Abstract
Este estudo é investigar a relação entre ectonucleoside trifosfato difosfohidrolase 5 (ENTPD5) Expressão e câncer de pulmão fatores clínico-patológicos, eo impacto da ENTPD5 sobre as funções celulares de cancro do pulmão. espécimes de cancro do pulmão e correspondentes tecidos normais adjacentes foram obtidos a partir de pacientes sem qualquer pré-operatório radioterapia ou quimioterapia. Knockdown de expressão ETNPD5 levou à redução significativa taxa de pulmão de células de câncer de crescimento, aumentou acentuadamente a apoptose e a capacidade de reparar e invasão significativamente reduzido. Testes mostraram que gene chip knockdown de expressão ENTPD5 causada expressão mais caspase. reacção em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real mostraram que a expressão da caspase 3 foi significativamente aumentada após o knockdown de ENTPD5. Adicionalmente, imuno-histoquímica mostrou que o marcador de crescimento do tumor, antigénio nuclear de células em proliferação, foi significativamente reduzida no modelo knockdown. Ensaio de tumorigenicidade e dUTP mediada por Ensaio de Transferase rotulagem nick-fim de desoxinucleotidilo terminal de mostraram que a apoptose de células de cancro do pulmão foi aumentada no modelo de knockdown. Nossos resultados sugerem que ENTPD5 afeta apoptose câncer de pulmão através de Caspase 3 caminho, e pode ser potencialmente usada para monitorar o prognóstico ou para orientar regimes terapêuticos apropriados
Citation:. Xue Y, Wu L, Liu Y, Ma Y, Zhang G, X Ma, et al. (2015) ENTPD5 induz a apoptose em células de câncer de pulmão através de Regulação Caspase 3 Expressão. PLoS ONE 10 (3): e0120046. doi: 10.1371 /journal.pone.0120046
Editor do Academic: Yi-Hsien Hsieh, do Instituto de Bioquímica e Biotecnologia, TAIWAN
Recebido: 23 de outubro de 2014; Aceito: 03 de fevereiro de 2015; Publicação: 20 de março de 2015
Direitos de autor: © 2015 Xue et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel
Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Plano de Pequim Ciência New Star (No. Z11111005450000) e National Natural Science Foundation da China (No. 81.101.598)
Conflito de interesses.: os autores declararam que não existem interesses conflitantes.
Introdução
o cancro do pulmão, um dos tumores malignos mais comuns, é a principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [1]. cancro do pulmão de não-pequenas células (NSCLC), aproximadamente, responsável por 80% dos casos de câncer de pulmão [2]. O cancro do pulmão é considerada como um tipo de doença genética em que a expressão do gene aberrante patogénico endógeno contribui para a instabilidade genómica que aumenta a motilidade e invasividade de células cancerosas, que conduz às características de capacidade de invasão. Apesar de o sucesso do tratamento da neoplasia primária, recidiva e posterior metástases à distância ainda ocorrem em mais de um quarto dos pacientes no pós-operatório [3]. Portanto, acompanhamento pós-operatório deve ser realizado rotineiramente para procurar metástase cedo para reduzir a mortalidade. De acordo com estudos recentes, a sobre-expressão de genes específicos durante a carcinogénese foi detectado em vários cancros do pulmão, tais como o receptor do factor de crescimento epidérmico [4-6], crescimento epidérmico humano-2 receptor de [7], p53 [8] e de células B fator linfoma-2 [9]. A inibição de apoptose das células tumorais geralmente envolve muitos genes importantes, que podem ser funcionalmente ligadas a progressão de células cancerosas ilimitada, tais como a proliferação, migração e invasão. Eventualmente, as células cancerosas podem metástase para órgãos distantes e ameaçar a vida útil. Genes e proteínas que regulam a agressividade do tumor pode servir como marcadores prognósticos e /ou alvos terapêuticos de câncer de pulmão. Por conseguinte, é necessário desenvolver altamente sensíveis e específicos de diagnóstico genes /biomarcadores para promover a precisão no diagnóstico precoce de metástases. Até agora, vários genes foram relatados para participar em vários processos patológicos e influenciar de forma significativa a agressividade de células cancerosas, tais como LFA [10], 8 peptidase gene relacionado calicreína-[11], e RAS [12].
Ectonucleoside trifosfato difosfohidrolase 5 (ENTPD5) é um tipo de enzima no retículo endoplasmático que hidrolisa UDP para UMP para promover a proteína N-glicosilação e dobragem no retículo endoplasmático. ENTPD5 proteína é distinto de outros NTPDases, uma vez que é o único membro do que é descrito como uma proteína do proto-onco [13]. ENTPD5 é relatado para promoverem a proliferação celular e efeito Warburg [13]. As provas existentes ENTPD5 confirma que participa em vários processos celulares funcionais e promove a capacidade de invasão de células de cancro da próstata com a ajuda de proteína quinase Cδ [14]. Além disso, identificou-se que a resistência aos medicamentos de cancro da próstata durante a quimioterapia à base de platina é relativa ao estado estável de proteína quinase Cδ-mediada de linfoma de células B-2 [15]. Estudos anteriores também realçam a importância de ENTPD5 que está associado com a formação e progressão do tumor canceroso de linhas celulares de cancro da próstata. Estes resultados demonstram que a infra-regulação da expressão ENTPD5 influencia negativamente a capacidade de células tumorais para sobreviver em condições adversas.
Há uma série de relatórios sobre a relação entre ENTPD5 e crescimento do tumor maligno, mas não há quase nenhuma informar sobre a correlação entre ENTPD5 e câncer de pulmão. Recentemente, Curry et al. relatou que a supressão da ENTPD5 em modelo animal nula PTEN é suficiente para diminuir os níveis do receptor de fator de crescimento 1 semelhante à insulina e sensibilizar células tumorais bronquiolares ao soro inanição
in vitro
e restrição dietética
in vivo
[16]. Este estudo confirma que ENTPD5 pode estar relacionada com a ocorrência de câncer de pulmão em experiências com animais.
Considerando a deficiência de pesquisa ENTPD5 no cancro do pulmão e o importante papel da ENTPD 5 no processo de desenvolvimento do tumor, nós projetamos este estudo para entender o papel de ENTPD5 detalhada no crescimento de células do cancro do pulmão e do processo de invasão. Além disso, gostaríamos de determinar se ENTPD5 é um alvo promissor na terapia para o câncer de pulmão.
Materiais e métodos
Células
Todas as linhas de células de câncer de pulmão, incluindo A549, PC9, H1650, H1975, H1299 Skmes-1, e GLC82, foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA) e cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Gibco, EUA ), 100 U /ml de penicilina, e lg /ml de estreptomicina (Invitrogen, Grand Island, Nova Iorque, EUA) numa atmosfera humidificada de 5% de CO
2 e 37 ° C.
As sequências de ENTPD5 siRNA e silenciamento não-siRNA de controlo foram 5′-CCUGGGAUUUGGAUUGAAATT -3 ‘e 5′-UUUCAAUCCAAAUCCCAGGTT -3’, respectivamente. Os ARNsi foram gerados por Genepharma (Xangai, China). Os ARNsi foram transfectados em células A549 e células PC9 utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) seguindo o protocolo do fabricante.
Pacientes
espécimes cancro do pulmão (n = 131) e combinados tecidos normais adjacentes foram obtidas de pacientes sem qualquer radioterapia pré-operatória ou quimioterapia no Hospital do Câncer Pequim de 1999 a 2011. consentimento escrito e informado Antes foram obtidos de todos os pacientes e ou seus familiares. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Pequim o. características clínico-patológicas dos tumores foram definidos de acordo com o sistema de metástase encenação nó tumor da União de Controle do Câncer International. fatores clínico-patológicos são apresentados na Tabela 1.
Imunohistoquímica
amostras de câncer pulmonares primários foram fixadas e incluídas em parafina. Secções (5 uM) foram rotineiramente processadas e coradas com um anti-ENTPD5 anticorpo monoclonal de coelho (Sigma-Aldrich, Poole, Dorset, Reino Unido) a uma concentração de 2 ug /ml, seguindo-se a incubação com anti-coelho de peroxidase de rábano conjugada -rabbit anticorpo secundário (Sigma-Aldrich, Poole, Dorset, Reino Unido). áreas de coloração positivos na secção de tecido inteiro foram graduadas pela percentagem de células marcadas positivamente: 0, para 25%; 1, para 25-49%; 2, para 50-74%; e 3, para a 75-100%. Neste estudo, 0 foi considerado negativo ou coloração moderada, enquanto 1, 2 e 3 foram considerados coloração positiva.
quantitativo em tempo real da reacção em cadeia da polimerase (qRT-PCR)
O ARN total foi extraiu-se utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) seguindo o protocolo do fabricante. Para madura quantificação miARN, uma cauda poliA foi adicionado ao ARN total (100 ng) por poliA polimerase (New England Biolabs, Beverly, MA, EUA), seguido por transcrição inversa com os iniciadores de adaptador de oligo-dT e Moloney vírus da leucemia murina (Invitrogen, EUA). Os cDNAs foram sintetizados utilizando 2 ug de ARN total utilizando o kit de síntese de ADNc iScript (Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK). Os iniciadores para GAPDH ENTPD5 e estão listadas na Tabela 2. GAPDH foi usada como controlo de carregamento. qRT-PCR foi realizada utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Toyobo, Osaka, Japão) em claro Cycler 480 Real-Time PCR System (Roche, EUA). A quantidade relativa de miARNs ou genes foi normalizado para GAPDH. Os dados foram calculados com base em 2
-ΔCt onde ΔCt = Ct (Target) -Ct (Referência). Dobre a mudança foi calculada usando a
-ΔΔCt o método 2.
Western blot
As proteínas foram extraídas de células usando tampão RIPA contendo cocktail completa inibidor de protease (Roche, Mannheim, Alemanha ). As proteínas foram separadas usando electroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio e transferida para membranas de fluoreto de polivinilideno. As membranas foram então bloqueadas com 5% de leite desnatado seco em TBST (15 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,9% de NaCl, e 0,05% de Tween-20, pH 7,4) seguido por análise de transferência, utilizando anticorpos especificados: anticorpo monoclonal de coelho anti-humano anticorpo ENTPD5 (Sigma-Aldrich, Poole, Dorset, Reino Unido), e o anticorpo secundário anti-coelho de coelho (1: 1000). bandas imunorreactivas foram detectadas utilizando SuperSignal Oeste Femto Substrato quimioluminescente. As experiências foram realizadas pelo menos duas vezes com resultados consistentes.
proliferação celular ensaio
A proliferação celular foi determinada utilizando um ensaio de contagem de células kit-8. As células (2 x 10
3) foram cultivadas em placas de cultura de 96 poços. As células foram ressuspensas em meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS, e divididos em grupos antes de serem cultivadas durante 0, 24, ou 48 h. O número de células viáveis foi determinado medindo a absorvância a 450 nm utilizando Fluostar Optima (BMG LAB-TECH, Offenburg, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Cada experimento foi realizado em triplicado
A citometria de fluxo
As células foram colhidas e analisadas para a apoptose utilizando anexina V-FITC kit de detecção de apoptose PI (Imgenex, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram analisadas no FACSCalibur Analyzer (Becton-Dickinson, EUA) utilizando o software CellQuest Pro.
Transwell ensaio de invasão
Transwell ensaio de invasão foi realizada de acordo com as orientações do fabricante. Resumidamente, 5 x 10
4 células cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 0,1% de FBS foram plaqueadas em placas de 24 poços contendo meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS como quimioatractor. Após 24 h, as células que migraram através e aderidas ao outro lado do inserto foram fixadas e coradas com 0,5% (w /v) de violeta de cristal. Invadir as células na parte inferior dos filtros foram visualizados utilizando microscopia de fluorescência. Cinco campos de alta potência foram contadas por filtro de marcar para a invasão. O número de células foi quantificada utilizando o software ImageJ.
cicatrização de feridas ensaio
As células foram cultivadas até à confluência em placas de 6 poços antes de coçar com uma ponta de pipeta de 200 mL. Os detritos foram removidos por lavagem extensiva com uma solução salina tamponada com fosfato (PBS) e as células foram ainda incubadas durante mais 24 h ou 48 h após a lesão.
cDNA microarray análise
O RNA total foi extraído usando método de TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA), purificado com o mini kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, EUA), processados utilizando um GeneChip Expressão 3′-Amplification kit de Reagentes (Affymetrix, EUA), e interrogados com um Affymetrix Human Gene PrimeView expressão matriz. O ARN foi adicionalmente purificado utilizando o kit RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA, EUA) de acordo com as introduções Affymetrix. Para a análise de matriz de expressão, o ARN total (250 ng) foi utilizado para gerar ARNc marcado com biotina utilizando GeneChip Expressão 3′-amplificação reagentes do kit (Affymetrix, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. O cRNA foi hibridizada para Affymetrix PrimeView Human Gene Expression matriz e digitalizados usando uma matriz Scanner Affymetrix GeneChip 3000 7G.
tumorigenicidade ensaio
Seis semanas de idade do sexo feminino Balb /c atímicos camundongos nus (Vitalriver Animais de laboratório, Pequim, China) foram injectados por via subcutânea no flanco direito com 2,0 × 10
6 células em 0,1 ml de PBS. Uma vez que os tumores foram formados, medições de calibre foram realizadas diariamente e o volume do tumor (V) foi calculado usando a fórmula V = (L x W
2) /2, em que L o comprimento era e W era a largura do tumor. Quando os tumores atingiram um volume médio de 30-69 mm
3, os ratos foram divididos aleatoriamente em três grupos (n = 6) para a injecção intratumoral diária de ENTPD5 siRNA controlo negativo e, durante 16 dias. Para cada injeção, 15 mg miRNA foram misturados com 15 mL
in vivo
reagente de transfecção (Entranster-in vivo, Engreen, China). As curvas de crescimento foram representadas graficamente utilizando o volume médio do tumor em cada grupo experimental em vários pontos de tempo. Os volumes de tumor dos ratinhos foram registadas durante 16 dias, após o que os ratinhos foram sacrificados. Os tumores dissecados foram recolhidas e preparadas para análises subsequentes. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo centro do animal do Hospital do Câncer Pequim.
desoxinucleotidil Terminal mediada-transferase dUTP rotulagem nick-end (TUNEL) ensaio
desoxinucleotidil Terminal mediada-transferase dUTP nick-end rotulagem (TUNEL) estojo de ensaio (em situ celular Morte kit de detecção, Beyotime Instituto de Biotecnologia, China) foi usada para avaliar o número de células apoptóticas. As secções congeladas foram fixadas em paraformaldeído a 4% em PBS pH 7,4 durante 1 h à temperatura ambiente e permeabilizadas em PBS com 1,0% de Triton X-100 durante 2 minutos. As extremidades de DNA quebrados de células mortas foram rotulados com kit TUNEL seguindo o protocolo do fabricante.
A análise estatística
A análise estatística foi realizada através do SPSS versão 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA ). Teste de Mann-Whitney foi utilizado para a análise de variáveis contínuas. O teste do qui-quadrado, foi utilizado o teste exato de Fisher ou one-way ANOVA para a análise de variáveis categóricas. P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
pontuações ENTPD5 estão correlacionados com os sexos, história de fumo e estágios tumorais, com a expressão negativa de ENTPD5 levando a tempo de sobrevivência mais
Para detectar a expressão ENTPD5 em tecidos de cancro do pulmão, cancro do pulmão células foram coradas para análise imuno-histoquímica. As células cancerosas mostrou forte e difundir coloração citoplasmática de ENTPD5 (Fig. 1A-D). Pontuações mais altas de ENTPD5 (1-3) em NSCLC foram encontrados em 32 casos (24,4%). Entre todos os parâmetros disponíveis, estágios sexo, história de fumo e tumorais mostrou correlação significativa com pontuações ENTPD5 (P 0,05) (Tabela 1). A análise univariada do impacto do status de expressão ENTPD5 no prognóstico mostrou que o tempo de sobrevivência mais longo foi significativamente correlacionada com a expressão negativa de ENTPD5 (tempo médio de sobrevida, 81 meses versus 45,6 meses, P 0,001). curva de sobrevivência de Kaplan-Meier, com base na pontuação expressão ENTPD5, mostrou que o tempo de sobrevivência cumulativa para pacientes com expressão ENTPD5 negativo (pontuação = 0, n = 96) foi significativamente maior do que para os pacientes com altos níveis de ENTPD5 (pontuação = 1- 3, n = 31) (Fig. 1E). Estes dados sugerem que as pontuações ENTPD5 estão correlacionados com os sexos, história de fumo e estágios tumorais, com a expressão negativa de ENTPD5 levando a tempo de sobrevivência mais longa.
coloração ENTPD5 de tecidos de câncer de pulmão com (A) marcar 0, (B ) pontuação 1+, (C score) 2+, e (D score) 3+. análise (E) de Kaplan-Meier da correlação entre a sobrevivência global dos doentes com cancro do pulmão e o status de proteína ENTPD5 expressão (P 0,001).
A inibição da expressão ENTPD5 reduz o crescimento de células de câncer de pulmão e aumenta a sua taxa de apoptose
in vitro
Para testar o efeito de ENTPD5 sobre o crescimento de células de câncer de pulmão e apoptose
in vitro
, construímos com sucesso os modelos de células de transfecção transientes. Avaliação dos níveis de expressão ENTPD5 em diferentes linhas de cancro do pulmão, incluindo H1975, H1650, H1299, A549, GLC82, PC9 e SKMES1, mostrou que SKMES-1 teve a mais alta expressão ENTPD5 relativo (Fig. 2A). Além disso, o knockdown de ENTPD5 induzida diminuíram significativamente os níveis de expressão em ENTPD5 PC9 A549 e células (Fig. 2B e C). Além disso, o ensaio de crescimento celular em células A549 e PC9 com expressão moderada de ENTPD5 mostrou que knockdown de ENTPD5 reduziu significativamente o crescimento de células cancerosas de pulmão (Figura 2D e E.) (P 0,001). análise de apoptose em células PC9 e A549 demonstrou que knockdown de ENTPD5 aumento da taxa de apoptose de células em comparação com grupos de controlo (P 0,05) (Fig 2F.). Estes dados indicam que a inibição da expressão ENTPD5 reduz o crescimento de células de câncer de pulmão e aumentou a sua taxa de apoptose
in vitro
.
(A) A expressão de ENTPD5 em diferentes linhas celulares de cancro do pulmão. expressão em células ENTPD5 Relativa (B) PC9 e (C) A549 determinado por qRT-PCR e transferência de Western. capacidade de crescimento (D) e as células A549 PC9 (e) após o knockdown do gene ENTPD5 determinado pelo ensaio de crescimento. (F) A apoptose de células A549 PC9 e após o knockdown do gene ENTPD5 determinada por citometria de fluxo. Os dados são médias ± DP. asteriscos duplos indicam valores que são significativamente diferentes uns dos outros.
Down-regulação da expressão ENTPD5 diminui a capacidade de invasão e motilidade do cancro do pulmão de células
in vitro
Para investigar o efeito da ENTPD5 na invasão de células do cancro do pulmão e motilidade
in vitro
, transpoço ensaio de invasão e acabou ensaio de cura foram realizadas. Transwell ensaio de invasão mostrou que a regulação negativa da expressão ENTPD5 inibiu significativamente a capacidade de invasão de células A549 e PC9 (P = 0.000142 e P = 0,00158, respectivamente) (Fig. 3A). Wound healing ensaio demonstraram que a expressão regulada de ENTPD5 diminuiu dramaticamente a mobilidade das células PC9 e A549 de 24 h ao fim das experiências em comparação com células de controlo (Fig. 3B e C). Estes dados sugerem que a infra-regulação da expressão ENTPD5 diminui a capacidade de invasão e motilidade do cancro do pulmão de células
in vitro
.
ENTPD5-KD ou KD indica o knockdown das linhas de células de câncer de pulmão. Os dados são médias ± DP. asteriscos duplos indicam valores que são significativamente diferentes umas das outras (P 0,05). (B) A cicatrização de células PC9 e A549 após o knockdown do gene ENTPD5 em comparação com o tipo selvagem (WT) e modelos de controlo normal (NC), a 0, 24 ou 48 h. Durante a invasão e acabou experiências de cura, caspase 3 foi adicionada para inibir a apoptose celular.
Caspase 3 pode desempenhar um papel importante na apoptose de células de cancro do pulmão após o knockdown de ENTPD5
para entender os mecanismos de ação das proteínas relacionadas à apoptose de células do cancro do pulmão após o knockdown de ENTPD5, foi realizada a análise de chip gene em células PC9 e A549, que foi focada principalmente nos testes de via de apoptose celular. Para as células PC9, knockdown de ENTPD5 aumentou a expressão de alguns genes em mais de 1,5 vezes, em comparação com o controlo, incluindo CASP4, APAF1, BCL2L11, CASP7, e BCL2A1. Para as células A549, knockdown de ENTPD5 aumentou a expressão de alguns genes em, pelo menos, duas vezes, em comparação com o controlo, incluindo CASP7, MDM2, e BIRC3 (Fig. 4A). De nota, Caspase 7 (CASP7), um membro da caspase 3 subgrupo, mostraram um aumento da expressão significativamente após ENTPD5 knockdown em ambas as linhas celulares PC9 e A549 (Fig. 4A). Estes dados sugerem que a caspase 3 pode desempenhar um papel importante na apoptose de células de cancro do pulmão após o knockdown de ENTPD5.
(a) Ensaio de gene chip que mostra a análise via que foi associada com apoptose. a sobre-expressão do gene de caspase foi observada em células A549 depois de PC9 e o knockdown de ENTPD5. (B) Ensaio de qRT-PCR que mostra a expressão da caspase 3 em células A549 depois de PC9 e o knockdown de ENTPD5. Os dados são médias ± DP. Os asteriscos indicam valores significativamente diferentes do grupo NC (P 0,05). (C) A apoptose de células PC9 e A549 após o knockdown de ENTPD5 na presença de inibidor de caspase 3.
caspase 3 inibidor impede o aumento da taxa de apoptose de células de cancro do pulmão induzidas por o knockdown de ENTPD5
Para confirmar a importância da caspase 3 em apoptose de células do cancro do pulmão após o knockdown de ENTPD5, qRT-PCR e citometria de fluxo foram realizadas. Os resultados de qRT-PCR mostrou que a expressão relativa de ARNm de caspase 3 foi significativamente aumentada por o knockdown de ENTPD5 em ambos os PC9 A549 e células (Fig. 4B). Além disso, a citometria de fluxo mostrou que ENTPD5 knockdown não conseguiu induzir aumento significativo da taxa de apoptose em células A549 PC9 e na presença de inibidor Casepase 3 (Fig. 4C). Estes dados indicam que a caspase 3 inibidor impede o aumento da taxa de apoptose de células de cancro do pulmão induzidas por o knockdown de ENTPD5.
knockdown de ENTPD5 inibe o crescimento e promove a apoptose de células de cancro do pulmão
in vivo
Para validar o efeito da ENTPD5 em modelos animais, ensaio de tumorigenicidade, ensaio Western blot, imuno-histoquímica e ensaio de TUNEL. estado de crescimento do tumor em ratinhos injectados com células A549 mostrou que o grupo ENTP5-KD de ratinhos tinham menores tamanhos de tumores, taxa mais lenta de crescimento do volume do tumor, e menor peso final do tumor do que os grupos de WT e NC (Fig. 5A-C). A análise Western blot de tecidos tumorais mostraram que a expressão da proteína de antígeno nuclear de proliferação celular e ENTPD5 foi diminuída, mas a de caspase 3 foi aumentada no grupo ENTPD5-KD de ratos em comparação com grupos de controlo (Fig. 5D).
(B) variação do volume tumoral em diferentes grupos de injeções de células A549. (C) a mudança de peso do tumor em diferentes grupos. Os dados são médias ± DP. asteriscos duplos indicam valores significativamente diferentes do grupo NC (P 0,05). (D) antígeno nuclear de proliferação celular, Caspase 3 e ENTPD5 status de expressão em diferentes grupos de modelo animal determinados por Western blot. (E) Testes de Imuno-histoquímica mostrando ENTPD5, Caspase 3 e proliferação celular status de expressão do antígeno nuclear em diferentes grupos modelo animal. (F) A apoptose de células do tecido de tumor em modelos animais após o knockdown de ENTPD5 determinada in situ utilizando o ensaio TUNEL.
A análise imunohistoquímica da expressão do antígeno nuclear de proliferação celular, ENTPD5 e Casepase 3 concordou com a dados obtidos por transferência de Western (Fig. 5E). Além disso, o ensaio de TUNEL de tecidos de tumor demonstraram que os níveis de apoptose de células tumorais no grupo ENTP5-KD de ratinhos foram maiores do que aqueles no grupo de controlo (Fig. 5F). Estes dados sugerem que knockdown de ENTPD5 inibe o crescimento e promove a apoptose de câncer de pulmão de células
in vivo
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Discussão
Lung Cancer marcadores relacionados com o prognóstico desempenham papéis importantes na muitos processos, tais como o crescimento de células de tumor, apoptose, angiogénese tumoral e invasão de células tumorais. No cancro do pulmão, a introdução de agentes direcionados em pacientes portadores de anormalidades genéticas resultou em melhores resultados clínicos com melhor qualidade de vida. instabilidade genômica ou seleção leva a aberrações que podem ser agrupados em seis vias essenciais: i) a aquisição de sinais de auto-suficientes ou de crescimento autónomo; ii) insensibilidade a sinais inibidores do crescimento; iii) resistência a sinais de apoptose; iv) potencial de proliferação ilimitada; v) sustentado angiogénese; e vi) a invasão e metástase [17]. As células cancerosas se manifestam aberrações genéticas complexas que ocorrem durante a carcinogênese multi-estágio. Algumas aberrações moleculares são mais propensos do que outros para influenciar o comportamento clínico de câncer, incluindo o risco de metástase. Tais aberrações, uma vez identificado, pode potencialmente servir como marcadores prognósticos, que são características do tumor que podem influenciar e prever a evolução clínica de pacientes com câncer.
A sobre-expressão de alguns marcadores, tais como fator de crescimento endotelial vascular [18] , receptor do factor de crescimento epidérmico [4-6], humano factor de crescimento epidérmico receptor-2 de [7], p53 [8] e linfoma de células B-2 correlação [9], demonstrou com prognóstico pobre. Neste estudo, a análise imuno-histoquímica confirmou que a sobre-expressão da proteína específica ENTPD5 em tecidos de cancro do pulmão. Outras investigações sobre a sobrevida global sugerem que a expressão aumentada de ENTPD5 está associada a pior prognóstico. Estas observações revelam o potencial da ENTPD5 como um indicador de prognóstico.
ENTPD5 é identificada como um componente-chave na /fosfatidilinositol 3-quinase /fosfatase e homólogo angiotensina circuito regulador Akt, capaz de operar glicólise aeróbica [19,20 ]. Alguns investigadores mostram que a sobreexpressão de ENTPD5 afecta o crescimento de diversos tumores, tais como gliomablastoma [20], o cancro da mama [21], o cancro cervical [22], tumores de células germinativas testiculares [23], e neoplasia laríngea [24]. Tumorigénese é um processo multi-passo, envolvendo crescimento celular, invasão, metástase e angiogénese. A investigação sobre o efeito da ENTPD5 no processo de progressão celular mostra que o baixo-expressão de ENTPD5 em A549 e células PC9 linhas diminui significativamente o grau de proliferação celular, apoptose e migração. Colectivamente, estes dados indicam que ENTPD5 pode agir como um oncogene para desempenhar papéis importantes na regulação de diversos processos celulares que promovem a progressão neoplásica em múltiplos níveis. No entanto, os mecanismos pelos quais ENTPD5 exerce seus efeitos nas vias de sinalização específicas necessitam de mais estudos. Células
NSCLC são resistentes à apoptose. Estratégias de-reprimem inibidores de caspases endógenos em NSCLC sugerem atividade promissora em sistemas modelo e apresentar uma estratégia racional e inteiramente nova para melhorar o tratamento de câncer de pulmão. A apoptose é orquestrada pela activação sequencial de caspases, uma família de proteases de cisteína com uma especificidade para os resíduos de ácido aspártico. Duas vias podem mediar a apoptose: i) a morte via receptores (factor de necrose tumoral, ligando Fas ou receptores de TRAIL) que activa o de caspase 8 e 10, e ii) a via mitocondrial que activa da caspase 9. Ambas as vias conduzem para as caspases efectoras 3, 6 7 e [25]. Nossa pesquisa confirmou a relação entre ENTPD5 e caspase 3 em experimentos de nível e animais celulares. Compreender a base molecular deste fenótipo é crítica, se a terapia é ir além do planalto terapêutica que tem sido alcançado com a quimioterapia convencional. expressão da caspase 3 pode estar associada com processos sensível de quimioterapia ou radiação [26]. MacCarthy et ai. relatou que a expressão anormal de ENTPD5 em células de carcinoma colorrectal humano poderia influenciar os níveis de ATP e a resistência a oxaliplatina, um agente quimioterapêutico do cancro colo-rectal relevantes [27]. Villar et al. também descobriu a relação entre ENTPD 5 e resposta à quimioterapia no câncer de próstata 15]. Parece que a expressão ENTPD5 pode não só ser um repórter poderosa para o desvio metabólico nas células tumorais, mas também uma possível preditor para respostas quimioterapia do tumor. Este estudo concluiu que ENTPD5 inibiu a apoptose de células de câncer de pulmão através de caspase 3. No entanto, a relação entre o efeito da quimioterapia e ENTPD5 precisa de mais pesquisas no futuro. Em conclusão, o gene ENTPD5 é crucial em NSCLC. Pode ser potencialmente usado para monitorar o prognóstico ou para orientar regimes terapêuticos apropriados.
Reconhecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Plano de Pequim Ciência New Star (No. Z11111005450000) e National Natural Science Foundation da China (No. 81.101.598).