de ARNm de KGFR em cada ponto de tempo foi expressa como vezes de nível de ARNm de KGFR em relação ao ponto de tempo de 6 h. Para cada ponto de tempo, o gráfico mostra a variação interquartil de três experimentos independentes (caixas), média (barras pontilhadas horizontais) e IC 95% (bigodes). Os relatórios de tabela de acompanhamento significa nível de expressão, erro padrão (EP) e IC 95% para cada amostra analisada. Student dois lados

t

teste foi utilizado para comparar siKGFR-transf contra células transfectadas por simulação: *

P Art 0,001 (24 h); **

P Art 0,001 (48 h); †

P Art 0,001 (72 h); ‡

P

= 0,017 (96 h). células (B) HaCaT foram falsamente transfectadas ou transfectadas com 5 nM siKGFR. 24 h após a transfecção, as células foram tratadas com 20 ng /ml de KGF, durante 48 h. Os níveis de expressão de ARNm de KGFR foram determinados por Q-RT-PCR, e normalizados para níveis de ARNm de p-actina. A quantidade de ARNm de KGFR foi expressa como vezes de níveis de ARNm de KGFR em relação às células transfectadas por simulação não tratadas. Gráfico e relatório da tabela os mesmos conjuntos de dados como em (A), para cada amostra testada.

P

valores foram determinados utilizando

t

teste de Student de duas faces: *

P

= 0,003 contra células transfectadas por simulação não tratadas; **

P = 0,018

contra células pseudo-transfectadas tratadas com KGF. células (C) HaCaT foram transfectadas e tratadas como em (B), e os níveis de expressão da proteína KGFR foram determinados por análise de Western blot utilizando um anticorpo policlonal anti-Bek. O mesmo blot foi sondado para tubulina como controle de carga igual. A quantidade de proteína KGFR foi avaliada por análise densitométrica; os valores a partir de uma experiência representativa foram normalizados para níveis de tubulina, expressa como vezes de proteína KGFR em relação às células transfectadas por simulação não tratadas e classificado como um gráfico.

regulação negativa do ARNm de KGFR e expressão de proteína por siARN em KGF-tratados células HaCaT

sabe-se que o tratamento das células epiteliais com o KGF induz vários eventos, tais como a proliferação e diferenciação celulares através da ligação a KGFR e internalização do receptor acoplado a redução do nível de expressão de ARNm de KGFR . Assim, examinou-se o efeito de siKGFR transfecção em culturas de células na presença de 20 ng /ml de KGF. Os níveis de ARNm e expressão de proteína foram testados por análise de transferência de Western Q-RT-PCR e. Uma diminuição acentuada de ARNm KGFR foi observado em células transfectadas com siKGFR em comparação com células transfectadas por simulação (0,232 vezes, redução = 76,8%,

P

= 0,003) (Fig. 3B). Na presença de KGF, observou-se uma modula�o negativa da expressão de KGFR também em células transfectadas por simulação. No entanto, a inibição de ARNm KGFR por siARN era ainda evidente (0,265 contra 0,598 vezes, redução = 55,7%,

P

= 0,018) (Fig. 3B). No mesmo conjunto de experiências, os níveis de expressão da proteína KGFR também foram testadas por Western blot. Como mostrado na Fig. expressão 3C, KGFR foi significativamente diminuída em células siKGFR-transfectados em comparação com células transfectadas por simulação. A análise densitométrica confirmou que siKGFR reduzida expressão de proteínas, tanto nas células não tratadas e de KGF-tratados, por mais de 50% em relação às células transfectadas por simulação (0,47 vezes contra uma dobra, redução = 53% e 0,20 contra 0,73 vezes, a redução = 72,6 %, respectivamente) (Gráfico a Fig. 3C).

regulação negativa mediada por siARN da KGFR inibe a proliferação celular e migração celular induzida por KGF

Para avaliar os efeitos biológicos de KGFR silenciamento, examinámos o siKGFR capacidade para afectar a proliferação induzida por KGF através da realização de um ensaio de proliferação sobre a linha de células HaCaT. células plaqueadas foram transfectadas com siKGFR e cultivadas durante 48 horas em meio padrão suplementados ou não com 20 ng /ml KGF. A proliferação celular foi determinada por células positivas para o antigénio Ki67, que identifica células em ciclo de contagem, e relatado em gráfico como percentagem de células positivas (Fig. 4a). Como esperado, nas células transfectadas por simulação observou-se um aumento da proliferação de células HaCaT, após tratamento com KGF, em comparação com células não tratadas (39% versus 13,6%, 2,9 vezes de aumento,

P

0,001). A infra-regulação da expressão KGFR através de siRNA específico aboliu quase completamente efeito KGF em HaCaT proliferação das células, com uma taxa de proliferação a nível de fundo (14,2% versus 39%, 2,7 diferença vezes,

P Art 0,001) (Gráfico Fig . 4A).

ensaio de proliferação

(A). células HaCaT, cultivadas em lamelas, foram falsamente transfectadas ou transfectadas com 5 nM siKGFR. 24 h após a transfecção, as células foram tratadas com 20 ng /ml de KGF, durante 48 h. Em seguida, as células foram fixadas e sujeitas a análise de imunofluorescência com um anticorpo policlonal dirigido contra Ki67 (vermelho). As imagens são representativos de três experiências independentes. Barra de escala, 10