Abstract

O câncer de próstata (PCA) é o tipo mais comum de câncer em homens nos Estados Unidos, o que afeta desproporcionalmente descidas afro-americanos. Enquanto metástase é a causa mais comum de morte entre os pacientes APC, não há marcadores específicos foram atribuídos a gravidade e biasness étnica da doença. MicroRNAs representam uma classe nova e promissora de biomarcadores, devido à sua inerente estabilidade e resiliência. No presente estudo, investigou potenciais miRNAs que podem ser usados ​​como biomarcadores e /ou alvos terapêuticos e pode dar uma ideia da gravidade e biasness étnica de CaP. matriz de PCR foi realizada em tecidos FFPE CaP (5 Caucasiano americanos e 5 americanos Africano) e selecionados miRNAs diferencialmente expressos foram validados por qRT-PCR, em 40 (15 CA e 25 AA) emparelhado APC e tecidos normais adjacentes. Significativamente miRNAs desregulados também foram analisados ​​em amostras de urina para explorar o seu potencial como biomarcador não invasivo para CaP. De 8 miRNAs selecionados para validação de dados da matriz de PCR, miR-205 (

p Art 0,0001), mir-214 (

p Art 0,0001), miR-221 (

p Art 0,001) e miR-99b (

p Art 0,0001) foram significativamente regulada negativamente em tecidos APC. ROC curva mostra que todos os quatro miRNAs discriminados com sucesso entre APC e tecidos normais adjacentes. MiR-99b mostrou regulação negativa significativa (

P

0,01) nos tecidos AA CaP em comparação com tecidos CA APC e pode estar relacionada com a agressividade associada a população AA. Na urina, miR-205 (

p Art 0,05) e miR-214 (

p Art 0,05) foram significativamente regulada negativamente em pacientes APC e pode discriminar pacientes CaP de indivíduos saudáveis ​​com 89 % de sensibilidade e especificidade de 80%. Em conclusão, o presente estudo mostrou que o miR-205 e miR-214 são reprimidos no APC e pode servir biomarcador molecular não-invasivo como potencial para CaP

Citation:. Srivastava A, Goldberger H, Dimtchev A, Ramalinga M , J Chijioke, Marian C, et ai. (2013) Profiling MicroRNA no câncer de próstata – o potencial diagnóstico de urinária miR-205 e miR-214. PLoS ONE 8 (10): e76994. doi: 10.1371 /journal.pone.0076994

editor: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Centro, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de julho de 2013; Aceito: 04 de setembro de 2013; Publicação: 22 de outubro de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por doações do NIH (CA162264 e CA141935) e um programa de PCRP do CDMRP (PC111314). JC é suportada pelo suplemento sobre CA162264-02S1. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é o câncer masculino mais frequentemente diagnosticado e a segunda principal causa de mortalidade oncológica em homens nos Estados Unidos [1]. Em 2013, ~238,590 novos casos de CaP são estimados para ser diagnosticada nos EUA, que pode reivindicar ~29,720 mortes [1]. homens afro-americanos (AA) são desproporcionalmente afectados com PCA com uma taxa de incidência de dois terços superior e taxa de mortalidade duas vezes maior quando comparado a americanos caucasianos (CA) [2]. Devido às suas sintomas específicos não e progressão gradual, o PCA é geralmente diagnosticado em um estágio avançado. No entanto, se diagnosticado numa fase inicial CaP pode ser tratada com sucesso.

testes realizados rotineiramente para detecção precoce de CaP incluir o exame retal digital (DRE) e antígeno (PSA), em específico da próstata. teste de PSA é não-específica, como níveis elevados de PSA devido a hiperplasia prostática benigna (BPH), infecção e /ou inflamação crónica pode conduzir a resultados de confusão [3] – [4]. Baixa especificidade (teste de PSA) e baixa sensibilidade (DRE) destes testes restringe seu significado diagnóstico [5]. Embora ensaios clínicos defendem que o rastreio PSA facilita muito o diagnóstico precoce da APC, se este procedimento de triagem reduz significativamente a mortalidade CaP continua a ser uma questão de debate [6] – [7]. Uma meta-análise recente concluiu que a triagem de rotina ou com um DRE ou PSA não oferece nenhum benefício e não influencia a mortalidade CaP [8]. Para superar estas desvantagens, os biomarcadores adicionais foram propostos, incluindo derivados de PSA como a velocidade total de PSA (PSAV total) e formas moleculares diferentes de PSA, tais como PSA livre, BPSA, pro-PSA e PSA intacta [9]. Outros biomarcadores base de sangue tais como a calicreína glandular humana 2 (hK2), activador de plasminogénio de urocinase (uPA) e o seu receptor (uPAR), factor de crescimento transformante-beta 1 (TGF-β1); interleucina-6 (IL-6) e o seu receptor (IL-6R) têm sido estudados por si só ou em combinação com PSA e sugerido para o diagnóstico, estadiamento, prognóstico e monitorização do cancro da próstata [10]. No entanto, devido à natureza heterogénea da doença, biomarcadores de prognóstico adicionais são urgentemente necessários para uma melhor previsão da progressão da doença que pode ajudar na tomada de decisão clínica sobre o momento da biópsia e necessidade de tratamento.

Os microRNAs (miRNAs) são pequenos (18 a 24 nucleótidos), altamente conservadas, moléculas de RNA não codificante que regulam a expressão do gene de pós-transcricionalmente [11] – [12]. Estudos computacionais sugerem que mais de 60% dos transcritos de genes de mamíferos são regulados por miARNs [13] – [14]. MiRNAs desempenham um papel chave na regulação de processos celulares, incluindo divergentes do ciclo celular, a proliferação, a diferenciação e a apoptose [15]. Estudos recentes têm implicado vários miRNAs no desenvolvimento e progressão de vários cancros humanos e também como potencial biomarcador para o diagnóstico e prognóstico [16] câncer – [19].

Considerando a natureza heterogénea de tecidos de câncer, captura a laser micro dissecção (LCM) oferece uma abordagem atraente para isolar populações de células definidos a partir FFPE espécimes [20]. LCM em combinação com a tecnologia de qRT-PCR foi utilizado para a medição precisa da expressão dos genes a partir de amostras de FFPE. No presente estudo, utilizou-LCM e realizada miARN perfis no cancro da próstata e correspondente tecidos normais adjacentes para identificar miARNs associados com o desenvolvimento de CaP. Os miARNs identificados foram ainda validado em conjuntos de amostras maiores. Para testar o seu potencial de diagnóstico não invasivo, também avaliamos a expressão de miRNAs candidatos em um conjunto independente de amostras de urina de pacientes APC.

Materiais e Métodos

Amostras de Pacientes

Todas as amostras do paciente foram obtidos de-identificada para proteger a confidencialidade do paciente e teve Universidade de Georgetown IRB-aprovação e consentimento. Todas as amostras de tecido foram obtidas a partir de GU /LCCC Histopatologia Tissue Resource Shared (https://lombardi.georgetown.edu/research/sharedresources/htsr/) e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes para amostra de urina. Resumidamente, 40 de formalina-fixo, blocos (FFPE) amostras de tecido embebidos em parafina de prostatectomia radical que consiste 15 Caucasiano (AA) Americana (CA) e 25 Africano americano foram obtidos a partir Lombardi Histopatologia e Tissue Resource Shared (RSTH) entre 1997-2002. Amostras de urina de 36 pacientes CaP (18 AC e 18 AA) e 12 anos de idade e etnia combinado dadores saudáveis ​​(6 CA e 6 AA) foram obtidos a partir de Georgetown University Hospital Cancer Program Cyberknife próstata entre 2009 e 2012.

Laser capturar Microdissecção (LCM)

hematoxilina e eosina (H e) lâminas coradas de blocos FFPE de arquivamento foram revisadas por um patologista placa certificada, para a identificação de CaP focos, bem como o tecido normal adjacente. LCM foi realizada em Arcturus sistema de microscópio a laser de captura com 5000 a 6000 impulsos de laser para cada amostra para capturar 30.000 a 50.000 células de CaP focos e tecido normal adjacente. células capturadas foram imediatamente congeladas a -80 ° C até à sua utilização.

Extração de RNA e de miARN perfil de expressão

extracção de ARN a partir de células microdissecadas e amostras de urina foi realizada utilizando Recuperar Isolamento Todos ™ totais Ácido Nucleico e Mirvana ™ miRNA kits de isolamento respectivamente (Ambion, Austin, TX), conforme o protocolo do fabricante. O ARN foi quantificado utilizando NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific, Waltham, MA) e Agilent Bioanalyzer 2100 (Santa Clara, CA).

O ARN foi convertido em cDNA usando Megaplex ™ piscinas de Iniciador e Kit Taqman miARN Transcrição Reversa (Biosytems Aplicada, Grand Island, NY). Um perfil de expressão miRNA abrangente foi realizada utilizando TaqMan matriz MicroRNA Um cartão Humano v2.0 seguindo as recomendações do fabricante (Biosytems Aplicadas, Grand Island, NY). Quantitative PCR em tempo real (qRT-PCR) foi realizada para o rastreio de um total de 377 miARNs humanos originais pela Applied Biosystems 7900 HT rápido em tempo real do sistema de detecção de sequência de PCR. Os dados foram analisados ​​no software do sistema de detecção de sequências (SDS) (versão 2.3, Biosytems Aplicadas, Grand Island, NY). Os níveis de expressão de miRNA relativos foram normalizados contra o controle endógeno U6 snRNA.

Validação por qRT-PCR

Os níveis de expressão de miRNAs selecionados foram medidos em 40 pacientes CaP usando inventariados TaqMan miRNA Ensaios (Biosytems Aplicadas, Grande island, NY) seguindo as recomendações do fabricante, em 7300 real-Time PCR System (Biosytems Aplicadas, Grand island, NY). Resumidamente, 10 ng de ARN foi transcrito de forma inversa utilizando iniciadores específicos de haste-laçada. As amostras de tecido foram normalizados a norma U6 controle interno snRNA que, RNU48 foi usado como normalizar o controle de amostras de urina. controles não transcriptase reversa (RT) foram utilizados para descartar a possibilidade de contaminação potencial DNA genômico. MicroRNAs com ciclo limiar (Ct) valores de ≥38 foram excluídos da análise. Todas as amostras foram submetidos a transcrição reversa e qRT-PCR, simultaneamente, para minimizar erros introduzidos por variações na eficiência da reação.

Data Mining, Target Identificação e Análise Caminho

A expressão de miRNAs selecionados foram analisados ​​em Gene Expression Omnibus (GEO) em base de dados ‘R’ por GEO2R [21]. Os alvos de ARNm para miARNs expressos diferencialmente foram identificados usando o software e bases de dados on-line, tal como TargetScan [22], PicTar [23] e miRDB [24] seguido de alvos adicionais verificadas experimentalmente a partir miRTarBase [25]. interações gene-gene possíveis e agrupamento funcional entre os alvos de miRNAs, foi realizada utilizando Ariadne Pathway Studio 9.0.

Análise Estatística

Os dados humanos matérias-matriz MicroRNA-A v2.0 cartão foram analisados ​​estatisticamente por software Integromics RealTime StatMinier versão 4.0 e software R /Bioconductor versão 2.9.2. O 2

-ΔΔCt método [26] foi utilizado para pré-processamento e dobre cálculos de mudança. miRNAs diferencialmente expressos entre os tecidos APC e tecido normal adjacente foram identificados usando o pacote Limma [27], que emprega o modelo Bayesian empírica para lidar com o pequeno tamanho da amostra em comparação com o relativamente muito maior número de miRNAs. O

p

valores foram ajustados usando a correção de Benjamin-Hochberg taxa de descoberta de falsas (FDR) [28].

Todos os experimentos qRT-PCR foram realizadas de acordo com o MIQE (informações mínimas para a publicação de quantitativas experiências de PCR em tempo real) orientações [29]. Cada reacção de amplificação foi efectuada em triplicado, e o valor médio do limite de três ciclos foi usada para análise posterior. Os dados são apresentados como médias ± SE e P value≤0.05 foi considerado estatisticamente significativo. T-teste de Student não paramétrico foi utilizado para a comparação de dois grupos (câncer vs. não-câncer), e todas as estatísticas foram ajustadas usando a correção Holm-Bonferonni para comparações múltiplas. Todos os diagramas de caixa representam níveis de miRNA em relação ao U6 snRNA, transformados em quantidades utilizando a fórmula 2

-ΔCt [30].

receiver operating characteristic (ROC) foram construídos e área sob a curva (AUC) foi estimado para estudar a viabilidade de utilização dos miRNA específicos para discriminar pacientes CaP de controles saudáveis. A regressão logística foi usada para construir curvas ROC utilizando os níveis de expressão de miRNA. Toda a análise estatística foi realizada utilizando GraphPad Prism v6 (La Jolla, CA).

Resultados

Expression Profiling de miRNAs em câncer de próstata tecidos

Avaliar mudanças na expressão de miRNA em tecidos APC e bio-fluidos oferecer uma ferramenta promissora para a identificação de biomarcadores específicos que podem ajudar no diagnóstico e prognóstico de CaP. Inicialmente, foi utilizado microdissection capturou-laser (LCM) para capturar região de tecidos de câncer e as correspondentes contrapartidas normais adjacentes a partir de amostras FFPE de pacientes de prostatectomia radical. perfil de expressão MicroRNA foi realizado em 10 pacientes com CaP de Gleason (GS) 6-7 (5 AA e 5 CA). O regiões normais adjacentes câncer e foram identificados pela BVSK patologista. células capturadas de várias regiões do câncer de cada paciente foram reunidos para refletir a heterogeneidade da APC e população de pacientes; homólogos dos tecidos normais adjacentes serviu como controle não-câncer. Foi realizada a análise de perfis de miARN e descobriu que a maioria dos miARNs foram regulados negativamente em tecidos de cancro, com a excepção de miR-367, o miR-758 e miR-190 que se verificou ser regulada positivamente (Tabela 1). Para a validação, foram selecionados os 3 miRNAs regulados positivamente (MIR-367, miR-758 e miR-190) e 5 miRNAs regulados negativamente (MIR-205, miR-214, miR-212, miR-221 e miR-99B) com base na sua papel publicado na biologia do câncer. Profiling de dados para todos os 10 pacientes (5 CA e 5 AA) foi submetido ao banco de dados do GEO (número de acesso GSE48430).

Validação de miRNAs por RT-PCR quantitativo

A selecionados 8 miRNAs foram validados no tumor dissecados-LCM e do tecido normal adjacente de 40 pacientes, incluindo 10 pacientes utilizados para miRNA perfil. A Tabela 2 apresenta as características clínico-patológicas dos pacientes. Os resultados qRT-PCR de 40 amostra do paciente (15 AC e 25 AA) espécimes revelou diminuição da expressão de miR-205 (

p Art 0,0001), miR-214 (

p Art 0,0001), o miR-221 (

P

0,001) e miR-99b (

P

. 0,0001) em tecido de cancro, em comparação com o tecido não-cancro adjacente (Fig 1A) . Apesar de miR-212 mostrou tendência de downregulation na CaP comparativamente ao tecido normal adjacente, a diferença não foi estatisticamente significativa (

p

= 0,061). Não houve diferença significativa na expressão relativa de miR-758 e miR-190 em tecido de tumor em comparação com as suas contrapartes normais adjacentes e os níveis de miR-367 não podia ser detectado depois de 38 ciclos (dados não mostrados). Portanto, miR-212, miR-758, miR-190 e miR-367 foram excluídos do estudo mais aprofundado

(A) A validação dos miRNAs por qRT-PCR:. Os diagramas de caixa que representam o nível de quatro miRNAs expressão tecidual em 40 tecidos FFPE APC e seus tecidos normais adjacentes emparelhados. Os níveis de expressão das miARNs são normalizados para U6 snRNA como controle endógeno. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas usando T-Student não pareado. Detectamos diminuição significativa na expressão de miR-205 (

P

0,0001), o miR-214 (

P

0,0001), o miR-221 (

p

0,001) e miR-99b (

P

0,0001) nos tecidos de CaP em comparação com os tecidos normais adjacentes. * Indica

p Restaurant 0,0001 e ** denota

p Art 0,001. característica de operação (B) do receptor (ROC) análise da curva: curva ROC para quatro miARNs foram feitas para diferenciar CaP de tecidos saudáveis. A área sob a curva ROC (AUC) para cada miRNA transmite a sua precisão para a diferenciação dos tecidos APC e tecidos normais em termos de sensibilidade e especificidade.

Receptor características operacionais (ROC) foram construído de modo a explorar a sensibilidade e especificidade de miR-205, o miR-214, o miR-221 e miR-99b e avaliar o seu potencial para ser utilizado como biomarcador para discriminar entre APC e doença indivíduos livres (Fig. 1B). Os resultados sugerem que os quatro miRNAs pode discriminar entre os dois grupos com alta precisão; miR-205, AUC = 0,83 (95% CI = 0,74-,91); miR-214 AUC = 0,92 (IC 95% = 0,86-0,99); miR-221 AUC = 0,75 (IC 95% = 0,63-0,84) miR-99b AUC = 0,86 (IC 95% = 0,78-0,95) (Fig. 1B).

A expressão de miRNAs em GEO conjuntos de dados

a mineração de dados foi realizada por meio GEO2R para verificar o status de miRNAs diferencialmente expressos em conjuntos de dados GEO publicamente disponíveis. conjuntos de dados de microarray GSE21036 (Taylor et ai.) [31] e GSE36802 (Lin et ai.) [32] foram consultados para a expressão de seleccionados quatro miARNs (miR-205, miR-214, o miR-221 e miR-99B) de interesse. Apoiando nossos dados de tecidos, em GSE21036, todos os quatro miARNs também foram regulados negativamente nos tumores primários da próstata (n = 99) em comparação com os tecidos normais da próstata (n = 28) (miR-221,

P

0,0001 ; miR-205,

p Art 0,0001; miR-99b,

p Art 0,0001; miR-214,

p Art 0,05). Da mesma forma, em GSE36802, observou-se a regulação negativa de todos os quatro miARNs em tumor primário clinicamente localizado (n = 21), quando em comparação com CaP benigna (n = 21) (miR-221,

P

0,0001; miR -205,

p Art 0,0001; miR-99b,

p Art 0,0001; miR-214,

p

. 0,05) (Figura 2).

dados de validação microRNA para 99 pacientes (a) primários APC e 28 controles normais e (B) 21 pacientes cada um com CaP primária clinicamente localizado e benigno CaP foram obtidos a partir do banco de dados do NCBI GEO (GEO adesão não. GSE21036 e GSE36802, respectivamente). São mostrados os gráficos de dispersão do nível de expressão de miR-205, miR-214, miR-221 e miR-99b nos conjuntos de dados obtidos a partir do banco de dados GEO.

Caminho Análise de Redes de diferencialmente Modulada miRNAs

para obter insights funcionais para o papel de miRNA em APC e investigar as possíveis interações gene-gene entre os objectivos dos quatro miRNAs, construímos uma rede de interação usando Pathway Studio 9.0. Um total de 98 alvos de ARNm foram identificados por (a) alvos comuns obtidos a partir de três programas (TargetScan, PicTar e miRDB) para todas as 4 miARNs e alvos (b) validado para a 4 foram obtidos por miARNs miRTarBase. Nós adicionamos reguladores comuns, juntamente com interações-directos directos regulação da expressão do gene, ligação proteína-proteína, ou a ligação promotor. Um complexo de sinalização evoluiu de 62 dos 98 alvos revelou VEGFA, ICAM1, p53, ESR1, SELE e FOS como nós comuns /centros de diversas interações sugerindo vias comumente impulsionado pelos genes ligados e candidato a futuro verificação experimental e estudos funcionais (Fig. 3). O restante 36 alvos foram excluídos pelo software devido à falta de conectores comuns. A segunda via, construída para identificar alvos miRNA com interações diretas, sugeriu nódulos semelhantes /hubs (Fig. 3).

rede Caminho foi construído para mRNAs alvo comumente previstos de miRNAs diferencialmente modulados (MIR-205, miR- 214, miR-221 e miR99b), usando Pathway Studio 9.0 (A) alvos miRNA Comumente previstas com reguladores comuns. (B) Diretamente interagindo alvos.

variação étnica de miRNA Expressão

Africano americanos (AA) os homens têm uma maior incidência de CaP em comparação aos homens Caucasiano americano (CA). Nós perguntado se os níveis de expressão de miR-205, o miR-214, o miR-221 e miR-99b foram diferentes entre as duas populações (n = 15 CA; n = 25 AA). Para testar isso, comparamos as diferenças vezes de cada miRNA em tecido de cancro em relação ao seu tecido normal adjacente em AA e amostras CA. Como mostrado na Fig. 4, não houve diferença significativa nos padrões de miR-205, o miR-214 e miR-221 e entre o CA população AA expressão. No entanto, uma diminuição da expressão significativamente (

P

0,01) (Fig. 4). Do miR-99b foi observada em tecido de cancro a partir de pacientes com CaP AA quando comparado com pacientes com CaP

CA

Box parcelas representam a diferença vezes nos níveis de quatro miARNs em tecidos de expressão de CaP em comparação com a sua contrapartida normal adjacente. Dados para 15 Caucasiano pacientes 25 Africano americanos (AA) Americana (CA) e como avaliados por qRT-PCR é mostrado. Os níveis de expressão das miARNs foram normalizados para U6 snRNA como controle endógeno. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas usando T-Student não pareado.

Detecção de miRNAs em amostras de urina

biópsias de tecidos são invasivos e não a fonte preferida de biomarcadores. A seguir, explorou a possibilidade, se o miR-205, o miR-214, o miR-221 e miR-99b podem ser detectados de forma não invasiva através da análise de amostras de urina de pacientes com CaP. A partir de um estudo em curso, foram selecionados 36 pacientes APC e 12 anos de idade e etnia combinado doadores saudáveis ​​como um grupo de controle não-câncer. A Tabela 3 mostra características dos pacientes APC e indivíduos saudáveis ​​recrutados no estudo de amostras de urina. Uma vez que para miRNA perfil usamos amostras de tecido com GS6 e GS7, obtivemos amostras de urina de pacientes com GS6 e GS7 como uma reflexão das amostras de tecido. Todos os quatro miARNs (miR-205, miR-214, o miR-221 e miR-99B) estavam presentes em concentração detectável em amostras de urina. Descobrimos que urinária miR-205 (

p Art 0,05) e miR-214 (

p Art 0,05) níveis foram significativamente menores no grupo de câncer em relação ao grupo de controle saudável ( A Fig. 5A). Não foram observadas diferenças significativas nos níveis de miR-221 e miR-99b expressão. Para avaliar o potencial de diagnóstico, as curvas ROC para todos os 4 miARNs analisados ​​nas amostras de urina foram construídos. A curva ROC mostrou que miR-205 e miR-214 pode discriminar pacientes CaP de controle normal com AUC: 0,7083 (IC 95% = 0,54-0,86) e 0,7431 (IC 95% = 0,58-0,90), respectivamente (Fig. 5B) . Além disso, o miR-205 e miR-214 se empregado em conjunto pode discriminar os pacientes CaP de indivíduos saudáveis ​​com sensibilidade de 89% e especificidade de 80% (Fig. 6). Tomados em conjunto, os nossos resultados mostram que o miR-205 e miR-214 estão presentes em ambos os tecidos e de urina de pacientes com CaP, sugerindo que a urina pode ser empregue para detectar alterações nos níveis de expressão miARNs.

(A) os diagramas de caixa que representam o nível de expressão de urina de quatro miRNAs (miR-205, miR-214, miR-221 e miR-99B) na urina de 36 pacientes APC e 12 indivíduos saudáveis, avaliada pela qRT-PCR. Os níveis de expressão das miARNs são normalizados para RNU48 como controle endógeno. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas usando T-Student. Detectamos significativa diminuição da expressão de miR-205 (

p Art 0,05), miR-214 (

p Art 0,05) na urina de pacientes com CaP, em comparação com controles saudáveis. Não foi observada diferença significativa nos níveis de miR-221 e miR-99b expressão. * Indica

p Art 0,05. característica de operação (B) Receptor (ROC) análise da curva de quatro miRNAs foi usada para diferenciar os pacientes CaP de indivíduos saudáveis. A área sob a curva ROC (AUC) para cada miRNA transmite a sua precisão para a diferenciação de pacientes APC e indivíduos saudáveis ​​em termos de sensibilidade e especificidade.

A quantificação de miR-205 e miR-214 em conjunto pode aumentar o valor de diagnóstico e podem ser usados ​​para discriminar pacientes CaP de indivíduos saudáveis ​​com sensibilidade de 89% e especificidade de 80%.

Discussão

Alterações nos níveis de expressão de miRNA, resultando na modulação das vias de sinalização múltiplas, têm sido associados a iniciação e progressão de CaP. No presente estudo, a utilização da perfilação global seguida de miARN estudos de validação, que mostrou que o miR-205, o miR-214, o miR-221 e miR-99b foram significativamente regulada negativamente em tecidos de CaP em comparação com o tecido normal adjacente homólogos.

Um dos mais estudados microRNA, miR-205 que é mostrado para ser regulada negativamente em vários cancros, incluindo CaP [33] – [34], também foi identificada como subregulado miRNA em CaP em nosso estudo. miR-205 foi mostrada para ser supressor de tumor epigeneticamente reprimida em CaP [35] que exerce as suas funções de tumor-supressor na próstata humana por meio de infra-regulação de alvos múltiplos, tais como BCL2 [36], a proteína quinase C epsilon [34] e receptor de andrógeno (AR) [37]. A perda de miR-205, também tem sido associada com mau prognóstico, resistência a apoptose em APC e é sugerida para ser uma característica da transição epitelial-mesenquimal [37] – [41]. Outros estudos matriz expressão também identificaram miR-205 a ser reprimida em CaP [33] – [34], [42] – [43]. expressão de baixo nível de miR-205 também é um marcador de prognóstico da cabeça humana e carcinoma de células escamosas do pescoço [44] e o local foi relatado para ser silenciado por hipermetilação do promotor de tumores de bexiga invasivo [45]. O presente estudo, bem como a literatura anterior afirma um importante papel de miR-205.

O próximo miRNA expressão aberrante em nosso estudo foi miR-214 que foi mostrado para ser frequentemente reprimidos no cancro do colo do útero [46], ovário cancro [47] – [48], o carcinoma hepatocelular [49] – [51] e colangiocarcinoma [52]. Em contraste, a expressão elevada de miR-214 tem sido associado com o cancro pancreático [53] e com resultado desfavorável na sobrevivência global no carcinoma gástrico [54]. MiR-214 desregulamentação não foi anteriormente relatado no cancro da próstata. Este é o primeiro estudo a mostrar que miR-214 é expressão aberrante em CaP. O regulamento jusante significativa em biópsias de tecidos, bem como amostras de urina de pacientes com CaP introduz miR-214 como um jogador novo no APC, que precisa de uma maior exploração.

Outra miRNA reprimidos em nosso estudo foi miR-221. Importantemente, o miR-221 foi identificado como o mais significativamente modulada miARN nos dois conjuntos de dados CaP GEO. MiR-221 é de-regulamentada em variedade de cânceres, principalmente como um sobre-expressos miRNA [55] – [59]

Na APC, downregulation de miR-221 tem sido relatada em TMPRSS2:. Fusion- ERG CaP positiva e está significativamente associado à metástase e recorrência bioquímica [58], [60]. Poucos estudos também relataram um papel oncogênico de miR-221 em CaP [61] – [62] e para o desenvolvimento e manutenção do fenótipo de resistência a castração [63] – [64]. Nosso resultado é um dos poucos relatórios infra-regulação de miR-221 em tecidos APC e justificam estudos adicionais.

Outra miRNA muito importante identificados em nosso estudo foi miR-99b. A família miR-99 incluindo o miR-99b tem sido associada com a supressão CaP e prognóstico [63]. A sub-regulação de miR-99b também tem sido observada em pacientes com cancro do pulmão [65]. Mir-99b também tem sido mostrado para ser sobre-expresso no sarcoma sinovial [66] e está relacionado com a presença de linfonodo metástases no cancro esofágico [67]. Os nossos resultados indicam que a sub-regulação de miR-99b é mais pronunciada em tecidos de CaP AA em comparação com os tecidos CA CaP (Fig. 4). Estudos funcionais no miR-99b são limitados e estas observações novos exigem novas investigações sobre o papel das metas miR-99B. Tomados em conjunto, presente dados indicam que, juntamente com vários outros fatores, a variação dos miRNAs como miR-99b expressão pode explicar a agressividade étnica da doença.

Para explorar as redes de sinalização regulados por estes quatro miRNAs, nós construído um caminho de suas metas previstas comuns usando ferramentas de bioinformática disponíveis e alvos validados na literatura. Adicionando os reguladores comuns, foram identificados centros de sinalização centrais que têm sido relatados a desempenhar um papel importante na sinalização da célula cancerosa sugerindo um papel importante destes quatro miRNAs no PCA (Fig. 3). Em seguida, foi construída uma rede de interação direta de alvos de miRNA sem reguladores comuns. VEGFA, p53, ESR1, FOS e ICAM1 permaneceu como hubs centrais [68] – [72]. O mTOR foi o único alvo miR-99b, que foi incluído na rede comum. Identificamos miR-99b como diferencialmente modulados miRNA em AA CaP. mTOR desempenha um papel importante no APC e tem sido associada com uma doença agressiva, a resistência à terapia e desenvolvimento de CaP de castração resistente [73]. inibidores de mTOR, também foram avaliadas como terapia para CRPC [74]. Associação de miR-99b com AA PCA é altamente significativa e novos estudos em nosso laboratório são direcionados para caracterizar miR-99b e seus alvos em tornando agressivo fenótipo CaP.

O conceito de usar a urina para a detecção de diferencialmente expressos miRNAs como biomarcador é relativamente novo. Considerando-se a ideia de que tecidos derivados padrões de miRNAs de expressão podem ajudar-nos a avaliar miRNAs como biomarcadores para vários tipos de câncer em circulação, miRNAs mais promissores observados em nosso estudo foram estudados em urina de pacientes APC, para avaliar o seu potencial diagnóstico ou prognóstico. Consistente com os nossos achados em amostras de tecido, nós também foram capazes de detectar miR-205, miR-214, miR-99b e miR-221 em amostras de urina de pacientes APC. Os níveis de miR-205 e miR-214 eram significativamente baixa em pacientes com CaP e pode ser explorada como um biomarcador de diagnóstico não invasivo para CaP. Embora a sensibilidade e a especificidade é maior no tecido, urinário miR-205 e miR-214 níveis juntos podem discriminar pacientes de indivíduos saudáveis, com elevada precisão. Para nosso conhecimento, nosso estudo revela pela primeira vez que miR-205 e miR-214 pode fornecer uma modalidade não invasiva alternativa para distinguir entre APC e indivíduos saudáveis ​​e pode servir como um biomarcador confiável para CaP.

o uso da urina como amostra para marcador tumoral permanece um desafio, tendo em conta o facto de que a urina contém uma grande variedade de biomoléculas incluindo quantidade elevada de nucleases e RNases. No entanto, devido ao pequeno tamanho, os miRNAs são mais estáveis ​​contra a RNase degradação que defende seu mérito como biomarcadores [75]. Poucos estudos examinaram o potencial dos miRNAs urinários como marcadores de diagnóstico e prognóstico de câncer de bexiga, doenças renais, câncer urotelial, carcinoma hepatocelular e carcinoma de células renais [76] – [80]. Embora os níveis de miARN têm sido estudadas em várias doenças, nenhum estudo abrangente para fazer circular miARN na urina para CaP tem sido relatada até agora, com a excepção de Bryant et ai [81] – [82]. Significativamente maior concentração de miR-107 e miR-574-3p foram quantificados na urina de homens com CaP em comparação com os controlos [82]. Tanto quanto é do nosso conhecimento, que demonstram, pela primeira vez, que o miR-205 e miR-214 são regulados negativamente em tecido CaP, bem como na urina de pacientes com CaP. Nós reconhecemos a limitação do nosso estudo que os tecidos e urina obtidos não eram dos mesmos pacientes e nosso pequeno tamanho da amostra. No entanto, o nosso estudo fornece a prova de conceito que desregulamentou miRNAs em tecidos pode ser explorado como biomarcadores de urina não-invasivos em CaP. A curva ROC demonstra que o miR-205 e miR-214 em conjunto têm uma capacidade para distinguir entre indivíduos saudáveis ​​e pacientes com CaP sensibilidade de 89% e especificidade de 80%.