Sumário

SLD5 é um membro do complexo Gin composto de psf1, PSF2, PSF3 e SLD5, desempenhando um papel crucial na formação do garfo de replicação de ADN com CDC45 na levedura. Anteriormente, tinha isolado uma orthologue psf1 de uma biblioteca de DNA de células tronco hematopoiéticas murino e foram capazes de identificar ortólogos de todos os outros membros gins pela levedura dois abordagem híbrida usando psf1 como isca. Estes Gin ortólogos pode também funcionar na replicação de ADN em células de mamífero porque formam complexos tetraméricos como observado em levedura, e os mutantes de deleção do gene de ambos psf1 e SLD5 resultado em uma falta de proliferação epiblast e letalidade embrionária precoce. No entanto, verificou-se que psf1 também está envolvida na segregação cromossómica na fase M, consistente com sugestões recentes de que os homólogos de genes associados com a replicação do ADN em organismos inferiores também regulam outras do que a replicação de ADN em células de mamífero eventos celulares. Aqui analisamos a função de SLD5 diferente de replicação do DNA e descobriu que ele está ativo em danos e reparação do ADN. Atenuação de SLD5 expressão resulta em danos no ADN marcado em ambas as células normais e células cancerosas, sugerindo que protege contra danos no ADN. Atenuação de SLD5 atrasa a resposta de reparação do ADN e a restauração do ciclo celular em células normais, mas não em células cancerosas. Estes achados sugerem que SLD5 pode representar uma molécula alvo terapêutico actuando ao nível das células estromais de tumor e não as próprias células cancerosas, porque o desenvolvimento do microambiente do tumor pode ser atrasado ou interrompido pela supressão da sua expressão nos tipos de células normais no interior da tumor

Citation:. Gong ZY, Kidoya H, Mohri T, Han Y, Takakura N (2014) Dano ao DNA reforçada pela atenuação da SLD5 Atrasos Restauração do ciclo celular em células normais, mas não em células cancerosas. PLoS ONE 9 (10): e110483. doi: 10.1371 /journal.pone.0110483

editor: Ryuichi Morishita, Osaka University Graduate School of Medicine, Japão

Recebido: 12 Agosto, 2014; Aceito: 15 de setembro de 2014; Publicação: 21 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Gong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia e Grants-in-Aid para a Investigação Científica (KAKENHI) japonês do Japão Sociedade para a Promoção da Ciência. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Nobuyuki Takakura é agora um editor académico desta revista. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas e critérios editoriais.

Introdução

As células são constantemente expostos a danos no DNA genômico causados ​​por agentes internos e externos, como estresse oxidativo e UV, respectivamente. Erros na reparação de danos do ADN pode resultar no desenvolvimento de células do cancro [1], [2]. Para evitar a transformação oncogénica, células normais monitorar e reparar danos no DNA de seu genoma, definindo pontos de verificação do ciclo celular [3]. No entanto, as células cancerígenas são capazes de tolerar a danos no ADN de tal modo que a replicação continua sem reparação, resultando na acumulação de expressão do gene mutante anormal [4]. Este evento tem sido sugerida como uma das causas de desenvolvimento quimio- e radio-resistência em células cancerosas malignas.

SLD5 é um membro do complexo Gin composto de psf1, PSF2, e PSF3. Este complexo regula a forquilha de replicação de DNA em brotamento levedura [5]. Na iniciação da replicação do ADN, o complexo de reconhecimento de origem (ORC) liga-se à sequência de replicação autónoma (ARS), que funciona como um domínio de início de replicação do ADN. Posteriormente, ciclo de divisão celular (CDC) 6 e CDC1 ligam a ARS guiado por ORC e ​​induzir a ligação de manutenção mini-cromossoma (MCM) proteínas sobre ARS. Estes são denominados complexos de pré-replicação (pré-RC) [6] – [8]. Além disso, Cdc45 e gins são recrutados para pré-RC e formam helicase activado CMG (Cdc45-MCM-gins) na bifurcação de replicação de DNA [9] – [12].

Nós identificamos um orthologue rato de psf1 em uma biblioteca de ADN derivada a partir de células-tronco hematopoiéticas durante a embriogénese em que esta população de células prolifera activamente [13]. Subsequentemente, foram identificados utilizando uma levedura SLD5 sistema de dois híbridos com psf1 como a isca [14]. Além disso, identificou-se todos os membros da gens em ratinhos e confirmou que eles formam complexos como observado em levedura [15]. Nós relatado anteriormente que ratos mutantes deficientes para psf1 ou SLD5 mostram letalidade embrionária precoce causada pela paragem do crescimento de epiblasts no dia embrionário 6,5 [13], [16]. Estas descobertas sugerem que psf1 e SLD5 são funcionais em mamíferos e essencial para a proliferação celular, possivelmente, a associação com a replicação do ADN, como observado em levedura.

alta expressão de genes Gin tem sido observada em cancros e uma correlação do seu nível de expressão com malignidade tem sido sugerido [17] – [19]. Nós também relataram que as células cancerosas que mostram a atividade do promotor maior psf1 estão iniciando o cancro /células em um modelo de transplante de células de tumor murino [20]-tronco. Uma característica das células cancerosas malignas é quimio e radio-resistência. expressão de nível elevado de genes Gin pode induzir não só o crescimento celular, mas também a resistência à quimioterapia. No entanto, não foi determinado se a função dos genes Gin está envolvido na reparação de danos do ADN ou. Ao observar celularidade da medula óssea em ratos mutantes, que anteriormente descobriu que haploinsuficiência de psf1, mas não SLD5, reduz o crescimento celular [13], [16]. Portanto, é complicado para analisar a função de psf1 em danos de DNA por derrubar expressão psf1 porque o crescimento celular em si também é afetado por falta deste fator. Em caso de SLD5, heterozigotos SLD5

+/- ratos, que foram saudável e fértil, nasceram na freqüência mendeliana e exibiu crescimento normal. Além disso, não há grande diferença da celularidade da medula óssea entre selvagem e SLD5

+/- ratos [16]. Portanto, nós utilizamos SLD5

+/- fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) para analisar DNA reparação de danos e crescimento celular após dano ao DNA. Além disso, comparamos a função de SLD5 no DNA reparação de danos usando siRNA experimentos knock-down em células cancerosas.

Materiais e Métodos

cultura de células e tratamento da toxicodependência

MEFs, células B16 (células de melanoma de ratinho), e células colon26 (células de cancro do cólon do rato) foram cultivadas em meio modificado por Dulbecco de Eagle (DMEM) (Sigma) com 10% de soro fetal bovino (FBS, Sigma), e penicilina /estreptomicina (Sigma) a 37 ° C sob uma atmosfera de 5% de CO

2. MEFs foram preparados a partir do tipo selvagem (WT) ou SLD5

+/- ratinhos no dia embrionário (E) 15,5 de acordo com o método usual [16]. células B16 e células colon26 foram adquiridos a partir do banco de células Riken (Tsukuba, Japão). As células foram tratadas com 1? M ou 10? M etopósido (Sigma). Para induzir a danos no DNA fortemente, usamos 10 mM etoposídeo. No entanto, 10 uM etoposido severamente induzida apoptose celular. Portanto, nós utilizamos 1 PM etoposide para observar a restauração do ciclo celular. Os animais foram alojados em quartos controlados ambientalmente da instalação de Experimentação Animal da Universidade de Osaka. Todos os experimentos foram realizados sob as leis e diretrizes aplicáveis ​​para o cuidado e uso de animais de laboratório no Instituto de Pesquisa de Doenças microbianas, Universidade de Osaka, aprovado pela Comissão em Experimentação Animal do Instituto de Pesquisa para a doença microbiana, Universidade de Osaka (número de autorização 3239- 6). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

siRNA transfecção

expressão SLD5 em células B16 e Colon26 foi transitoriamente derrubado com pequena interferência RNA (siRNA) . RNAiMAX Lipofectamina (Invitrogen) foi utilizado para a transfecção de plasmídeo e siRNA em células, seguindo os protocolos dos fabricantes, e as experiências foram realizadas 48 horas após a transfecção. Foram utilizados dois oligonucleótidos siRNA diferentes específicas para SLD5; As sequências alvo de ARNip foram: 5′-GGA CCA CAC GGA CCA GAC CUU UAA A-3 ‘(# 1); 5’-GAU GAG CAG AGA GAC UAC GUG AUU G-3 ‘(# 2).

teste de exclusão de azul de Trypan para a viabilidade celular e rebrota após o tratamento com etoposido

5 × 10

3 células foram semeadas em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços (BD Falcon) em 500 ul de meio. Após 24 h, os poços foram expostas a 1 uM etoposido durante 12 h. Depois da droga ter sido removido, as células foram colhidas imediatamente (0 h). A viabilidade celular foi avaliada por exclusão de azul de tripano. O mesmo número de células vivas foi ressuspenso em meio fresco, e as células foram cultivadas durante 24, 48 ou 72 h. Eles foram, em seguida, isolada por adição de 100 ul de Tripsina-EDTA a cada poço; As células foram então lavadas e re-suspensas em 400 ul de meio. 20 ul de células ressuspensas foram misturadas com 20 ul de solução a 0,4% de corante azul de tripano (Life Technologies) durante 1 min. As células foram contadas utilizando imediatamente uma microcâmara de Neubauer com um microscópio de luz. Todas as contagens foram efectuadas utilizando técnicas quatro duplicados de cada amostra. As médias e os desvios padrão foram calculados para cada subcultura.

Western blotting

As células foram recolhidas e submetidas a lise em tampão de amostra de SDS (50 mM Tris-HCL, pH 6,8, 2% de sulfato de dodecilo de sódio, 6 % 2-mercaptoetanol, 10% de glicerol, 0,003% de azul de bromofenol), contendo um cocktail de inibidores de protease. As proteínas foram separadas em 10% ou 15% SDS-PAGE e transferidas para membranas de PVDF. Após bloqueamento durante 1 h em TBST (Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 1,37 M, KCl 27 mM, 0,05% de Tween 20) contendo 2% de leite seco não gordo, as membranas foram incubadas com anti-SLD5 (1:1000; Iwaki) , anti-γ-H2AX anticorpo, ou de murganho anti-actina-β em tampão de bloqueio durante a noite (1:500; Cell Signaling), anti-Rad51 (Santa Cruz H-92;; 1:1000). As membranas foram então lavadas com TBST e incubaram-se com anticorpos conjugados com HRP anti-rato, coelho ou cabra (1:10000) durante 1 h. Os anticorpos ligados foram detectados com kits de ECL (Amersham). As proteínas imunorreactivas foram visualizadas usando o sistema ECL Prime Ocidental Detecção Blotting (GE Healthcare, Buckinghamshire). As manchas foram digitalizados usando o densitômetro imagem Las-300 mini (Fujifilm, Tóquio, Japão).

Análise Estatística

Os resultados são expressos como a média ± SD.

t

teste de Student foi utilizado para análise estatística. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando

p

. 0,05

Resultados

danos no DNA reforçada pela Atenuação de expressão SLD5 em MEFs

Para avaliar se SLD5 refere-se ao DNA danos resposta, comparamos a diferença entre danos ao DNA utilizando MEFs de ratinhos WT e SLD5

+/- ratos [16]. Confirmou-se que o nível de SLD5 em SLD5

+/- MEFs era aproximadamente metade do que em MEFs WT (Figura 1A e B). Para investigar danos no ADN, que MEFs desafiados com etoposido, um inibidor de topoisomerase Π que induz quebras de ADN de cadeia dupla [21], [22]. As células foram tratadas com 0,01% de DMSO como controlo ou com 10 etoposido uM durante 1 h. No estado estacionário (exposição a DMSO), o nível de fosforilação da histona H2AX ligada a cromatina (γ-H2AX), que é um marcador quantitativo para a resposta de dano de ADN no local de quebra da cadeia dupla [23], [ ,,,0],24], foi igualmente baixa, tanto WT e SLD5

+/- MEFs (Figura 1C e D). A exposição ao etoposido levou a um aumento no nível de γ-H2AX em ambos WT e SLD5

+/- MEFs, mas de modo significativamente mais neste último (Figura 1C e D).

(A) a análise western blot de expressão SLD5 no WT e SLD5

+/- MEFs. β-actina foi o controlo interno. (B) Avaliação quantitativa da expressão SLD5 como revelado em (A) com base na análise densitométrica. Os resultados são representados como vezes de alteração em comparação com o nível observado no WT MEFs. Os dados representam a média ± DP. *,

P Art 0,05 (n = 3). (C) análise de transferência de Western de expressão γ-H2AX em WT e SLD5

+/- MEFs após o tratamento com etoposido (ETO) ou veículo de controlo (DMSO). β-actina foi o controlo interno. (D) A avaliação quantitativa da expressão γ-H2AX como revelado em (C). Os resultados são dobrável alterações em comparação com o nível visto no WT MEFs tratados com DMSO. Os dados representam a média ± DP. *,

P

. 0,05 (n = 3)

Atraso da restauração do ciclo celular pela atenuação de expressão SLD5 em MEFs após danos no DNA

Para elucidar se danos no ADN marcado causada pela atenuação da expressão SLD5 refere-se a reparação de danos no ADN, foram medidos o nível de proteína Rad51, que é o componente essencial para a recombinação homóloga [25]. Como descrito acima, MEFs foram tratadas com 1 uM de etoposido durante 12 h, e a expressão da proteína Rad51 foi então analisada a 0, 24, 48 e 72 h após a sua remoção (Figura 2A, B). O nível de expressão Rad51 era equivalente em WT e SLD5

+/- MEFs antes do tratamento com etoposido. Em MEFs WT, o nível de Rad51 significativamente aumentado rapidamente após a exposição ao etoposido, mas menos em SLD5

+/- MEFs, e diminuiu gradualmente a 24, 48 h, quase regressar à linha de base em 72 h. Em contraste, a proteína de Rad51 em SLD5

+/- MEFs aumentou mais lentamente do que em MEFs WT e foi mantida durante um tempo mais longo. Isto sugere que um período mais longo é necessário para reparação do ADN após danos no DNA extensa em SLD5

+/- MEFs. tempo de reparo de DNA prolongada em SLD5

+/- MEFs por sua vez, sugere atraso restauração do ciclo celular após dano ao DNA. Portanto, contado o número de células viáveis ​​após o tratamento com etoposido, tal como descrito acima. A proliferação celular foi determinada pelo teste de exclusão de azul de tripano. Não houve diferença significativa entre WT e SLD5

+/- proliferação MEF após a exposição ao controlo de DMSO (Figura 3A), sugerindo que a expressão SLD5 reduzida para metade em MEFs não afecta o crescimento celular em si. Em contraste, após exposição a etoposida, SLD5

+/- MEFs exibida crescimento celular significativamente retardado em comparação com WT MEFs (Figura 3B).

(A) análise de transferência de Western de expressão Rad51 em WT e SLD5

+/- MEFs. β-actina foi o controlo interno. MEFs foram tratados com etoposido durante 12 h (-12~0) e lisaram-se nos momentos indicados. (B) Avaliação quantitativa da expressão Rad51 como revelado em (A) com base na análise densitométrica. Os resultados são fold-change em comparação com o nível visto no WT MEFs antes do tratamento com etoposido. Os dados representam a média ± SD *,

P

. 0,05 (n = 3)

MEFs foram tratadas com DMSO (A) ou etoposido (B), tal como indicado na. a Figura 2 e o mesmo número de células vivas, tal como indicado foram cultivadas com meio fresco durante 72 h. As células foram contadas na hora indicada. Os dados representam a média ± DP. *,

P Art 0,05 (n = 3)

dano ao DNA é aumentada em células cancerosas pela atenuação de expressão SLD5

Em células normais tais. como MEFs, danos no ADN foi fortemente induzida pela atenuação da expressão SLD5. Estamos próximos testaram se as células cancerosas também apresentam respostas semelhantes ao etoposídeo quando a expressão SLD5 foi impedido. Para este fim, a expressão SLD5 foi derrubado em células de melanoma de ratinho B16 e células cancerígenas do cólon do rato Colon26 por transfecção de siARN (# 1 e # 2) dirigido contra SLD5 (siARN B16 e siRNA Colon26). Confirmou-se que a expressão SLD5 poderia ser eficientemente silenciada por siARN específica em células B16 e Colon26 mas não por controlo scrambled siRNA (SCR B16 e SCR Colon26) (Figura 4A-D). Utilizando estas células, foi quantificado o dano no DNA medindo o nível de γ-H2AX por Western blotting. Após manutenção em meio completo durante 48 h, as células foram tratadas com DMSO como controlo ou 10 uM etoposido durante 0,5 h. O nível de expressão inicial γ-H2AX não foi elevada em ambos os SCR B16 ou células siARN B16 (Figura 5A, B). A exposição ao etoposido levou a um aumento do nível de γ-H2AX em ambas as células SCR B16 e B16 células siRNA, mas era significativamente maior no último (Figura 5A, B). Do mesmo modo, em células Colon26, atenuação da expressão aumentada SLD5 danos no ADN por etoposido (Figura 5C, D). Tomados em conjunto, conclui-se que a expressão SLD5 refere-se a danos no DNA em células normais e células cancerosas.

B16 ou Colon26 células foram transfectadas com controlo negativo mexidos (SCR) ou SLD5 siRNAs (# 1, # 2) e colhidas 48 h após a transfecção. SLD5 níveis de expressão de proteína em células B16 (A, B) ou Colon26 (C, D) foram quantificadas por Western blotting. β-actina foi o controlo interno. Os dados foram avaliados quantitativamente com base na análise densitométrica (B, D). Os resultados são representados como vezes de alteração em comparação com o nível observado nas células não tratadas de siRNA-B16 (B) ou células Colon26 (D), respectivamente. Os dados representam a média ± SD *,

P Art .. 0,05 (n = 3)

A análise Western blot de expressão γ-H2AX no SCR ou SLD5 siRNA-transfectadas B16 (A, B) ou Colon26 (C, D), as células após o tratamento com etoposido (ETO) ou veículo de controlo (DMSO). β-actina foi o controlo interno. Os dados foram avaliados quantitativamente com base na análise densitométrica (B, D). Os resultados são dobrável mudança em comparação com o nível observado nas células tratadas com siRNA SCR B16 (B) ou células Colon26 (D), respectivamente. Os dados representam a média ± DP. *,

P Art 0,05 (n = 3)

Atenuação de expressão SLD5 em células cancerosas não atrase a restauração do ciclo celular após dano ao DNA

Nós. previsto que a atenuação da expressão SLD5 iria atrasar a reparação do ADN e a restauração do ciclo celular em células cancerosas como observado em células normais. No entanto, embora o nível de expressão Rad51 foi a mesma em células SCR B16 e SLD5 siARN B16, e em células SCR Colon26 e SLD5 siARN Colon26 antes do tratamento com etoposido, a partir daí, um aumento rápido de Rad51 foi igualmente observado em todas as quatro linhas celulares ( A Figura 6A-D). Correspondente ao dano no DNA marcado em células siRNA B16 e siRNA Colon26, prolongada elevado nível de expressão Rad51 foi observada nestas linhas. Assim, um período prolongado para a reparação do ADN era comum a células normais e células cancerosas, mas a resposta rápida diminuiu a danos no ADN resultante de atenuação da expressão SLD5 em células normais não foi observado em células cancerosas.

RCS ou SLD5 siRNA B16 transfectadas (a, B) ou Colon26 (C, D), as células foram tratadas com etopósido durante 12 h (-12~0). As células foram lisadas nos tempos indicados. análises de Western blot de expressão Rad51 é mostrado. β-actina foi o controlo interno. Os dados foram avaliados quantitativamente com base na análise densitométrica. Os resultados são fold-change em comparação com o nível observado no SCR B16 (B) ou SCR Colon26 (D) antes do tratamento com etoposido. Os dados representam a média ± SD *,

P

.. 0,05 (n = 3)

células cancerosas Para avaliar como a rápida resposta a danos no DNA em SLD5 knocked-down afecta a restauração do ciclo celular, que enumeradas as células após o tratamento com etoposido. -se a proliferação celular não foi afetada pela derrubando SLD5 em células quer siRNA B16 ou siRNA Colon26 na presença de tratamento de controlo DMSO (Figura 7A, C). Quarenta e oito horas após o dano de ADN mediada por etoposido, houve apenas ligeiro retardamento da restauração do ciclo celular em ambos siARN B16 e siRNA Colon26 em relação ao observado na SCR B16 e SCR Colon26. No entanto, após 72 h, o crescimento celular foi induzida em células cancerosas SLD5-silenciados para a mesma extensão como em controlos em ambos B16 e Colon26 células (Figura 7B, D). Portanto, podemos concluir que o dano ao DNA extensa resultante da atenuação da expressão SLD5 afeta severamente a restauração do ciclo celular em células normais, mas não cancerosas.

SCR ou SLD5 siRNA transfectadas B16 (A, B) ou Colon26 (C, D células) foram tratadas com DMSO (a, C) ou etoposido (B, D) como indicado na Figura 6, e o mesmo número de células vivas, tal como indicado foram cultivadas com meio fresco durante 72 h. Os números de células foram registados. Os dados representam a média ± SD *,

P

. 0,05 (n = 3)

Discussão

foi relatado que SLD5 forma uma gins. complexo com outras porções tais como psf1, PSF2, e PSF3 e está envolvida na replicação do ADN em leveduras [5]. No presente relatório, propomos que SLD5 está envolvido em danos e reparação do ADN em células de mamíferos. Atenuação da expressão SLD5 resultou em danos no DNA marcado por agentes promotores de DNA rupturas de filamentos duplos; este era comum a células normais e células cancerosas. Um período de tempo foi necessário para a restauração do ciclo celular quando danos no ADN era extensa. Para essa resposta, as células precisam para melhorar a reparação do ADN. Quando a expressão SLD5 foi reduzida em células normais, a expressão de Rad51 foi retardada, o que sugere que SLD5 também está envolvido em montagem proteína de reparação de ADN. Em contraste, a expressão Rad51 rápida foi induzida em células cancerosas após danos no DNA e atraso de restauração do ciclo celular não era tão grave como em células normais. Papéis dos genes gins em outros tipos de cânceres têm sido relatados [17], [26]. Portanto, sugere-se que a função de SLD5 em danos no ADN e de reparação também é utilizada em outros tipos de células de tumor do que as células de melanoma e cancro do cólon usadas nas nossas experiências. Experiências adicionais são necessários para esclarecer este

Como descrito acima, o complexo Gin está envolvida na replicação do ADN.; No entanto, os componentes gins psf1, PSF2, PSF3 e SLD5 nem sempre formam complexos e podem ter outras funções. Por exemplo, psf1 regula a organização de microtúbulos em fase M e está envolvida no cromossoma segregação [20]. Recentemente, foi relatado que as moléculas homólogas que associam com a replicação do ADN em organismos inferiores podem também regular outros do que a replicação de ADN [27] eventos celulares – [29]. Portanto, é possível que SLD5, uma molula envolvida na replicação de ADN em levedura, também está envolvido na reparação de danos no ADN. Um relatório anterior sugeriu que os danos do ADN é impedido quando cromatina é condensado com histona [30]. No entanto, durante a replicação do DNA, DNA nu está dissociada da histona e está ameaçada pelos agentes que induzem DNA rupturas de filamentos duplos. Como SLD5 protege de DNA rupturas de filamentos duplos é, até agora, não está claro, mas podem estar envolvidos na modificação da histona. Uma análise mais aprofundada preciso é necessário para elucidar o mecanismo de protecção do dano de ADN proporcionada pela SLD5.

Era de esperar que seja necessário um maior período de tempo para a reparação do ADN em células com danos no DNA pior como resultado de falta de SLD5. Nossa hipótese é que a expressão Rad51 rápido poderia ser induzido em SLD5

+/- MEFs em comparação com WT MEFs para a reparação de DNA danificado pesadamente. No entanto, SLD5 atenuação foi encontrado para atrasar expressão Rad51 em MEFs, resultando em grave retardamento da restauração do ciclo celular. Estas descobertas sugerem que SLD5 não só protege contra danos no DNA, mas regula a rapidez de reparação do ADN. Recentemente, foi relatado que PSF2, também um membro do complexo de talhas, é fosforilada pela ATM cadeia de ADN após a ruptura [31]. Portanto, é possível que PSF2 está envolvido na reparação do ADN também. Além disso, foi relatado que os domínios N-terminais e C-terminais de Sld5 interagir com o N-terminal e as regiões C-terminais de Psf2 na estrutura de cristal do complexo Gin humanos [32], e Sld5 foi encontrada para interagir por de dois híbridos com PSF2 em

Drosophila

[33]. Será interessante para analisar as interacções entre SLD5 e PSF2 fosforilado durante a reparação do ADN.

Estudos recentes têm mostrado que o crescimento tumoral e metástase não são determinadas por células cancerosas por si só, mas também por várias células estromais. O estroma constitui uma grande parte da maioria dos tumores sólidos, e a interacção célula cancerosa-estromal funcionalmente contribui para o crescimento tumoral e metástase [34], [35]. Tumor estroma contém muitos tipos diferentes de células, incluindo fibroblastos associados ao cancro (CAF), pericitos, células endoteliais, células do sistema imunológico infiltradas. Entre eles, FAC são o tipo principal de célula que desempenham um papel crucial na tumorigénese e metástase [36], [37]. Os resultados de nossos experimentos demonstraram que a atenuação de danos no DNA marcada induzida SLD5 e suprimiu rápido restabelecimento do ciclo celular em MEFs. Assim, previmos que os inibidores SLD5 poderia ser candidatos de drogas anti-cancro. Nós descobrimos que em células de cancro, danos no ADN é fortemente induzida por silenciamento de expressão SLD5, como observado em MEFs; no entanto, Rad51 aumentado rapidamente e recuperação do ciclo celular não foi muito afetada. Isto sugere que as células cancerosas possuem máquinas de reparação do ADN adicional, independente da SLD5, e, assim, manter a capacidade proliferativa. Silenciamento SLD5 em células cancerígenas não podem, portanto, ser eficaz como uma estratégia para inibir o crescimento do tumor. No entanto, não apenas as células cancerosas, mas também os tipos de células normais, tais como fibroblastos e as células endoteliais proliferam no crescimento do tumor suporte microambiente do tumor como componentes de células do estroma [38] – [40]. O bloqueio da angiogénese tem sido mostrado para ser uma estratégia eficaz para inibir o crescimento tumoral e metástase [41]. Portanto, o silenciamento de expressão SLD5 ou supressão da função SLD5 por um pequeno composto ou de um análogo de nucleósido, tais como microRNA em células estromais de tumor pode inibir o desenvolvimento do microambiente do tumor e pode ser uma abordagem promissora para inibir o crescimento de tumores semelhantes à estratégia de tumor inibindo angiogênese.

Reconhecimentos

Agradecemos Ms. K. Fukuhara, Ms. Fujimoto para assistência técnica.