Abstract

Nós avaliamos o potencial de um agente de reversão histonas metilação investigação, 3-deazaneplanocin A (DZNep), na melhoria da quimio-sensibilidade de câncer pancreático para nucleosídeos análogos (ou seja, gemcitabina). DZNep trouxe citotoxicidade atraso, mas seletiva para as células de câncer de pâncreas, sem afetar as células normais humanas pancreáticas epiteliais ductal (HDPE). Co-exposição de DZNep e gemcitabina induzida aditividade citotóxico ou sinergismo em ambas as linhas de células de pâncreas e bem- pobremente diferenciadas, por aumento da apoptose. Em contraste, DZNep exercida antagonismo com gemcitabina contra células HPDE com redução significativa da citotoxicidade em comparação com o regime de gemcitabina isolada. DZNep marginalmente dependia purina transportadores de nucleosídeos para a sua citotoxicidade, mas a dependência dos transportes foi contornada por derivação acilo. estudos de exposição ao fármaco revelaram que uma pequena priming com DZNep gemcitabina seguido por tratamento, em vez de co-tratamento de ambos os agentes para produzir uma resposta máxima quimiossensibilização em ambas as células de cancro do pâncreas sensível ao gemcitabina e gemcitabina-resistente. DZNep rápida e reversível diminuiu trimethylation de lisina histona H3 27, mas aumentou trimethylation de lisina 9 de forma EZH2- e JMJD1A /2C-dependente, respectivamente. No entanto, DZNep potenciação da quimiossensibilização análogo de nucleosídeo foi encontrado para ser temporalmente acoplado a trimethylation mudanças na lisina 27 e não de lisina 9. nanopartículas poliméricas modificadas para cronologicamente libere DZNep seguido de gemcitabina produzido pronunciada quimiossensibilização e efeitos de redução de dose. Juntos, nossos resultados identificam que uma exposição DZNep otimizado pode presensitize células do cancro do pâncreas anticancerígenos análogos de nucleosídeos através da reversão de metilação de histonas, enfatizando os utilitários clínicos promissores dos agentes de reversão epigenéticas em futuras terapias de combinação do cancro do pâncreas

Citation.: Hung SW, Mody H, Marrache S, Bhutia YD, Davis F, Cho JH, et al. (2013) Reversão Farmacológica de Células histona metilação Presensitizes do cancro do pâncreas para nucleosídeos Drogas:

In Vitro

Optimization e novas nanopartículas de Estudos de entrega. PLoS ONE 8 (8): e71196. doi: 10.1371 /journal.pone.0071196

editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos da América

Recebido: 13 de fevereiro de 2013; Aceito: 27 de junho de 2013; Publicação: 06 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Hung et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde [Grant P30GM092378] (SD), o Instituto Nacional do Câncer [Grant 1R03CA161832-01] (RG), a Geórgia Cancer Coalition (RG) e OVPR de The University of Georgia (SD). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

proteínas grupo Polycomb (pcgs) pode remodelação da cromatina ao influenciar o grau de compactação, o que leva ao silenciamento do gene epigenético. Polycomb repressiva Complexo 2 (PRC2), uma das duas classes de pcgs, induz a actividade da metiltransferase histona principalmente por trimethylating histona H3 na lisina 27 (H3K27me3), mediar silenciamento de genes supressores de tumores. A subunidade catalítica de PRC2 é Enhancer de Zeste Homólogo 2 (EZH2), em que o domínio SET constitui o local activo para a metilação das histonas H3K27 [1]. Estudos apoiar EZH2 como um jogador-chave no desenvolvimento e progressão de tumores devido à sua capacidade de alterar a expressão dos genes, incluindo aqueles envolvidos no controle do ciclo celular, migração celular e reparação do ADN [2]. EZH2 é crucial no controlo da cromatina de reprogramação genética de células estaminais cancro da auto-renovação e diferenciação que têm sido implicados na quimiorresistência [3] – [6]

como marcador de doença avançada e metastático em muitos sólido. tumores, a sobre-expressão EZH2 tem sido relatada em cancros pancreáticos, em especial aqueles que são pobremente diferenciadas [6], [7]. EZH2 verificou-se ser regulada positivamente pelo RAS oncogénicos por meio de sinalização MEK-ERK, levando à regulação negativa de supressores tumorais, tais como p27 e RUNX3 (KIP1) [6], [8], [9]. depleção EZH2 levou a paragem do ciclo celular na transição G1 /S, sugerindo que a proteína pode reprimir o gene supressor de tumor p27 [10]. Da mesma forma, knockdown de EZH2 resultou numa diminuição significativa na proliferação celular e capacidade invasiva [6], [7], [11] e as células cancerígenas pancreáticas sensibilizados à doxorrubicina e gemcitabina, revelando o potencial de uma terapia de combinação de inibidor-quimioterapêutico EZH2 [6] .

In vivo

, suprimindo EZH2 tumorigenicidade diminuída e inibiu a metástase do câncer de pâncreas [7]. Clinicamente, foram observadas correlações positivas entre a expressão de EZH2 e avançado estágio do câncer de pâncreas e grau em pacientes [11]. Em muitos casos, os níveis elevados de EZH2 no cancro também estavam significativamente associados com a diminuição da expressão de E-caderina e doença altamente agressivo. Nos doentes tratados com gemcitabina, significativamente maior sobrevida foi observada em pacientes com expressão EZH2 baixo, em vez de alta [12]. Consequentemente, EZH2 pode ser um valor de prognóstico para a sobrevivência global em doentes com cancro pancreático [13].

Recentemente, tem sido mostrado que um inibidor potente química de S-adenosil-hidrolase, 3-deazaneplanocin A (DZNep) , modula cromatina através da inibição indireta (ou seja, reduzir a disponibilidade do grupo metila) de metiltransferases histonas incluindo EZH2 [14], [15]. DZNep, um análogo carbociclico de adenosina, diminui os níveis celulares dos componentes PRC2 enquanto inibindo a Associated H3K27me3 [16]. Embora os mecanismos e efeitos de DZNep têm sido estudadas em vários tumores sólidos e leucemia [2], [3], [14], [15], [17] – [21], pouco se sabe sobre o potencial deste composto para tratamento do câncer pancreático. No entanto, o seu potencial de corrente para a redução dos níveis de EZH2, revertendo epitelial-mesenquimal-a transição (EMT), e prevenir a progressão do tumor, faz com que seja um agente anti-metastática altamente promissora [5]. O potencial terapêutico dos DZNep em combinação com outros agentes, tais como os polifenóis e os inibidores de histona-desacetilase, começou a emergir com resultados encorajadores [14], [15]. Desde evidência crescente sugere que terapias contra o câncer futuras vão aproveitar os efeitos sinérgicos obtidos a partir de diferentes combinações de reversão epigenética e agentes antitumorais convencionais [22], investigamos o potencial da combinação DZNep-gemcitabina para melhorar a atividade anticancerígena em câncer pancreático. Os resultados identificaram que histonas metilação reversão por DZNep presensitizes células do cancro do pâncreas gemcitabina. Otimização da combinação de drogas através de métodos de dosagem e de entrega foi ainda realizado.

Materiais e Métodos

Reagentes

radiomarcado (

3H) gemcitabina, adenosina, timidina, e guanosina foram obtidos de Moravek Biochemicals e Radiochemicals (Brea, CA), enquanto gemcitabina frio era de ChemieTek (Indianapolis, IN). A adenosina e guanosina foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Chung K. Chu (University of Georgia). Timidina, uridina, ribósido nitrobenzilo mercaptopurina (NBMPR), e 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Dimetilsulfóxido (DMSO) foi adquirido a partir de Macron Chemicals (Center Valley, PA), e o ácido (BCA) de reagente de ensaio de proteína do ácido bicinconínico era da Thermo Scientific Pierce (Rockford, IL). wares plástico para cultura de células foram obtidas a partir de Corning (Corning, NY).

Cultura de Células

As linhas celulares de cancro do pâncreas (ASPC-1, BxPC-3, Capan-1, MIA PaCa- 2, e células PANC-1) e MCF-10A foram recebidos a partir da American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA) de banco de células. Estas linhas celulares foram propagadas, expandidas e congeladas imediatamente após a chegada. As células revivido a partir do estoque congelados foram usados ​​dentro de 10-20 passagens, não superior a um período de 2-3 meses. A ATCC usa morfológica, citogenética e análise de perfis de ADN para a caracterização de linhas celulares. células pancreáticas humanas epitelial ductal (HPDE) [23] foram gentilmente recebido do Dr. Ming Tsao do Ontario Cancer Institute (Toronto, Canadá). A linha de células L3.6pl [24] foi gentilmente recebido do Dr. Isiah D. Fidler da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center (Houston, TX). As linhas celulares de HPDE e L3.6pl foram tratadas como outras linhas de células e foram genotipados por impressão digital de ADN (PowerPlex 16, Promega, Inc.) de acordo com as instruções do fabricante. A linha celular 293T foi gentilmente recebido do Dr. J. Michael Thomson, da Universidade da Geórgia (Athens, GA). Realizaram-se as condições de crescimento das linhas de células tal como descrito previamente [25].

Ensaio de Citotoxicidade de MTT

As células foram semeadas a uma densidade de 3 x 10

3 células /cavidade em uma 96 placa de microtitulação e -bem crescido a 90-95% de confluência. Após o tratamento, 50 ul de solução de MTT (5 mg /ml em PBS) foram adicionados a cada poço, e as placas foram incubadas durante 2 h. Cristais de formazano de MTT foram dissolvidos em 100 ul /poço de DMSO, agitando as placas numa plataforma oscilante. Um scanner de 96 poços foi usado para medir a absorvância espectrofotométrica a 490 nm. A absorvância a 650 nm foi utilizado para a subtracção de fundo. A concentração inibidora de 50% (IC

50) foi determinada utilizando o software GraphPad Prism 5.0.

Ensaio de Caspase 3

A apoptose foi medida utilizando o fluorimétrica caspase 3 Assay Kit da Sigma-Aldrich ( Cat. No. CASP3F) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 10

4 células /poço numa placa de 96 poços foram tratadas com DZNep e /ou gemcitabina durante 72 h. As células foram então lisadas e incubadas em gelo durante 15-20 min. Após a adição de tampão de ensaio contendo o substrato Ac-DEVD-AMC, as amostras foram transferidas para uma placa de 96 cavidades preta, e a fluorescência foi lida a cada 10 min durante 1 hora à temperatura ambiente (excitação 360 nm, emissão a 460 nm). O branco (mistura de reação) adequado, controle positivo (caspase 3) e controle negativo (caspase 3+ caspase 3 inibidor) também foram realizados.

.

estudos de interacção medicamentosa

as parcelas índice de combinação para DZNep e gemcitabina foram estimados utilizando o método desenvolvido por Chou e Talalay eo software CalcuSyn [26].

nucleosídeos Captação nas células e

Xenopus oócitos

foram realizadas Estes procedimentos como descrito anteriormente [27], [28].

geração de

Xenopus

Expressão de ovócitos Constrói

Os full-length clones de cDNA imagem do os transportadores (hENT1: clone ID 3.010.092, adesão BC008954; hENT2: clone ID 9.051.840, a adesão BC143335; hCNT1: ID clone 8.991.920, adesão BC 126204; hCNT3: clone ID 7.939.668, a adesão BC093823) foram obtidos a partir Abrir Biosystems (Huntsville, AL) . Subclonagem dos genes para a

vector de expressão de oócitos Xenopus

, varíola, foi concluído, utilizando os conjuntos de iniciadores designados na Tabela 1.

Western Blot

Western blot foi realizado como previamente descrito [25]. O anticorpo policlonal de coelho anti-histona H3K4TM, H3K9MM, H3K9DM, H3K27MM, H3K27DM, H4K20DM, e H4K20TM eram da Millipore (Billerica, MA), bem como o anticorpo anti-coelho policlonal de EED. Também obtida da Millipore foram os anticorpos H3K9TM, H3K27TM, e H4K20MM monoclonais de ratinho anti-histona, bem como o anticorpo monoclonal de ratinho anti-EZH2 (clone BD43) e anticorpos anti-SUZ12 (clone 3C1.2). Os anticorpos anti-anti-JMJD1A e JMJD2C policlonais de coelho foram adquiridos da Sigma-Aldrich. O anticorpo monoclonal de murganho anti-actina-β também foi adquirido a partir de Sigma-Alrich, e os anticorpos secundários conjugados com HRP foram de Bethyl Laboratories (Montgomery, TX).

Síntese de nucleósidos-mãe e Derivados

troxacitabina e o seu pró-fármaco lipofílico, tal como anteriormente descrito (2K composto [29]; 6H composto [30]; C

24H

41N

3O

5), foram obtidas do Dr. Chung K . Chu (University of Georgia). A síntese de um análogo de DZNep começou a partir de D-ribose. D-ribose foi tratada com 2,2-dimetoxipropano na presença de uma quantidade catalítica de

P

ácido toluenossulfónico para dar um derivado de isopropilideno, seguido por protecção do álcool primário com cloreto de trifenilmetilo. O lactol protegido foi então feito reagir com brometo de vinil-magnésio para se obter um único diastereomericdiol, que foi subsequentemente protegido com TBDMS-se apenas com a posição hidroxilo alílico para dar silyldienol. Para incorporar uma outra ligação dupla para a reacção de metátese de fecho de anel, o álcool secundário protegido foi oxidado a uma cetona, por oxidação de Swern, seguida por uma reacção de Wittig com brometo de metiltrifenilfosfónio e n-BuLi para se obter o dieno. O grupo silil do dieno foi removido com TBAF para dar um dienol menos estericamente exigente, o qual foi então convertido ciclopentenol com um catalisador de Grubbs de segunda geração com um bom rendimento. A fim de levar a cabo o acoplamento à Mitsunobu bis-Boc-3-desaza-adenina foi preparado. acoplamento de Mitsunobu, desde que o desejado isómero N-9 como um produto principal. A remoção dos grupos de proteção utilizando 2 N HCl em metanol produzido DZNep. Três grupos de álcool DZNep foram protegido com TBS que foi substituído para os dois pró-fármacos de amida (cadeias de carbono de C6 a C8) por acilação do N

6-NH

2 grupo. O composto foi finalmente totalmente desprotegido por TBAF para dar o pró-fármaco DZNep 1 (C

20H

29ClN

4O

4) e DZNep Pr�f�maco 2 (C

18H

24N

4O

4). Os procedimentos de síntese e caracterização físico-químicas dos compostos será publicada noutro local.

Nanopartículas Formulação

Todos os produtos químicos foram adquiridos a Sigma Aldrich e usados ​​sem purificação adicional a menos que indicado de outra maneira. PLGA-COOH com uma viscosidade intrínseca de 0,18 dL /g foi comprado de Lactel. O (5-carboxipentil) trifenilfosfónio (TPP) catiónica foi sintetizado de acordo com métodos descritos na literatura [31]. HO-PEG-OH com um PM de 3350 g /mol foi adquirido a partir de Sigma Aldrich. DSPE-PEG-COOH com um PM de 2000 g /mol foi adquirido de Avanti Polar Lipids. O álcool polivinílico (PVA) com um peso molecular médio de 10,000-26,000 foi comprado de Alfa Aesar. A água destilada foi purificado por passagem através de um sistema de purificação de água Milli-Q da Millipore Biocel (18,2 mohms) com um filtro de 0,22 um. análises por HPLC foram realizadas utilizando um instrumento Agilent series 1200. O tamanho e potencial zeta medições foram realizadas num instrumento Malvern Zetasizer Nanoseries. cromatografia de permeação em gel (GPC) foram recolhidos em um Shimadzu LC20-AD cromatógrafo Destaque líquido. Todos os espectros de RMN foram registados num Varian 400 MHz RMN. MET foram tiradas em um Tecnai 20 FEMININO microscópio. Ultra-som foi realizada em um processador líquido Misonix S-4000 Ultrasonic.

Síntese de PLGA-

b

-PEG-OH

Síntese de PLGA-PEG-

b

OH foi realizada como descrito anteriormente [32].

Síntese de PLGA-

b

PEG-TPP

Síntese de PLGA-PEG-

b

-TPP foi realizada como descrito anteriormente [32].

Síntese de gemcitabina Encapsulated nanopartículas (Gem-PLGA-

b

-PEG-OH-PN)

a gemcitabina (10 mg /mL em nanopura H

2O) foi emulsionado com PLGA-

b

-PEG-OH (5 mg em CH

2Cl

2) usando sonicação com sonda durante um minuto (Amplitude: 40% de 600 W de energia, de pulso: 1 segundo ligado, 1 seg desligado). A emulsão primária foi emulsionado de novo por adição da emulsão de água-em-óleo a 2 mL de água nanopura contendo 0,5% polyby 8 mL de água nanopura contendo 0,05% de PVA e sonicada usando as condições acima mencionadas. O solvente orgânico foi removido por lavagem três vezes, utilizando uma membrana de filtração Amicon com um de 100 kDa de corte. As NPs foram ressuspensas em água nanopura e armazenado a 4 ° C até uso posterior. espalhamento dinâmico de luz (DLS) medições foram realizadas para determinar o tamanho, índice de polidispersão (PDI), e o potencial zeta das NPs. NPs foram caracterizadas utilizando TEM a uma voltagem de aceleração de 200 kV. As amostras de MET foram preparadas por deposição de 8 uL de PN (5 mg /ml) sobre uma grelha de cobre revestida com carbono de 200 mesh. As amostras foram transferidas para longe após 15 min e grades foram negativamente coradas com estéril 2% (w /v) uranyl solução aquosa de acetato de 15 min.

Síntese de DZNep Encapsulated Nanopartículas (DZNep-PLGA-

b

-PEG-OH-PN)

DZNep (10 mg /mL em nanopura H

2O) foi emulsionado com PLGA-

b

-PEG-OH (5 mg em CH

2 Cl

2) usando ultra-sons durante um minuto (Amplitude de 40% dos 600 W de potência, de pulso: 1 segundo ligado, 1 seg desligado). A emulsão primária foi emulsionado de novo por adição da emulsão de água-em-óleo formado anteriormente a 2 ml de água nanopura contendo 0,5% de PVA e sonicada utilizando condições semelhantes. Finalmente, esta emulsão foi re-emulsionada utilizando 8 mL de água nanopura contendo 0,05% de PVA sob ultra-sons utilizando as mesmas condições que anteriormente. O solvente orgânico foi removido por lavagem três vezes, utilizando uma membrana de filtração Amicon com um de 100 kDa de corte. As NPs foram ressuspensas em água nanopura e armazenado a 4 ° C até uso posterior. medições DLS foram realizados para determinar o tamanho, índice de polidispersão (PDI), e o potencial zeta das NPs. NPs foram caracterizadas utilizando TEM como mencionado acima.

Síntese de gemcitabina e DZNep Encapsulated PN (Gem-DZNep-PLGA-

b

-PEG-OH-PN)

A gemcitabina e DZNep co-encapsulados PLGA-b-PEG-OH NPs foram seguindo o procedimento exacto mencionado acima, excepto o primeiro passo, onde DZNep (10 mg /mL em nanopura H

2O) e gemcitabina (10 mg /mL em nanopura H

2O) foi emulsionado com PLGA-PEG-OH (5 mg em CH

2Cl

2). O solvente orgânico foi removido por lavagem três vezes, utilizando uma membrana de filtração Amicon com um de 100 kDa de corte. As NPs foram ressuspensas em água nanopura e armazenado a 4 ° C até uso posterior. medições DLS foram realizados para determinar o tamanho, índice de polidispersão (PDI), e o potencial zeta das NPs. NPs foram caracterizadas utilizando TEM como mencionado acima.

Síntese de liberação controlada Gem-DZNep-PLGA-

b

PEG-TPP-NPs

A gemcitabina (10 mg /mL em nanopura H

2O) foi emulsionado com PLGA-

b

-PEG-TPP (5 mg em CH

2Cl

2) utilizando a sonda de ultra-sons durante um minuto (amplitude: 40% de 600 W de potência, de pulso: 1 segundo ligado, 1 seg desligado). A emulsão primária foi emulsionado de novo por adição da emulsão de água-em-óleo a 2 mL de água nanopura contendo 0,5% de PVA e sonicada utilizando condições semelhantes. Finalmente, esta emulsão foi emulsionada utilizando 8 mL de água nanopura contendo 0,05% de PVA e DZNep (10 mg /mL em nanopura H

2O) sob condições de sonicação usando, como mencionado acima. O solvente orgânico foi removido por lavagem três vezes, utilizando uma membrana de filtração Amicon com um de 100 kDa de corte. As NPs foram ressuspensas em água nanopura e armazenado a 4 ° C até uso posterior. medições DLS foram realizados para determinar o tamanho, índice de polidispersão (PDI), e o potencial zeta das NPs. NPs foram caracterizadas utilizando MET como mencionado acima.

Síntese da Controlled Release Gem-DZNep-DSPE-PEG-OH-NPs

gemcitabina (10 mg /mL em nanopura H

2O) foi emulsionada com PLGA-b-PEG-OH (5 mg em CH

2Cl

2) utilizando a sonda de ultra-sons durante um minuto (amplitude: 40% de 600 W de potência, do pulso: 1 segundo ligado, 1 seg desligado) . A emulsão primária foi emulsionado de novo por adição da emulsão de água-em-óleo a 2 mL de água nanopura contendo 0,5% de PVA e sonicada usando as condições acima mencionadas. Esta emulsão foi depois emulsionada utilizando 8 mL de água nanopura contendo 0,05% de PVA, 0,1% de DSPE-PEG-COOH, e DZNep (10 mg /mL em nanopura H

2O) sob ultra-sons utilizando as mesmas condições tal como referido acima. O solvente orgânico foi removido por lavagem três vezes, utilizando uma membrana de filtração Amicon com um de 100 kDa de corte. As NPs foram ressuspensas em água nanopura e armazenado a 4 ° C até uso posterior. medições DLS foram realizados para determinar o tamanho, índice de polidispersão (PDI), e o potencial zeta das NPs. NPs foram caracterizadas utilizando MET como mencionado acima.

A carga e eficiência de encapsulação de gemcitabina e DZNep no NPS

e gemcitabina DZNep carga e eficiência de encapsulação (EE) foram determinados por dissolução do núcleo polimérico em 0,1 M de NaOH e quantificar a quantidade de terapêutica nas NPs utilizando HPLC (fase móvel: acetonitrilo com 20% H

2O e 0,1% de ácido trifluoroacético, comprimento de onda utilizado:. 270 nm

Datas de estudos cinéticos de DZNep /NPs gemcitabina

NPs foram colocados em unidades de diálise slide-a-Lyzer® mini com um corte de PM de 10000 g /mol. As amostras foram dialisadas contra 1 x PBS (6,0 L) num agitador de temperatura constante a 37 ° . C e 35 rpm a vários pré-determinado pontos de tempo, as amostras foram removidas e o conteúdo /DZNep gemcitabina foi determinada através da dissolução do núcleo polimérico em NaOH 0,1 mMol e quantificação por análise de HPLC (fase móvel: acetonitrilo com 20% H

2O e ácido trifluoroacético a 0,1%, de comprimento de onda utilizado: 270 nm)

Análises estatísticas

para casos em que foram comparados apenas duas condições, o teste t de Student foi utilizado para identificar diferenças significativas.. Nos casos em que foram comparados três ou mais condições, ANOVA one-way foi conduzido seguido de teste de comparação múltipla de Tukey. Cada experiência foi repetida pelo menos três vezes. Salvo indicação em contrário,

p Art 0,05 e

p

. 0,01 em comparação com as condições de controle são representados por um e dois asteriscos, respectivamente

Resultados

DZNep seletivamente Aumenta gemcitabina citotoxicidade nas células pancreáticas cancerosas, mas não é normal

começamos estudando a citotoxicidade de DZNep em linhas de células pancreáticas normais e cancerosos. O tratamento com concentrações crescentes de DZNep (0,1 nM-100 uM) mostraram uma redução significativa na viabilidade celular em todas as seis linhas celulares de cancro pancreático testadas (isto é, BxPC-3, Capan-1, L3.6pl, AsPC-1, Mia PaCa- 2, PANC-1) (Fig. 1A). A citotoxicidade foi observado a partir de cerca de 0,5-1 uM DZNep, dependendo da linha celular, e aumentou gradualmente com concentrações mais elevadas. A citotoxicidade não começou até ~48 h de tratamento (dados não mostrados). uma redução máxima da viabilidade celular (redução de -50% com 10 pM DZNep durante 72 horas) foi observada em pobremente diferenciadas MIA PaCa-2, que é apenas marginalmente gemcitabina-sensíveis (Fig. 1A). Em células subconfluentes, o efeito de DZNep em MIA PaCa-2 foi quase semelhante à de gemcitabina (Fig. 1C). DZNep mostrou muito menor citotoxicidade in bem diferenciados, linhas de células do cancro do pâncreas sensível ao gemcitabina (isto é, BxPC-3, Capan-1, L3.6pl) quando comparado com gemcitabina (Fig. 1C). De nota, não foram observadas alterações significativas na proliferação e viabilidade celular do epitélio ductal pancreático humano normal (HDPE), as células (até 10 mM DZNep por 72 h), que são altamente gemcitabina-sensível, bem como duas outras linhas de células normais ( 293T (rim embrionário humano) e células MCF-10A (epitelial da mama humana)) (fig. 1A-B, S1). Estes resultados demonstram que DZNep transmite selectivamente, os efeitos citotóxicos para as células cancerígenas pancreáticas (mal diferenciadas), sem prejuízo significativo da proliferação em células epiteliais pancreáticas normais.

A. Todas as linhas de células cancerígenas, excluindo o HPDE normais são DZNep-responsivo e reduziu a viabilidade celular. B. DZNep e gemcitabina exibido efeitos antagonistas em HPDE. C. DZNep e gemcitabina exibidos efeitos aditivos ou sinérgicos em muitas das linhas de células pancreáticas cancerosas. Vinte e quatro horas depois de 3 × 10

3 células /cavidade foram semeadas numa placa de 96 poços, as células foram tratadas com quer DZNep, gemcitabina, ou uma combinação de ambos em uma proporção equimolar durante 72 h. A viabilidade celular foi medida utilizando um ensaio MTT. Citotóxico IC

50 valores são indicados. Significâncias entre gemcitabina e DZNep, bem como DZNep + gemcitabina e DZNep foram identificados utilizando-se ANOVA seguida do teste post-hoc de Tukey. índice de combinação (CI) parcelas (inserções) mostram as interações entre as duas drogas. CI 1, o antagonismo; CI = 1, aditividade; CI 1, o sinergismo. Os gráficos de barras para a direita indicam a actividade de caspase-3 em relação (RCA) de cada tratamento, conforme medido por intensidade de fluorescência. Os valores foram subtraídos-fundo e são apresentadas como vezes de mudança do controle. Significância entre um único fármaco, em função da combinação de fármacos foi identificado por meio de ANOVA de uma via seguido por análise post-hoc de Tukey. As células foram tratadas com 1 uM DZNep, 100 nM de gemcitabina, ou ambos.

Barras

, SD.

n

= 3. *

p Art 0,05, **

p

. 0,01

Encorajados pela capacidade potencial de DZNep para compensar refratariedade análogo de nucleósido em cancro do pâncreas, células que DZNep com gemcitabina e co-tratados em proporções equimolares e comparadas as viabilidades celulares com os resultados obtidos quando as células foram tratadas com quer DZNep ou gemcitabina sozinha. Curiosamente, o co-tratamento mostraram reduções significativamente superiores em viabilidades celulares da maioria das células cancerosas sensíveis e gemcitabina–insensitive do que quando os compostos foram utilizados como agentes isolados (Fig. 1C). citotoxicidade Por outro lado, o co-tratamento reduzida ( 2 vezes a concentração de 100 nM) em HPDE (Figura 1B.), sugerindo um papel citoprotector da DZNep apenas em células normais

estimativa do índice de combinação (. IC) parcelas [26] para identificar o tipo de interação entre DZNep e gemcitabina. Estas estimativas identificado um sinergético ou aditivo interacção entre DZNep e gemcitabina (100 nM-10 uM) em todas as linhas de células de cancro do pâncreas com a única excepção de AsPC-1, bem como uma interacção antagonista Stark em HPDE normal (Fig. 1C). Co-tratamento de DZNep (1 nM-10 uM) com diferentes concentrações de gemcitabina (1-100 nm) revelou que DZNep potencializa a citotoxicidade de uma forma dependente da dose de gemcitabina em marginalmente sensível gemcitabina-MIA PaCa-2, ao passo que tal potenciação ocorreu em uma forma largamente independente da dose de gemcitabina-em células Capan-1 é altamente sensível ao gemcitabina (Fig. S2). HPDE permaneceu citotóxica para gemcitabina, confirmando antagonismo entre os dois compostos (Fig. S2). Uma análise mais aprofundada interacção com diversas proporções de gemcitabina: DZNep (01:01, 01:04, 04:01, 01:10, 10:01) identificou uma resposta sinérgica e maximamente citotóxica em MIA PaCa-2, utilizando o rácio de 01:10 ( Fig. S3). Finalmente, a fim de compreender o mecanismo da redução da viabilidade celular, foi realizada a caspase-3 ensaios de apoptose com base. Estes resultados (Fig. 1C) identificou uma indução significativa de apoptose como um mecanismo importante que contribui para aumento induzido por DZNep em gemcitabina citotoxicidade (Fig. 1C).

nucleósidos Transportadores Facilitar a entrada celular de DZNep

Desde DZNep é um análogo de nucleósido hidrófilo com um log P de -1,38 [5], a hipótese de que a sua entrada em células dependeria da expressão de transportadores de nucleosídeos, e, por conseguinte, a falta de expressão portador suficiente iria limitar a sua actividade celular. Para testar isso, foi realizado um ensaio competitivo, avaliando o nível de inibição no transporte celular de nucleosídeos com DZNep. Nós escolhemos o PANC-1 e linhas de células MIA PaCa-2 para estes estudos porque eles têm sido relatados para expressar vários transportadores de nucleosídeos [33]. análise de transportes identificada uma significativa inibição da

3H-adenosina e

3H-guanosina (purinas) transporte, mas não

3H-timidina (pirimidina) (Fig. 2A). A gemcitabina transporte em ambos os tipos de células só foi inibida a uma concentração mais elevada (200 pM) (Fig. 2A). Estes dados sugerem que DZNep influxo celular é facilitada por purina, mas não pirimidina, os transportadores de nucleosídeos.

. DZNep dificultado a captação de purina radiomarcados em PANC-1 e MIA PaCa-2. Vinte e quatro horas depois de 5 × 10

4 células /poço foram semeadas numa placa de 24 poços, as células foram deixadas a absorção do nucleósido marcado radioactivamente indicada na presença de DZNep ou seu respectivo nucleósido não marcado. B. Inibição do transporte de adenosina no

Xenopus

oócitos com DZNep. C. A inibição farmacológica da hENT1 e excesso de uridina diminuiu a citotoxicidade de DZNep em MIA PaCa-2. Vinte e quatro horas depois de 3 × 10

3 células /cavidade foram semeadas numa placa de 96 poços, as células foram tratadas com concentrações crescentes de DZNep na presença de DMSO (controlo), 10 uM NBMPR, ou 200 ^ M de uridina. A viabilidade celular foi medida utilizando um ensaio MTT. IC

50 valores são indicados. diferenças significativas entre o controle e cada tratamento foram determinados utilizando o teste t de Student.

Barras

, SD.

n

= 3. *

p Art 0,05, **

p

. 0,01

Para caracterizar ainda mais a identidade de as purinas transportadores de nucleosídeos mediadoras DZNep afluxo, examinamos a capacidade de DZNep para inibir

transporte 3H-adenosina no

Xenopus

oócitos expressando transportadores individuais. Uma inibição significativa do hENT1- e hCNT3 mediada

foi observada transporte 3H-adenosina, enquanto que uma inibição significativa da hCNT2 mediada

transporte 3H-adenosina foi observado apenas com a concentração mais elevada (200 pM) (Fig. 2B ). Não foi observada redução significativa no transporte de adenosina por DZNep em oócitos expressando hENT2.

Em seguida, para estudar o impacto da hENT1 e hCNT3 na citotoxicidade DZNep mediada em células de câncer de pâncreas, examinamos a proliferação de MIA PaCa- 2 na presença de um inibidor de farmacológico hENT1 (10 nM NBMPR) ou excesso de uridina (200 ^ M), que inibe competitivamente a todos os ENTs e nanotubos de carbono. Os nossos resultados mostram que ambas as condições pode reduzir significativamente DZNep citotoxicidade de MIA PaCa-2, tal como avaliado por um aumento no citotóxico IC

50 estimativas (2-8 vezes) (Fig. 2C).

Acilo derivatização de DZNep aumenta sensibilização de células pancreáticas a gemcitabina

Desde DZNep pelo menos utiliza parcialmente transportadores para exercer o seu pleno potencial, é provável que os pacientes transporter deficiente pode respondem mal ao DZNep. Para contornar este problema, geramos derivados acilo polares de DZNep (Fig. 3A) usando um procedimento sintético descrito no

Materiais e Métodos

. Nós substituído DZNep no N

6-NH

2 de grupo com cadeias laterais de acilo para gerar dois pró-fármacos lipofílicos (pró-fármaco 1: C

20H

29ClN

4O

4; pró-fármaco 2 : C

18H

24N

4O

4). Os pró-fármacos sintetizados foram avaliados quanto às suas actividades anti-proliferativas, tanto sozinho e em combinação com gemcitabina, em uma, linha de células sensíveis a gemcitabina (Capan-1), e gemcitabina-resistente (MIA PaCa-2) normal (HPDE).