Abstract

Fundo

IQ-domínio de activação de GTPase proteína 1 (IQGAP1) liga-se a Dishevelled (Dvl) e funciona como um modulador da localização nuclear Dvl em embriões de Xenopus. No entanto, a relação entre IQGAP1 e Dvl em tecidos tumorais não é clara.

Materiais e Métodos

Nós usamos imuno-histoquímica para avaliar as expressões de IQGAP1 e Dvl em uma coorte de 111 pulmão de não pequenas células cancerosas (NSCLC) pacientes. Associação de suas expressões de localização com fatores clínico-patológicos também foi analisada.

Resultados

A taxa positiva de IQGAP1 em tumores primários foi de 48,6% (54/111) para a sua expressão cytoplamic, 9,0% (10 /111) para a expressão nuclear e 31,5% (35/111) para a expressão membranoso; a taxa positiva de Dvl foi de 65,8% (73/111) para a expressão cytoplamic, 9,9% (11/111) para a expressão nuclear e 10,8% (12/111) para a expressão membranoso. A co-expressão de taxa IQGAP1 e Dvl foi de 77,8% (42/54) no citoplasma, 80,0% (10/08) no núcleo e 8,6% (3/35) na membrana. A co-expressão de IQGAP1 e Dvl no citoplasma e núcleo foram correlacionados significativamente (P 0,05), mas não na membrana (P 0,05). As taxas de expressão positiva de ciclina D1 e c-myc foram significativamente maiores no grupo de IQGAP1 e Dvl co-expressão no núcleo do que no citoplasma. taxa de co-expressão de IQGAP1 e Dvl no citoplasma e núcleo foi significativamente maior nos linfáticos metástases ganglionares (63,3%, 19/30) do que nos tumores primários (38,3%, 31/81), correlacionando-se com mau prognóstico. Cinco anos de tempo de sobrevida após a ressecção no grupo com sua co-expressão no citoplasma e núcleo foi significativamente menor do que sem co-expressão (44,705 ± 3.355 vs 58.403 ± 2,543 meses, p 0,05).

Conclusões

a co-expressão de IQGAP1 e Dvl no citoplasma e núcleo foi correlacionada com a metástase linfa nodal e mau prognóstico de NSCLC, e a co-expressão no núcleo pode desempenhar um papel crítico na activação da via Wnt canónica.

citação: Zhao H, Xie C, Lin X, Zhao Y, Han Y, Fan C, et al. (2014) co-expressão de IQ-domínio GTPase-activating protein 1 (IQGAP1) e Dishevelled (Dvl) está correlacionada com mau prognóstico em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 9 (12): e113713. doi: 10.1371 /journal.pone.0113713

Autor: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center em Dallas, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de julho de 2014; Aceito: 27 de outubro de 2014; Publicação: 01 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zhao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:.. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

proteínas da família Introdução

IQGAP são encontrados em numerosos organismos, incluindo levedura, peixe, e mamíferos. Existem três isoformas de IQGAP em humanos: IQGAP1, IQGAP2 e IQGAP3. IQGAP1 é a melhor caracterizados e o membro mais amplamente estudados da família IQGAP. É uma proteína de andaimes que se liga à actina filamentosa e funções de ligação transversal e estabilizar os filamentos de actina via o seu domínio calponina homologia (CH) na extremidade N-terminal [1]. Relatos anteriores mostraram que IQGAP1 motilidade celular influenciada no bordo de ataque de células migratórias, ao aumentar os níveis de Rac1 activo e Cdc42 [2]. IQGAP1 mostra níveis elevados em uma variedade de tipos de câncer, incluindo câncer de pâncreas [3]. A expressão e localização subcelular da IQGAP1 no adenocarcinoma pulmonar foi associada com a diferenciação histológica, e pode ser utilizado para prever a sobrevivência em pacientes [4]. Pesquisas recentes sugerem que IQGAP1 é um fator de risco para metástases em linfonodos de pulmão carcinomas de células escamosas [5].

Dvl foi identificado como um regulador chave da sinalização Wnt (incluindo caminhos canônicos e não canônicos), que é um componente-chave do processo fisiológico envolvido no desenvolvimento e progressão do tumor embrionário [6], [7]. Muitos relatórios têm demonstrado o papel de Dvl em tumores. superexpressão DVL é significativamente correlacionada com pobre diferenciação e metástases em linfonodos em NSCLC [8]. DVL-1 e DVL-3 afetam a invasão de células NSCLC principalmente através de vias Wnt canônicos e não canônicos, respectivamente [9]. Wnt5a promove a migração de células do cancro da mama através de DVL-2 [10].

IQGAP1 funciona como um modulador da localização nuclear Dvl na sinalização Wnt [11]. No entanto, a correlação entre IQGAP1 e Dvl em tumores não é clara. No presente estudo, foi realizada uma análise imunohistoquímica para identificar as expressões e locais de IQGAP1 e Dvl em NSCLC. Além disso, analisamos sua associação com os parâmetros clínico.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os tecidos humanos foram obtidos de acordo com protocolos de pesquisa sujeito humano aprovados pela China Medical Universidade Board Review. Os tecidos tumorais foram obtidas com consentimento informado por escrito de pacientes adultos com NSCLC.

As amostras de tecido e dados do paciente

Foram coletadas 111 amostras de pacientes com NSCLC submetidos a ressecção completa no Primeiro Hospital Afiliado da China Medical Universidade de janeiro a dezembro de 2008. Nenhum dos pacientes havia recebido radioterapia ou quimioterapia antes da ressecção cirúrgica. informações de acompanhamento foi obtido a partir de revisão de prontuário dos pacientes. O sistema pTNM encenação da União Internacional Contra o Câncer (7ª edição) foi utilizado em nosso estudo. Este estudo foi realizado com a aprovação do conselho de revisão institucional local na China Medical University. As principais variáveis ​​clínicas e patológicas de todos os pacientes são as seguintes: 46 casos de carcinoma de células escamosas, 65 casos de adenocarcinoma; 38 casos de diferenciação bem, 73 casos de moderada a fraca diferenciação; 67 casos em estágio I, 20 casos em estágio II, 24 casos foram estádio III; 70 casos de pacientes do sexo masculino, 41 casos de pacientes do sexo feminino; a média de idade é de 57 anos de idade.

Imunohistoquímica

espécimes de tumor extirpado cirurgicamente foram fixadas com formalina a 10% neutra, embebidos em parafina e 4 mm de espessura foram preparados. coloração imuno-histoquímica foi realizada utilizando o método do complexo avidina-biotina peroxidase (UltrasensitiveTM, MaiXin, Fuzhou, China). Os cortes foram desparafinados em xileno, re-hidratadas com álcool graduado e depois fervido em tampão de citrato 0,01 M (pH 6,0) durante 2 min com uma autoclave. O peróxido de hidrogénio (0,3%) foi aplicado para bloquear a actividade de peróxido endógeno e as secções foram incubadas com soro de cabra normal para reduzir a ligação não específica. As secções de tecido foram então incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. Os anticorpos primários (anti-rato humanos) são como se segue: anticorpo monoclonal IQGAP1 (1:40, SC-376021, Santa Cruz Biotechnology, EUA), anticorpo monoclonal de Dvl (1:25, SC-166303, Santa Cruz), ciclina D1 monoclonal anticorpo (1:100, SC-20044, Santa Cruz), anticorpo monoclonal de c-myc (1:500, cat.ab32, Abcam). IgG de soro anti-rato de cabra biotinilado foi usado como um anticorpo secundário. Como um controlo de isotipo, IgG de ratinho (Maixin Biotecnologia, Fuzhou, Fujian, China, com a mesma concentração do anticorpo primário) foi usada em vez do anticorpo primário (Figura S1). Após a lavagem, as secções foram incubadas com estreptavidina-biotina conjugado com peroxidase de rábano silvestre, e a reacção da peroxidase foi desenvolvido com tetracloridrato de 3,3′-diaminobenzidina. Contracoloração foi realizada com hematoxilina, e as seções foram então desidratadas com etanol antes de ser montado.

Avaliação da coloração

A intensidade da coloração e a percentagem de células marcadas em áreas representativas de cada lâmina foram avaliados de forma independente e marcado por dois investigadores, que estavam cegos aos dados clínicos sobre pacientes. Cinco pontos de vista foram examinados por lâmina, e 100 células foram observadas per view em 400 × ampliação. Para IQGAP1 ou Dvl, os resultados imuno-histoquímicos mostraram que a coloração positiva localizada na membrana núcleo, citoplasma, e (ou). Os tumores foram definidos como a expressão citoplasmática, quando 20% ou mais das células tumorais apresentaram coloração citoplasmática; Os tumores foram definidos como expressão nuclear quando 20% ou mais das células tumorais mostraram uma coloração nuclear, se coloração citoplasmática ou não; Os tumores foram definidos como expressão membranosa quando 20% ou mais das células tumorais apresentaram coloração membranosa, se coloração citoplasmática ou não. As regiões com expressão positiva foram amarela ou marrom-amarelo, e as regiões com expressão negativa não eram coloração. Para ciclina D1 ou c-myc, os resultados de imuno-histoquímica mostrou que coloração positiva localizada no núcleo ou núcleo /citoplasma.

A análise estatística

SPSS versão 16.0 para Windows foi utilizado para todas as análises. O teste do qui-quadrado foi usado para examinar várias correlações possíveis. análise de sobrevivência de Kaplan-Meier foi utilizado para estimar a probabilidade de sobrevivência dos pacientes, e as diferenças de sobrevivência entre os subgrupos de pacientes. O modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox foi utilizado para estimar o possível significado prognóstico das variáveis ​​clínico-patológicas. Todos os valores de P foram baseados na análise estatística dos dois lados, e P 0,05 foi considerado estatisticamente significativa na diferença

Resultados de

1.. A co-expressão de IQGAP1 e Dvl principalmente no citoplasma e núcleo

A taxa de expressão positiva de IQGAP1 foi de 89,2% (99/111), e 48,6% (54/111) para a sua expressão cytoplamic, 9,0% (10 /111) para expressão nuclear e 31,5% (35/111) para expressão membranosa. A taxa de expressão positiva de Dvl foi de 86,5% (96/111), e 65,8% (73/111) para expressão cytoplamic, 9,9% (11/111) para expressão nuclear e 10,8% (12/111) para expressão membranosa (Tabela S1).

taxa de co-expressão de IQGAP1 e Dvl foi de 77,8% (42/54) no citoplasma (Tabela 1, Figura 1), 80,0% (10/08) no núcleo (Tabela 1, Figura 2A -D). A co-expressão no citoplasma foi significativamente correlacionado (Tabela 1, P = 0,009, P = 0,246), também no núcleo (Tabela 1, P = 0,000, P = 0,738); taxa de co-expressão de IQGAP1 e Dvl na membrana foi de apenas 8,6% (3/35), e co-expressão na membrana não foi correlacionada (Tabela 1, P 0,05, Figura S2)

A-B:. adenocarcinoma ; C-D: carcinoma de células escamosas. ampliação original, de 400 ×; barra de escala, 20 ^ m.

co-expressão de IQGAP1 (A) e Dvl (C) no núcleo de adenocarcinoma de pulmão. A co-expressão de IQGAP1 (B) e Dvl (D) no núcleo do carcinoma de células escamosas do pulmão. A expressão positiva de ciclina D1 (E) e de c-myc (L) no adenocarcinoma de pulmão. A expressão positiva da ciclina D1 (F) e c-myc (H) em carcinoma de células escamosas do pulmão. ampliação original, de 400 ×; barra de escala, 20 ^ m.

A expressão de ciclina D1 e c-myc foi significativamente positivo no grupo de IQGAP1 e Dvl co-expressão no núcleo (Figura 2E-H), ea sua as taxas de expressão positivos foram 100% (08/08) e 87.5% (08/07), respectivamente. No grupo de IQGAP1 e Dvl co-expressão no citoplasma, as taxas de expressão positiva de ciclina D1 e c-myc foram 52,4% (22/42) e 35.7% (15/42), respectivamente. As taxas de expressão positiva de ciclina D1 e c-myc no grupo de co-expressão nuclear foram significativamente maiores do que a co-expressão citoplasmática (P 0,05)

2.. A co-expressão de IQGAP1 e Dvl no citoplasma ou no núcleo foi correlacionada com metástases linfáticas de NSCLC

Como se mostra na Tabela 2, a taxa de co-expressão de IQGAP1 e Dvl no citoplasma e no núcleo era de 63,3% (19/30) no grupo com metástases nodais linfáticas (N1-3), e 38.3% (31/81) no grupo com tumores primários (N0). metástases ganglionares apresentaram maior taxa de co-expressão de IQGAP1 e Dvl no citoplasma e núcleo de tumores primários (P 0,05). Nenhuma taxa diferente estatisticamente significativa foi demonstrada entre o grupo de T1 e T2-4 (status tumor) (P 0,05, Tabela S2), também entre o grupo de adenocarcinoma eo carcinoma espinocelular (tipos histológicos) (P 0,05, Tabela S3 ).

3. Co-expressão de IQGAP1 e Dvl no citoplasma ou núcleo foi correlacionada com mau prognóstico de NSCLC

Kaplan-Meier análise de sobrevivência mostrou um tempo de sobrevivência significativamente menor nos pacientes com co-expressão de IQGAP1 e Dvl no citoplasma e núcleo do que aqueles com sem co-expressão. Cinco anos tempo de sobrevivência após ressecção no grupo com a sua co-expressão no citoplasma e núcleo era significativamente menor do que sem a co-expressão (44,705 ± 3.355 vs 58.403 ± 2,543 meses, p 0,05, Figura 3A), e o grupo de co-expressão nuclear foi significativamente menor do que a co-expressão citoplasmática (36.000 ± 6.329 3.758 ± 46.528 vs meses, P 0,05, Figura 3B).

(a) A. o grupo com IQGAP1 e Dvl noncoexpression no citoplasma e núcleo ( 61 casos); A respectiva grupo com IQGAP1 e Dvl co-expressão no citoplasma e núcleo (50 casos) (B) A. O grupo com IQGAP1 e Dvl noncoexpression no citoplasma e núcleo (61 casos); bO grupo com IQGAP1 e Dvl co-expressão no citoplasma (42 casos); grupo C. A com IQGAP1 e co-expressão Dvl no núcleo (8 casos).

Para esclarecer se co-expressão de IQGAP1 e Dvl no citoplasma e núcleo foi independentemente associada com o prognóstico de pacientes com NSCLC, foi utilizado o modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox. O resultado mostrou que co-expressões citoplasmática e nuclear foram fatores de risco independentes para o prognóstico de pacientes com NSCLC (P 0,05; Tabela 3).

Discussão

Como uma importante efetor de Rho GTPases, IQGAP1 é uma proteína andaime e desempenha a função fundamental no movimento celular através da modulação do citoesqueleto de actina através Rac1 e Cdc42 [12] – [14]. Dvl é um mediador essencial da via de sinalização Wnt canónica, e a sua localização nuclear é necessária para a sinalização de Wnt canónica [15], [16]. Em embriões de Xenopus, IQGAP1 interagiu com Dvl e regulada a sua localização nuclear para moderar a expressão de genes alvo Wnt durante a embriogénese precoce [11]. No entanto, a relação entre IQGAP1 e Dvl em tumores não foi relatado.

O presente estudo investigou a expressão IQGAP1 e Dvl de NSCLC (adenocarcinoma e carcinoma de células escamosas). Descobrimos que IQGAP1 e Dvl foram localizados principalmente no citoplasma. A co-expressão de taxa IQGAP1 e Dvl no citoplasma ou no núcleo era significativamente mais elevada do que na membrana; co-expressão de IQGAP1 e Dvl no citoplasma e núcleo foram correlacionados significativamente (P 0,05), mas não na membrana (P 0,05). A co-expressão de IQGAP1 e Dvl no citoplasma e núcleo foi associado a metástases em linfonodos e pior prognóstico no CPNPC. A sobrevivência no grupo de co-expressão nuclear foi significativamente pior do que a co-expressão citoplasmática. A co-expressão de IQGAP1 membranoso e Dvl não foram correlacionados (P 0,05). Estes resultados sugeriram que interagiram com IQGAP1 Dvl no citoplasma e núcleo de NSCLC, e o papel no citoplasma pode ser um dos passos críticos na modulação da localização nuclear de Dvl, mas não na membrana. Estes resultados são consistentes com estudo anterior [11].

A localização nuclear de Dvl é necessário para sinalização de Wnt canônica [15]. Dvl coopera com c-Jun para regular a transcrição de gene estimulado pela via canonical sinalização Wnt no núcleo [16]. Neste estudo, verificou-se que os genes alvo de sinalização Wnt canónica, ciclina D1 e c-myc, as taxas positivas de ambos, num grupo com IQGAP1 e Dvl co-expressão do núcleo foram muito mais elevados do que no citoplasma. Análise de sobrevivência também mostrou que os doentes com co-expressão de IQGAP1 e Dvl no núcleo tinha um tempo de sobrevivência significativamente mais baixos do que os pacientes com que no citoplasma (P 0,05). Estes resultados sugerem que a co-expressão nuclear de IQGAP1 Dvl e está associada com a activação da via Wnt canónica.

Com base nos resultados acima podemos concluir que a co-expressão de IQGAP1 e Dvl no citoplasma e núcleo está correlacionada com linfonodo metástases e mau prognóstico em NSCLC. IQGAP1 modula localização nuclear Dvl no citoplasma, mas não na membrana. A co-expressão de IQGAP1 e Dvl no núcleo está associado com a expressão de ciclina D1 e c-myc, que sugerem que a co-expressão nuclear de IQGAP1 Dvl e está associada com a activação da via Wnt canónica. Assim, a inibição da ligação do IQGAP1 e Dvl no citoplasma e prevenção de translocação nuclear Dvl, pode ser uma das estratégias para a prevenção e tratamento de câncer de pulmão.

Informações de Apoio

Figura S1.

A validação do anticorpo (IQGAP1, A e D; Dvl, B e E) para imuno-histoquímica. A-C: adenocarcinoma; D-F: carcinoma de células escamosas; C e F: IgG de rato foi usada em vez do anticorpo primário. ampliação original, de 400 ×; . Barra de escala, 20 um

doi: 10.1371 /journal.pone.0113713.s001

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Figura S2. A co-expressão de

IQGAP1 (A, C) e Dvl (B, D) na membrana do NSCLC. A-B: adenocarcinoma; C-D: carcinoma de células escamosas. ampliação original, de 400 ×; . Barra de escala, 20 um

doi: 10.1371 /journal.pone.0113713.s002

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Tabela S1.

IQGAP1 e expressão Dvl em NSCLC

doi:. 10.1371 /journal.pone.0113713.s003

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Tabela S2.

IQGAP1 e Dvl co-expressão no estado de tumor diferente

doi:. 10.1371 /journal.pone.0113713.s004

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Tabela S3.

IQGAP1 e Dvl co-expressão em diferentes tipos histológicos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0113713.s005

(DOC)

Reconhecimentos

Os autores agradecem Dr. Weinan Li, pela excelente assistência técnica.