chinesa

Abstract

Como a proteína central das rupturas dos filamentos duplos (ORL) via de reparo de DNA induzida,

NBS1

participa detectar os LAP e desempenha um papel essencial na manutenção da estabilidade genômica. polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em

gene NBS1

eram comumente testado que associado à susceptibilidade a vários tipos de câncer, mas os resultados permanecem controversos. Assim, realizamos dois estudos de caso-controle de base hospitalar independentes que compreendem 1.072 pacientes com câncer colorretal e 1.263 controles para avaliar a associação entre quatro

NBS1

SNPs e risco de câncer colorretal. O resultado mostrou que rs2735383C /G polimorfismo na região 3 ‘não traduzida (UTR) do

NBS1

foi significativamente associada com o risco de câncer colorretal por meio de regressão logística (

P Art 10

-4). Além disso, observou-se que rs2735383CC genótipo foi associado com substancialmente maior risco de câncer colorretal (odds ratio = 1,55, 95% de intervalo de confiança = 1,27-1,94), em comparação com os genótipos rs2735383GC + GG. experiências funcionais adicionais demonstraram que o alelo rs2735383C no

NBS1

interrompido a afinidade de ligação tem-miR-509-5p ao

NBS1

3′-UTR em células de câncer colorretal, afetando o

NBS1

atividade transcricional e nível de expressão. Em conclusão, a evidência atual sugere que o polimorfismo rs2735383C /G pode contribuir para o risco de câncer colorretal

Citation:. Li J-T, Zhong B-Y, Xu H-H, Qiao S-Y, Wang G, Huang J, et al. (2015) As associações entre o

NBS1

polimorfismos e cancro colorectal na população chinesa. PLoS ONE 10 (7): e0132332. doi: 10.1371 /journal.pone.0132332

editor: Yifeng Zhou, Faculdade de Medicina da Universidade de Soochow, CHINA

Recebido: 05 de maio de 2015; Aceito: 14 de junho de 2015; Publicação: 17 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Dr. Hong-Chuan Zhao recebeu fundos do Programa de Pesquisa e Desenvolvimento de alta Tecnologia Nacional da China (Programa 863) (No. 2014AA020801), Science Programa de Cooperação Tecnologia da China (No.2013DFA31510) e do Fundo de Investigação de Beijing Science Tecnologia da Comissão (No. Z111107067311021); Dr. Hui-Zhen Fan foi apoiado pela National Science Foundation Natural da China (No. 81.360.606). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é uma das neoplasias mais comuns principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1]. Na última década, grandes esforços têm sido focados no desenvolvimento de novas modalidades de tratamento e tecnologias de diagnóstico, no entanto, a taxa de incidência e a mortalidade está aumentando significativamente numa população Asiática [2, 3]. Além dos fatores de risco ambientais e hábitos de vida [4, 5], alterações genéticas, incluindo polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em genes candidatos que estão envolvidas na via de reparo de DNA têm sido implicados na carcinogênese colorretal [6-9].

vias de reparação do ADN desempenham um papel fundamental na manutenção da integridade genómica e prevenção de células contra o cancro [10]. Em contraste, tornou-se aparente que as deficiências de reparação do ADN de cadeia dupla quebras (LAP) por carcinogéneos podem conduzir a instabilidade genómica e, consequentemente, se correlacionam com o desenvolvimento de cancro [11]. Duas vias de reparo de DNA inclui reparação de recombinação homóloga (HR) e vias não-homólogas-se juntar finais (NHEJ) envolvidos em células humanas levar a reparar danos através do recrutamento de moléculas de reparo de DNA específicas para o local da lesão [12-14]. O recrutamento de proteína nuclear telangiectasia quinase ataxia mutada (ATM) para DSB de ADN é considerada como o passo crítico de ambas as vias de activação e a sua função. No entanto, tem sido reconhecido que a ATM recrutamento para sítios de LAP necessários e foi facilitada por proteínas específicas parceiros de recombinação meiótica 11 homólogo (MRE11), homólogo humano RAD50 (RAD50) e síndrome de Nijmegen quebra 1 (NBS1) [15]. Como um jogador central do complexo de MRN, NBS1 interage diretamente com H2AX para formar focos nuclear em locais de danos no DNA e aciona os passos subsequentes na resposta precoce danos no DNA [15, 16]. Além disso,

NBS1

desempenha um papel essencial na montagem de complexos MRN e dirige MRN complexos coordenar LAP ao processamento e reparar [17, 18]. Portanto, variantes genéticas em

gene NBS1

pode modular a capacidade de reparo do DNA, e afetam a propensão para causar câncer. estudos de acumulação têm explorado as associações entre polimorfismos comuns no

NBS1 Comprar e cancros humanos arriscar [19-22]. Por exemplo, um dos polimorfismos mais comummente estudado rs1805794G /C foi investigado associados com a susceptibilidade a vários cancros [22-24]. Além disso, o rs2735383C SNPs /L na 3′-UTR de

NBS1

pode influenciar a capacidade de ligação de microARNs, assim, podem afectar a expressão do gene de [22, 23]. No entanto, pouca informação tem sido relatada nas associações entre estas

NBS1

polimorfismos e risco de CRC comuns na população chinesa. Portanto, temos a hipótese de que os polimorfismos comuns do

gene NBS1

pode associar-se com o risco de CRC.

Com base nestas hipóteses, realizamos dois estudos de caso-controle de base hospitalar para avaliar a possível influência de polimorfismos comuns (rs1805794G /C, 31129G /a, 924T /C e rs2735383C /G) sobre o risco de CRC na população chinesa.

Materiais e Métodos

Os sujeitos do estudo

Todos os indivíduos eram geneticamente não relacionados etnicamente homogêneos chineses han, e os participantes elegíveis foram 21-90 anos de idade no recrutamento durante o período do estudo. Para o conjunto de descoberta, de um total de 763 pacientes diagnosticados CRC e 892 controles de freqüência de correspondência aos casos com relação à idade (± 5 anos), sexo e área residencial foram consecutivamente recrutados Hospital Popular da Yichun City (Yichun, China) e China-Japan Friendship Hospital (Pequim, China). Para a validação, 313 pacientes com CCR e 371 controles de freqüência de correspondência aos casos com relação à idade (± 2 anos), sexo e área residencial foram selecionados consecutivamente a partir da Amizade Hospital China-Japão (Pequim, China). Entre os participantes elegíveis, as taxas de recrutamento foram cerca de 95% para os pacientes e cerca de 81% para controles. Todos os pacientes não tinham recebido qualquer quimioterapia ou radioterapia e não havia restrições idade, estágio, ou histologia. estadiamento do tumor e tipo patológico foram avaliados de acordo com a Comissão Mista de 2002 Americana sobre sistema de estadiamento do Câncer. A taxa de participação para os controles foi de 89%. As características clínicas de todos os pacientes e controles do conjunto de descoberta e conjunto de validação estão listados na Tabela 1. No recrutamento, cada participante foi agendada para uma entrevista com um questionário epidemiológico depois de dar um consentimento informado por escrito e fornecidas sobre amostra de sangue de 5ml para análise de DNA . O questionário epidemiológico incluiu dados demográficos, informações detalhadas de tabagismo e consumo de álcool, história familiar de câncer e assim por diante. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica do Hospital Popular de Yichun City e Comissão de Ética Médica da China-Japan Friendship Hospital da cidade de Pequim.

A genotipagem análise

Com base em a possibilidade de mudança funcional do

NBS1

SNPs no contexto do genoma, quatro

NBS1

SNPs (924T /C em 5′-UTR, rs1805794G /C no exão 5, 31129G /a no exão 10 e rs2735383C /G em 3′-UTR) relatado anteriormente em relação à evolução das doenças incluindo cancros foram selecionadas e analisadas [22, 25]. O ADN genómico foi isolado a partir de amostras de sangue periférico para cada participante no estudo usando o Kit de sangue genoma de ADN de Extracção (Takara; Dalian, China). Estes quatro

NBS1

SNPs foram genotipados por espectrometria de massa MALDI-TOF específico para o alelo (Sequenom, San Diego, CA) como descrito anteriormente [26, 27], sem o conhecimento do estado sujeitos. Além disso, para confirmar os resultados de genotipagem da análise por espectrometria de massa, foram selecionados aleatoriamente 100 amostras para seqüenciamento direto, e o resultado foi 100% concordantes.

Construção de plasmídeos repórter

Uma vez que uma associação significativa observou-se para o polimorfismo rs2735383C /L e o risco de CRC, dois plasmídeos repórter contendo rs2735383G ou alelo rs2735383C foram construídos de modo a avaliar o efeito desse polimorfismo na sua expressão do gene

in vitro

. O comprimento total de humano

NBS1

3′-UTR flanqueando polimorfismo rs2735383 SNP foi sintetizado pela Companhia Genewiz e, em seguida, foram clonados no vector de base psi-check2 (Fig 1A). As duas construções resultantes psi-CHECK2-

NBS1

-rs2735383C e psi-CHECK2-

NBS1

-rs2735383G foram todos re-sequenciados para confirmar a sequência e integridade das inserções de cada construção.

a actividade da luciferase do alelo variante rs2735383 em repórter de luciferase rolamento

NBS1

3′-UTR co-transfectadas com ou sem imita HSA-miR-509-5p ou inibidores de HSA-miR-509-5p em As células HCT-116 (A) e das células HT-29 (B). a actividade da luciferase de Renilla foi medida e normalizada para a luciferase de pirilampo. Seis repetições foram realizadas para cada grupo, e a experiência foi repetida pelo menos três vezes. Os dados são ± erro padrão da média da média; **

P Art 0,01. (C)

NBS1

nível de expressão de mRNA em amostras de tecidos tumorais de pacientes com câncer colorretal com diferentes variante rs2735383 alelos genótipo (11 rs2735383GG, 13 rs2735383GC e 5 rs2735383CC); dados são ± erro padrão da média da média, normalizados para

GAPDH

,

P

= 0,027. (D) a expressão do mRNA hsa-miR-509-5p em 29 tecidos de câncer colorretal agrupados por rs2735383 C /genótipos G. A expressão de mRNA hsa-miR-509-5p foi calculada em relação à expressão de

U6

mRNA. Os dados são ± erro padrão da média da média,

P

= 0,345.

transfecções transientes e ensaios de luciferase

Uma vez que o papel essencial de 3′-UTR em gene, que previu a rs2735383C /G polimorfismo no 3′-UTR pela nossa análise bioinformática (https://snpinfo.niehs.nih.gov/). O resultado revelou que a conversão de C a G do polimorfismo rs2735383 3′-UTR causar novo local de ligação de microARN HSA-miR-629, tem-miR-499-5p, e tem-miR-509-5p. Para o ensaio de transfecção transiente, as linhas celulares colorrectais humanos, ou seja, HCT116 e HT-29 foram semeadas a 1 x 10

5 células por poço em placas de 24 poços (BD Biosciences, Bedford, MA). Os ensaios de luciferase foram realizados como descrito anteriormente [28]. Para análise da atividade luciferase, 800ng psi-CHECK2-

NBS1

vetores 3′-UTR foram cotransfectadas com imita 40pmol microRNA (HSA-miR-629, hsa-miR-499-5p e hsa-miR-509 -5p) e com ou sem inibidores de 40pmol por Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Depois de transfecção durante 24 h, as células foram recolhidas e a actividade de luciferase Renilla foi medida com o Repórter Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI) (Promega). Três experimentos independentes foram feitas para cada construção de plasmídeo.

Quantitative PCR em Tempo Real (qRT-PCR)

29 tecidos de CRC com diferentes genótipos rs2735383 foram submetidos a investigar a correlação entre o

NBS1

níveis de mRNA e rs2735383C polimorfismo /G. O ARN total foi isolado utilizando o Reagente Trizol (Invitrogen Inc., EUA) e reverteu transcrito para ADNc, utilizando iniciadores oligo-dT. Realizou-se ABI Prism 7500 sistema de detecção de sequência para avaliar

NBS1

e

GAPDH

níveis de mRNA com base no método SYBR-Green. O último foi usado como um controle quantitativo interno e

NBS1

nível de expressão foi normalizada para

GAPDH

. O TaqMan MicroRNA Ensaios (Applied Biosystems) foi utilizado para detectar a expressão de HSA-miR-509-5p acordo com o protocolo dos fabricantes e universalmente expresso

RNA nuclear pequeno U6

foi usado para um controle interno.

Análise

estatística

as diferenças na distribuição das variáveis ​​demográficas selecionadas, bem como rs2735383C /alelo G e genótipos entre casos e controles de freqüência foram avaliadas pelos testes de qui-quadrado. O equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) das distribuições genotípicas controles sem câncer foi testado por um teste qui-quadrado do goodness-of-fit. A força da associação entre o polimorfismo rs2735383C /G eo risco de câncer CRC foi estimada pelo odds ratio (OR) com intervalo de confiança de 95% (IC) por meio de regressão logística não condicional e ajustados para idade e sexo. comparação do grupo foi analisada pelo teste t de Student (frente e verso). A análise estratificada, também foi realizada por subgrupos de idade, sexo ou outras características (tabagismo, status de beber álcool, IMC, estágio e história familiar) para avaliar as RUP variáveis ​​relacionadas com o estrato entre os

NBS1

genótipos. One-way ANOVA foram utilizados para avaliar as diferenças na actividade repórter luciferase e o efeito de rs2735383C /G no

expressão NBS1

entre os pacientes com CCR. O poder estatístico foi calculado usando o Software PS (https://biostat.mc.vanderbilt.edu/twiki/bin/view/Main/PowerSampleSize). Todos os testes foram dois lados usando o software SAS (versão 9.1; SAS Institute, Cary, NC). Estatisticamente significativo nível foi definido como

P

. 0,05

Resultados

Genótipos e CRC risco

No estudo, foram genotipados quatro polimorfismos comuns ( rs1805794G /C, 31129G /a, 924T /C e rs2735383C /G) de

gene NBS1

em 1076 pacientes CRC e 1263 controles saudáveis. As freqüências genotípicas destes polimorfismos nos controles eram consistentes com a HWE (

P Art 0,05 para todos). As distribuições de genótipos de

NBS1

polimorfismos dos casos e os controles na descoberta e validação de conjunto são apresentados na Tabela 2. Observou-se uma associação significativa com o risco de CRC para rs2735383C /G, mas não para outros polimorfismos em dois populações (

P Art 10

-4 de rs2735383C /G no conjunto de descoberta e

P

= 0,039 para rs2735383C /G no conjunto de validação). Como mostrado na Tabela 2, os indivíduos com genótipos rs2735383CC foram estatisticamente significativos maior risco do que as transportadoras com genótipos rs2735383GG + CG (OR ajustado = 1,52; IC95% = 1,20-1,99,

P Art 10

-4 para a descoberta definido e ajustado OR = 1,60; IC95% = 1,11-2,37,

P

= 0,025 para o conjunto de validação). Além disso, foi observada associação significativa entre polimorfismos rs2735383 e risco de CRC quando combinado das duas populações (

P Art 10

-4).

Nós realizadas ainda as análises de estratificação para avaliar os efeitos da rs2735383C /genótipos G sobre o risco de CRC de acordo com idade, sexo, tabagismo, consumo de álcool e história familiar de câncer no conjunto de descoberta. Como mostrado na Tabela 3, um aumento significativo do risco de CRC associado com o polimorfismo era mais pronunciado entre os subgrupos de consumidores. Comparado com o rs2735383GG e genótipos GC, CC genótipo apresentaram um risco 2,2 vezes superior de CRC em bebedores (OR = 1,70, 95% CI = 1,51-2,88,

P

= 0,004). No entanto, não houve diferença estatisticamente significativa entre as distribuições de outras variáveis ​​selecionadas e risco de CRC.

Efeito da

NBS1

rs2735383C /polimorfismo G sobre a atividade transcricional

Foram construídos vectores repórter da luciferase utilizando o vector psi-check2 quer com o rs2735383C ou rs2735383G alelo e transfectar transitoriamente HCT116 e células com HSA-miR-629, hsa-miR-499-5p e hsa-miR-509- 29 HT- 5p, respectivamente. Nós examinamos se o microRNA tem um efeito alelo-específico em

expressão NBS1

em células CRC. O resultado mostrou que as células de CRC co-transfectadas transientemente HSA-miR-509 imita e vectores que contêm o alelo rs2735383C diminuiu significativamente a actividade da luciferase, em comparação com vectores de células que contêm o alelo rs2735383G (

P

0,05 em células HCT116 e células HT-29; Fig 1B). No entanto, não houve diferença significativa entre este polimorfismo e atividade de transcrição com HSA-miR-629 e miR-HSA-499-5p em células CRC. Estes dados indicaram que rs2735383C /G pode afetar a transcrição da

NBS1

influenciando o sítio de ligação de microRNA para o

NBS1

3′-UTR.

Associação de rs2735383C /polimorfismo G com

NBS1

expressão de mRNA

Nós ainda examinado o

expressão NBS1

em 29 tecidos de CRC com rs2735383C diferente /G genótipos por qRT-PCR. Como mostrado na Figura 1C, descobrimos que os pacientes com o genótipo homozigoto rs2735383CC teve significativamente menor

NBS1

níveis de mRNA (média ± erro padrão: 0,161 ± 0,037) do que os pacientes com o GC (0,363 ± 0,047) ou GG ( 0,400 ± 0,050, teste ANOVA:

P

= 0,026) genótipos. Além disso, qRT-PCR foi ainda usado para examinar se HSA-miR-509-5p é constitutivamente expressa em amostras de tecido de CRC. Como mostrado na Fig 1D, HSA-miR-509-5p foi expresso constitutivamente em tecidos CRC; Considerando que não houve associação significativa entre a expressão fundo de hsa-miR-509-5p e

NBS1

rs2735383C /genótipos G em tecidos tumorais coletadas de pacientes de CRC (

P

= 0,345).

Discussão

CRC carcinogênese é multifatorial. Não só os factores de risco ambientais, mas também fatores genéticos podem desempenhar um papel essencial na etiologia da CRC. Neste estudo de caso-controle de base hospitalar, investigamos o papel de quatro

NBS1

SNPs comuns na susceptibilidade à CRC em populações chinesas. Descobrimos que hsa-miR-509-5p pode ligar-se firmemente a 3′-UTR de

NBS1

contendo o alelo rs2735383C, regulando negativamente o nível de

NBS1

. Além disso, nos seguintes análises estratificadas, parecia que um efeito de alto risco desse polimorfismo foi especialmente evidente entre os subgrupos de bebedores.

NBS1

é um regulador chave que participa na reparação de DSB, direcionando o complexo proteína MRN para os locais de danos no ADN e estimular a sua ligação de ADN e a actividade de nuclease. Os principais domínios funcionais de

NBS1

nas respostas de danos no ADN que compreendem o domínio conservado forkhead-associado (FHA) e o cancro da mama carboxi-terminal (BRCT) domínio, que são importantes no reconhecimento e reparação de ADN aberrante [ ,,,0],29-31]. Vários relatórios têm destacado o papel potencialmente crucial da

NBS1

, uma parte importante do complexo de MRN, na manutenção da estabilidade genômica e impedindo os processos tumorigênicos através do recrutamento de reparação e proteínas do checkpoint durante os intervalos de ADN [32, 33]. Assim, as mutações do

NBS1

pode afetar a função de

NBS1

e interação proteína-proteína, e mais provavelmente, aumentar a susceptibilidade de câncer. Como um dos polimorfismos mais comumente investigados, rs1805794G /C localiza-se no domínio BRCT e influenciar a formação de um complexo de vigilância genoma associado a BRCA1 (BASC), embora a ligação a BRCA1, que é responsável para a detecção e reparação de estruturas de ADN aberrantes [ ,,,0],29]. Várias linhas de estudos investigaram a associação entre o polimorfismo e vários tipos de câncer [22, 34-37]. No entanto, a associação entre genótipos variantes

NBS1

rs1805794G /C e risco de câncer não é de acordo em diferentes tipos de câncer e grupo étnico. Para um exemplo, P. Widlak descobriu que genótipos variantes rs1805794 não foram associados com a susceptibilidade da CRC em uma população polaca [37]. Da mesma forma, nossos resultados atuais são de acordo com o estudo acima referido que o polimorfismo rs1805794G /C não está associado com o risco de CRC na população chinesa.

Para o nosso conhecimento,

NBS1

31129G /A e 924T /C incluídos em nosso estudo têm sido raramente investigados em tumores humanos [22, 25]. E nós não observamos a relação entre esses dois SNPs e risco de CRC. Quanto rs2735383C polimorfismo /G, que está localizado em 3′-UTR de

gene NBS1

. Vários estudos têm investigado a rs2735383C /G polimorfismo com susceptibilidade ao câncer. Uma meta-análise baseada em treze estudos elegíveis, incluindo 7561 casos e 8432 indivíduos controle investigado que nenhuma associação significativa foi encontrada entre os polimorfismos em

NBS1

gene e câncer de bexiga [38, 39], o cancro da mama [40], malignidades linfóides [41]. Recentemente, tem sido postulado que o polimorfismo rs2735383C acima mencionado /L poderia contribuir para o desenvolvimento do risco de cancro do pulmão. Mais interessante, um outro estudo chinês entre os 575 casos de câncer de pulmão e 575 controles relatou que o polimorfismo /G rs2735383C não foi associada com a susceptibilidade de câncer de pulmão [42]. Em nosso estudo, rs2735383C polimorfismo /G foi significativamente associada com o risco de CRC. Outras análises de estratificação mostrou que o risco aumentado associado com o alelo variante foi mais pronunciada no estado de beber. Uma análise mais aprofundada funcional mostrou que as substituições de nucleotídeos de G para C causar novo local de ligação de microRNA hsa-miR-509-5p, influenciando assim a atividade transcricional do

NBS1

em

vitro

, que é consistente com os achados anteriores [24]. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a expressão dynormal de

NBS1

resultante das variantes genéticas em

NBS1

, conseqüentemente, afetar a proteína NBS1 e outras proteínas reparados interagir em processos de reparação do ADN, portanto, podem modular a CRC susceptibilidade.

Este é o primeiro estudo que nós exaustivamente investigadas as associações entre

NBS1

SNPs e o risco de CRC. Tivemos um tamanho de amostra bastante grande para o estudo de caso-controle. Além disso, o fato de que as freqüências genotípicas entre controles caber a lei desequilíbrio de Hardy-Weinberg sugeriu a aleatoriedade da seleção assunto. E obtivemos um poder de 91% do estudo (teste bilateral, α = 0,05) para detectar uma OR de 1,52 para os genótipos rs2735383CC (que ocorreu com uma frequência de 16,14% nos controles), em comparação com os genótipos rs2735383GC + GG em o conjunto de descoberta, que pode ter aumentado o notável de nossa descoberta.

em conclusão, nosso estudo sugere que o polimorfismo rs2735383C /G no

gene NBS1

pode ser um fator de susceptibilidade genética para o risco do CRC na população chinesa. Além disso, os nossos resultados exigiria maiores estudos caso-controle e bem desenhados estudos sobre os mecanismos para verificar.