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Abstract

TRIM família de proteínas é uma família de genes evolutivamente conservada implicados em uma série de processos críticos, incluindo inflamação, imunidade, antiviral e câncer. Em um esforço para perfilar os padrões de superfamília TRIM expressão em várias linhas celulares de cancro de pulmão de células não pequenas (NSCLC), verificou-se que a expressão de 10 genes TRIM incluindo TRIM3, TRIM7, TRIM14, TRIM16, TRIM21, TRIM22, TRIM29, TRIM59 , TRIM66 e TRIM70 foi significativamente regulada positivamente em linhas celulares de NSCLC, em comparação com a linha de células epiteliais brônquicas normais humano (HBE), ao passo que a expressão de outros genes 7 TRIM incluindo TRIM4, TRIM9, TRIM36, TRIM46, TRIM54, TRIM67 e TRIM76 foi significativamente down- reguladas em linhas celulares de NSCLC, em comparação com a de células HBE. Como TRIM59 foi reportado para actuar como um proto-oncogene que afecta tanto as vias de sinalização de Ras e RB em modelos de cancro da próstata, que aqui focado o papel de TRIM59 na regulação da proliferação de células NSCLC e migração. Nós relatamos que uma proteína TRIM59 foi significativamente aumentada em várias linhas celulares de NSCLC. induzida siRNA derrubar de TRIM59 inibiu significativamente a proliferação e migração de células NSCLC linhas prendendo ciclo celular na fase G2. Além disso, TRIM59 derrubar afectou a expressão de um número de proteínas do ciclo celular Cdc25C e incluindo CDK1. Finalmente, derrubado TRIM59 e descobriu que os níveis de expressão de proteína p53 não upregulate, por isso, propôs que TRIM59 pode promover o crescimento de células NSCLC através de outros caminhos, mas não a via de sinalização p53

Citation:. Zhan W, Han T , Zhang C, Xie C, Gan H, K Deng, et al. (2015) TRIM59 promove a proliferação e migração de células não-pequenas células do cancro do pulmão por upregulating ciclo celular proteínas relacionadas. PLoS ONE 10 (11): e0142596. doi: 10.1371 /journal.pone.0142596

editor: Aamir Ahmad, Escola de Medicina da Universidade Estadual Wayne, United States |

Recebido: 27 Abril 2015; Aceito: 23 de outubro de 2015; Publicação: 24 de novembro de 2015

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho está disponível sob a licença Creative Commons CC0 domínio público dedicação

Data Availability:. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento: Este estudo foi parcialmente financiado por doações a JB Wang da National Natural Science Foundation da China (81372823, 31360282), o Departamento de Educação da Província de Jiangxi (Ciência e Tecnologia Luo programa Di) e uma bolsa para MG Fu do National Institutes of Health (AI103618).

CONFLITO dE iNTERESSES:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O motivo (TRIM) família de proteínas tripartite composta por mais de 70 membros que estão implicados em uma ampla gama de processos celulares, incluindo crescimento celular [1], diferenciação [2], o desenvolvimento [3], a apoptose [4], a inflamação e a imunidade [5, 6]. A característica mais marcante das proteínas da superfamília TRIM é a ordem altamente conservadas dos domínios no motivo RBCC, que contém um domínio ANEL, um ou dois motivos B-box e uma espiral enrolada região [7, 8]. A maioria das proteínas TRIM constituem uma nova classe de RING-finger único ligases E3 ubiquitina que promovem a modificações pós-translacionais de vários substratos, incluindo-se [7]. As proteínas TRIM também formar multimerização por meio de auto-associação através dos domínios em espiral espiralada, agindo como suportes para a montagem de complexos de multi-proteínas que identificam os compartimentos subcelulares [9]. Durante a última década, muita atenção tem sido atraído em explorar o papel das proteínas TRIM na imunidade inata a infecções virais [10]. Nos últimos anos, vários grupos relataram que as proteínas TRIM também estão atuando como oncogenes ou supressores tumorais implicando em várias crescimento do câncer. Por exemplo, Raheja et ai. informou que TRIM3 é um supressor de tumor de boa-fé, a sua capacidade de inibir a proliferação celular depende da NHL (nomeado após o NCL1, HT2A e repita LIN41) domínio e seu domínio ANEL [11]. TRIM16 inibe a proliferação de células de neuroblastoma e migração in vivo e tumorigenicidade in vitro através de mudanças expressão de ciclina D1 e p27 [12]. TRIM28 aparece regulada em muitos tipos de câncer. Na fase inicial de tumores pulmonares, alta TRIM28 correlaciona com o aumento da sobrevida global [1]. Além disso, TRIM28 reduz a proliferação celular em linhas celulares de cancro do pulmão modelo colmatando interações E2F HDAC1 /[1]. Recentemente, Zhou et al (2014) relataram que no tumor gástrico, TRIM59 interage com o p53, promovendo a sua ubiquitinação e degradação; TRIM59 pode promover a carcinogênese gástrica através deste mecanismo [13].

Em um esforço para traçar o perfil do padrão de expressão TRIM superfamília em várias linhas de células NSCLC, a expressão de vários genes TRIM incluindo TRIM3, TRIM7, TRIM14, TRIM16, TRIM21, TRIM22, TRIM29, TRIM59, TRIM66 e TRIM70 foi significativamente regulada positivamente em linhas celulares de NSCLC, em comparação com a linha de células normais epiteliais brônquicas humano (HBE), ao passo que a expressão de outros genes TRIM incluindo TRIM4, TRIM9, TRIM36, TRIM46, TRIM54, TRIM67 e TRIM76 foi significativamente regulada para baixo em linhas celulares de NSCLC em comparação com a de células HBE. Como TRIM59 foi reportado para actuar como um proto-oncogene que afecta tanto as vias de sinalização RB em modelos de cancro da próstata [14] de Ras e, que aqui focado o papel de TRIM59 na regulação da proliferação de células NSCLC e migração. Em primeiro lugar, verificaram que a proteína TRIM59 foi significativamente aumentada em várias linhas celulares de NSCLC. derrubando de TRIM59 induzida por SiRNA preso significativamente a proliferação e migração de linhas celulares de NSCLC com a prisão do ciclo celular na fase G2.

Materiais e Métodos

cultura celular

brônquica Humano células epiteliais (HBE) eram de Sciencell Companhia e cultivadas em meio de células epiteliais brônquicas (ScienCell, 3211). Não-pequenas linhas celulares de cancro de pulmão de células (NSCLC) (H1299, H292, A549) eram da ATCC e linha celular SPC-A1 foi um presente do grupo do Dr. Xuerong Wang (Departamento de Farmacologia, Nanjing University Medical). linhas celulares de NSCLC foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco). Todas as células foram cultivadas sob uma atmosfera de 5% de CO

2 a 37 ° C.

purificação de ARN e análise de Q-PCR

O RNA total foi extraído usando o reagente TRIzol (Invitrogen, 15596 -026). A síntese de cDNA foi realizada utilizando o kit de reagente PrimeScript RT com ADNg Borracha (Takara, RR047A). experimentos Q-PCR foram realizadas utilizando o kit de SYBR Green Premix Ex Taq II (Takara, RR820A) e RT-PCR System-Applied Bio-sistema. A quantidade relativa de ARNm de expressão de genes alvo foi calculada pelo método comparativo Ct utilizando GAPDH como um controlo. Todas as reacções de Q-PCR foram realizadas em triplicado. Os dados foram adquiridos utilizando ABI ViiATM 7 instrumento Real-Time PCR System. Todos os primers para os 72 genes TRIM foram validados utilizando padrões de cDNA universais (BD Clontech). A quantificação foi realizada pelo método ΔCt, com 18S ou actina utilizadas para a normalização. mRNA com tempos de ciclo ≥ 34 estavam determinados a não ser detectado. níveis de mRNA normalizados são expressos como unidades arbitrárias por transformadas os tempos de ciclo usando 2

ΔCt. Os dados foram oposição a log2 e organizados em um mapa de calor utilizando software MEV (Instituto do Câncer Dana-Farber, https://www.tm4.org/mev.html).

Ensaio

ensaio de soro de baixa e densidade de saturação

para o ensaio de soro baixo, as células foram plaqueadas a uma densidade de 10

5 as células em pratos de 12 poços e deixadas aderir durante a noite em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS. No dia seguinte, o número de células foi contado como os dados do dia 0, o meio foi mudado para meio RPMI 1640 suplementado com FBS a 1% e, em seguida mudado a cada dois dias, durante 6 dias. Nos tempos indicados, as células foram tripsinizadas e contadas com um hemocitómetro. Para o ensaio de densidade de saturação, 10

5 as células foram semeadas em placas de 12 poços em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS. O meio foi trocado a cada dois dias. A densidade celular foi determinada por contagem de células no sexto dia.

Colónia ensaio de formação de

Colónia ensaio de formação foi realizado com células H1299 que foram cultivadas em RPMI 1640 com FBS a 10% em 60 placas mm e transientemente transfectadas com ARNsi de controlo, TRIM59 siRNA-1, 2-TRIM59 siRNA ou não tratado como um controlo positivo. Após a transfecção, as células foram tripsinizadas, contadas e 500 células foram semeadas em placas de 6 poços, e deixadas a aderir durante a noite. No dia seguinte, o meio foi mudado para meio RPMI 1640 + FBS a 5%. Todas as células foram então cultivadas durante 2 semanas, com meio mudado a cada segundo dia. As placas foram fixadas com formaldeído a 4% e coradas com violeta de cristal a 2%. As imagens foram obtidas por uma câmera digital.

SiRNA

O derrubando de TRIM59 foi realizada utilizando duas distintas duplexes discrição Select RNAi (Life Technologies Company). sequências de oligonucleótidos alvo foram: siRNA-1: GCCUCUCUAUCUGUUUACCAAAGUU; siRNA-2: UCCUCGUGUACUGCCAUGCUCUCAU; Discrição duplex de ARNi de controlo negativo a partir de Life Technologies Company foi utilizada como um controlo. Os nucletides RNAi foram transitoriamente transfectadas tanto em células HBE ou células NSCLC usando SuperFectin siRNA Transfection Reagent (Pufei, Xangai, 2103-100) eo relativo derrubar a eficiência foi determinada pelo anticorpo TRIM59.

ensaio de cicatrização de feridas zero e Transwell migração ensaio

a migração celular foi medida utilizando um ensaio de zero [15]. células H1299 foram plaqueadas em placas de 6 poços para criar uma monocamada confluente de 90-100% de confluência, em seguida, a monocamada foi raspado em linha recta para criar um “zero” por uma ponta de pipeta de 200 uL. Após remover os detritos e adicionando meio fresco contendo 2% de FBS, as células foram fotografadas usando o microscópio de contraste de fase (Olympus IX71; ampliação: 200 ×; objectivo: LCAch20XPh; nenhum filtro; câmera: DP72; exposição e Análise de Imagem: cellSens software; tamanho do pixel: 1.4 megapixel CCD monocromática). A distância de migração foi avaliada usando software de imagem J (National Institutes of Health, https://rsb.info.nih.gov/ij/download.html). A taxa de migração foi calculada pela célula área migração relativa para cada tratamento.

Ensaio de migração

Transwell foi realizada utilizando câmaras Transwell 8um tamanho de poro (BD Falcon). Um total de 10

5 células em 0,2 ml de meio suplementado com FBS a 1% foram plaqueadas na câmara superior. A câmara inferior do dispositivo Transwell foi preenchida com 500 ul de meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS. Após incubação a 37 ° C durante 10 horas, as células que permanecem na superfície superior da membrana foram removidos. As células na superfície inferior da membrana foram fixadas, coradas com violeta de cristal e, em seguida, contados sob um microscópio de luz (Olympus IX71; ampliação: 40 ×; objectivo: UplanFl4XPh; nenhum filtro; câmera:;: software cellSens exposição e Análise de Imagem DP72 ; tamanho do pixel: 1.4 megapixel CCD monocromática). Total de células 400 foram fotografadas.

análise do ciclo celular

células recentemente preparados foram colhidas e re-suspenso em 0,5 ml PBS. Em seguida, as células foram fixadas com álcool a 70% em gelo durante pelo menos 2 horas. Após centrifugação, o sobrenadante foi rejeitado e o sedimento foi lavado uma vez com PBS para. pellet celular foi re-suspenso em 5 ml de PBS e, em seguida, as células foram contadas. Re-suspendeu 2 × 10

5 células com reagente ciclo celular de goiaba 400 ul (Millipore, 4700-0160). Após incubação em banho de água a 37 ° C durante 15 minutos, do ciclo celular foi analisada pela Millipore goiaba easyCyte ™ citómetro de fluxo (Millipore).

Imunofluorescência coloração

As células foram colocadas em placas em 24 poços placas e deixadas a crescer durante 18-24 horas. As células foram fixadas com metanol gelado durante 5 minutos à temperatura ambiente e lavadas por PBS durante três vezes. Em seguida, as células foram bloqueadas com soro de cabra normal a 5%, 0,3% de Triton X-100 em PBS à temperatura ambiente durante 1 hora. O anticorpo anti-PCNA (Abcam, ab92552) incubação foi realizada durante 2 horas à temperatura ambiente. Após lavagem com PBS, foi aplicada rodamina conjugada com anticorpo de cabra anti-coelho (Proteintech, SA00007-2) à temperatura ambiente durante 1 hora num local escuro. As células foram lavadas com PBS por três vezes e, em seguida, montadas com Fluoromount-G DAPI meio de montagem (Southern Biotech, 0100-20). Finalmente, as células foram fotografadas com um microscópio de fluorescência (Olympus IX83; ampliação: 200 ×; objectivo: LUCPlanFl20XPh; configuração de filtro e tempo: DAPI: Filtro BA420 e 220ms, PCNA: Filtro BA590 e 360ms; câmera: DP80, a exposição e análise de imagem: cellSens software; tamanho do pixel: 12,5 CCD cor megapixel). Total de células 600 foram fotografadas.

isolamento de proteínas e western blot

As proteínas de tecidos e células foram separados por 10% SDS-PAGE padrão seguido pela transferência das proteínas para uma membrana de PVDF. As proteínas foram detectadas por os seguintes anticorpos primários: TRIM59 (Sigma, R06835), ciclina B1 (Proteintech, 55004-1-AP), Cdc25C (Proteintech, 16485-1-AP), CDK1 (Proteintech, 19532-1-AP) , p53 (Proteintech, 10442-1-AP), PCNA (Abcam, ab92552) e β-actina (Santa Cruz, sc-4778) e seguido por incubação com um anticorpo secundário. A coloração foi realizada com ECL reagente de detecção de western blot. Anticorpo para p-actina foi serviu como controlo endógeno. Todos os experimentos foram realizados em triplicado.

A análise estatística

Para cada experiência, três repetições independentes foram realizadas. Todos os dados foram expressos como média ± DP. A avaliação estatística foi realizada utilizando o teste t de Student. A diferença entre grupos foi comparada utilizando análise de uma via da variância, seguida pelo teste de Dunnett. Um valor de p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. *,

p Art 0,05 vs. controlo; **,

p Art 0,01 vs. controlo; ***,

p

. 0,001 vs. controlo

Resultados

TRIM59 é altamente expresso em linhas celulares de NSCLC

O cancro do pulmão é o mais câncer comum entre os homens em todo o mundo. Os principais tipos principais de cancro do pulmão são o carcinoma de células pequenas do pulmão (SCLC) e carcinoma do pulmão de células não pequenas (NSCLC). NSCLC não é bem resposta à quimioterapia e tem uma mortalidade mais elevada do que o SCLC [16]. Em um esforço para perfilar os padrões de família de genes TRIM em linhas celulares de NSCLC de expressão, foram selecionadas quatro linhagens de células NSCLC, incluindo H1299, SPC-A1, A549 e H292. A célula epitelial brônquica humano (HBE) foi serviu como controlo. Os níveis de ARNm da família de genes de compensação para dentro destas linhas de células foram medidas por Q-PCR e analisadas por software MEV (S1 Tabela). A expressão de vários genes TRIM incluindo TRIM3, TRIM7, TRIM14, TRIM16, TRIM21, TRIM22, TRIM29, TRIM59, TRIM66 e TRIM70 foi significativamente regulada positivamente em linhas celulares de NSCLC, em comparação com células HBE (Figura 1A e 1B), enquanto que a expressão de outros acabamentos genes, incluindo TRIM4, TRIM9, TRIM36, TRIM46, TRIM54, TRIM67 e TRIM76 foi significativamente regulada para baixo em linhas celulares de NSCLC em comparação com a de células HBE (Fig 1A e S1 FIG). Os níveis de outras 12 genes TRIM expressão de mRNA não foram detectados quer em linhas celulares ou células NSCLC HBE. Como TRIM59 foi reportado para actuar como um proto-oncogene que afecta tanto as vias de sinalização RB em modelos de cancro da próstata [14] de Ras e, que aqui focado em TRIM59 em NSCLC para posterior investigação.

(A) O ARNm Os níveis de expressão de genes da família 60 TRIM em quatro linhagens de células NSCLC (H1299, H292, SPC-A1 e A549), linha celular e humana normal epitelial brônquica (HBE) foram determinadas por Q-PCR. Os dados foram organizados em um mapa de calor usando software MEV. Os níveis de expressão relativa dos genes foram mostrados na escala de cores de 0-4.0435486 no esquema de cores verde-vermelho-preto. (B) Os níveis de expressão de mRNA de genes TRIM incluindo TRIM3, TRIM7, TRIM14, TRIM16, TRIM21, TRIM22, TRIM29, TRIM59, TRIM66 e TRIM70 foram significativamente upregulated em linhas celulares de NSCLC em comparação com a de células HBE. (C) Representação esquemática de TRIM59. TRIM59 contém um domínio dedo anelar (ANEL), um domínio B-box2 (B2), dois domínios em espiral enrolada (CC) e um domínio transmembranar (TM). (D) A expressão de TRIM59 em 14 tipos de tecidos normais foi verificada por Western blot utilizando anticorpo TRIM59. (E) A expressão da proteína TRIM59 em quatro linhas celulares de NSCLC e linha celular HBE. Os lisados ​​das linhas de células foram submetidas a análise de imunotransf erência com anticorpo TRIM59.

TRIM59 humana é uma proteína de 403aa contendo um domínio RING, um domínio B-quadro, dois domínios em espiral espiralada e um domínio transmembranar na sua extremidade C-terminal (Fig 1C). Western blot mostrou que TRIM59 foi altamente enriquecido na medula óssea e baço, de baixo nível no músculo e no pulmão, indetectável em outros tecidos que foram examinadas (figura 1D). Além disso, western blot confirmou, ainda, que o nível de proteína TRIM59 foi significativamente mais elevada em todas as linhas celulares de NSCLC que foram examinados do que na HBE (Figura 1E). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que TRIM59 é sobre-expresso em linhas celulares de NSCLC e podem envolver na regulação do crescimento NSCLC.

TRIM59 promove a proliferação de células NSCLC

Para examinar a função de TRIM59 em células NSCLC, adquirimos três siRNAs que alvejam a TRIM59 humano a partir de Life Technologies Company. Estes siRNAs foram transfectados em linha de células H1299. Após 48 horas, o nível de proteína de TRIM59 foi detectado por Western blot. Tal como mostrado nas figuras de fundo da Fig 2A, tanto siRNA-1 e siRNA-2 eficientemente derrubado TRIM59 em diferentes linhas de células comparado com o de ARNsi de controlo. Em seguida, examinamos os efeitos da induzida por siRNA derrubando de TRIM59 no crescimento baixo soro de linhas celulares de NSCLC. Como mostrado nas figuras de topo da Fig 2A, todas as células NSCLC foram extremamente eficazes em crescendo em baixo soro, no entanto, quando TRIM59 foi derrubado, eles não foram capazes de crescer sob estas condições.

(A) ensaio de Baixo soro . As linhas celulares de NSCLC indicados transientemente transfectadas com ARNsi TRIM59-1, 2-TRIM59 ARNsi, ou ARNsi de controlo não transfectadas foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 1% de FBS. Nos tempos indicados, as células foram tripsinizadas e contadas. Os dados representam a média de três experiências independentes (média ± SD) (figuras de topo). Immunoblot de TRIM59 para verificar a eficiência knockdown de TRIM59 siRNAs nas linhas celulares indicadas (números em baixo). ensaio de densidade (B) Saturação. As células NSCLC indicados transientemente transfectadas com ARNsi TRIM59-1, 2-TRIM59 ARNsi, ou ARNsi de controlo não transfectadas foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com FBS a 10% durante 6 dias, tratadas com tripsina e contadas. Os dados representam a média de três experiências independentes (média ± DP). ensaio de formação (C) Colony. Quinhentos H1299 células transitoriamente transfectadas com ARNsi TRIM59-1, 2-TRIM59 ARNsi, ou ARNsi de controlo não transfectadas foram semeadas em placas de 6 poços em meio RPMI 1640 com 5% de FBS. Após duas semanas, as células foram fixadas e coradas com violeta de cristal. poços representativos foram fotografados e exibidos.

Resultados semelhantes foram obtidos quando se examina a capacidade relativa de TRIM59 para permitir que as células NSCLC para aumentar a sua densidade de saturação. As células tratadas com siRNA TRIM59 foram significativamente menos denso do que o tratado com ARNsi de controlo ou tratados. Da mesma forma, siARN induzida derrubar de TRIM59 retardou significativamente o crescimento de células NSCLC, mas não afectou significativamente o crescimento das células HBE (Fig 2B). Em seguida, foram realizados os experimentos de formação de colónias. Como mostrado na Fig 2C, a derrubar de TRIM59 diminuiu dramaticamente a formação de colónias em células H1299. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que TRIM59 é essencial para a proliferação, a formação de colónias das linhas celulares de NSCLC. Um estudo recente sugeriu que TRIM59 promove o crescimento de tumor gástrico, pelo menos, parcialmente através de p53 [13]. Como H1299 células é uma linha de células de eliminação p53 (informações ATCC), os nossos resultados sugerem que TRIM59 pode ter como alvo outras proteínas para promover o crescimento das células do NSCLC.

TRIM59 promove a migração de células NSCLC

Dada a capacidade de TRIM59 para promover o crescimento de células NSCLC e formação de colônias, que está interessado em examinar os seus efeitos potenciais sobre a migração de células NSCLC. Para explorar esses efeitos possíveis, foi realizada a cicatrização de feridas ensaio. Os resultados mostraram que as células H1299 e migrou da área aberta criada pela “ferida” estava quase curada depois de 36 horas. No entanto, a cicatrização da área aberta foi marcadamente atenuada quando TRIM59 foi derrubado (Fig 3A). De modo a provar ainda mais este efeito, que também fez Transwell de ensaio, como se mostra na figura 3B, o número de células que migraram foi grandemente reduzida quando TRIM59 foi derrubado. Portanto, derrubar TRIM59 impedida a migração de células H1299.

H1299 (A) células transitoriamente transfectadas com ARNsi TRIM59-1, ou ARNsi de controlo não transfectadas foram cultivadas para criar uma monocamada confluente de 90-100% de confluência, em seguida, a monocamada foi raspado em uma linha reta para criar um “scratch”. A extensão da migração de células foi fotografado nos tempos indicados (figuras esquerda). As feridas scratch transversais foram re-examinados e analisados ​​por meio de imagem de software J em 3 locais diferentes de cada área ferida de lacunas em cada ponto de tempo. Os resultados são apresentados como média ± erro padrão (figura da direita). (B) células H1299 transf ectadas transitoriamente com ARNsi de controlo ou ARNsi TRIM59-1 ou TRIM59 siRNA-2 e cultivadas com meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS durante 48 horas. Em seguida, as células foram tripsinizadas e semeadas em câmaras Transwell. Após incubação durante 10 horas, as células foram fixadas, coradas, fotografado e contado em cinco vistas aleatórios.

Derrubar de TRIM59 prende ciclo celular NSCLC em fase G2

Derrubar TRIM59 inibida NSCLC o crescimento de células indicando que TRIM59 pode perturbar acontecimentos relacionados com o ciclo celular em células NSCLC. Para examinar os efeitos de TRIM59 derrubar no ciclo celular, que transfectadas TRIM59 ou ARNsi de controlo ou para as células H1299 HBE, do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo, após coloração com iodeto de propídio. Como mostrado na Fig 4A e 4B, de derrubar TRIM59 aumentou significativamente a proporção da fase G2 /M e diminuiu a proporção de S ou fase G0 /G1 fases comparado com o de ARNsi de controlo tratadas ou células H1299 não tratados. Para definir mais precisamente TRIM59 derrubando detenção do ciclo celular de H1299 seja no G2 ou fase M, nós próxima examinou o PCNA pela técnica de imunofluorescência e western blot. Como mostrado na Fig 4C, descobrimos que derrubar TRIM59 em células H1299 dramaticamente regulada negativamente a coloração de PCNA. Morever, resultado western blot também mostrou que o nível de proteína PCNA foi regulada para baixo (Fig 4D). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a diminuição da actividade proliferativa de células em TRIM59 derrubar células foram causados ​​por prender ciclo celular na fase G2. Curiosamente, derrubando de TRIM59 não tem efeito óbvio sobre o ciclo celular de células HBE (Fig 4A e 4B), isso poderia explicar por derrubar de TRIM59 não têm efeitos inibitórios significativos sobre o crescimento de células HBE porque não teve efeitos na célula células de ciclo.

HBE e H1299 foram transientemente transfectadas com ARNsi TRIM59-1, 2-TRIM59 ARNsi, ou ARNsi de controlo não transfectadas foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 10% de FBS durante 48 horas. As células aderentes (A) foram recolhidas e análise do ciclo celular foi realizada por citometria de fluxo. As inserções mostrou a proporção de células para cada fase e são marcados com cores diferentes (rosa: G0 /G1 fase, verde: fase S, e cinza: fase G2 /M). (B) A proporção de células em cada fase foi contado. (C) H1299 células foram fixadas e coradas com anticorpo anti-PCNA (vermelho) e DAPI (azul). (D) Os níveis de expressão de proteína de PCNA em células H1299 foram verificados por western blot.

Derrubar de TRIM59 diminui a expressão de proteínas do ciclo celular

Para elucidar o mecanismo da célula ciclo preso pela TRIM59 derrubando, realizamos Q-PCR para verificar os níveis de mRNA de múltiplos genes que desempenham papéis essenciais na fase G2 /M. Como mostrado na Fig 5A, os níveis de mRNA de CDC2, CCNA1, CCNB1, CCNB2 e cdc25C foram significativamente reduzidos em TRIM59 siRNA células tratadas em comparação com o que em células de controlo tratadas siRNA. Além disso, foram examinados os níveis de proteína de ciclina B1, Cdc25C e CDK1 por western blot. Como mostrado na Fig 5B, Cdc25C e CDK1 mas não ciclina B1 foi significativamente diminuída em TRIM59 siRNA células tratadas em comparação com o de ARNsi de controlo células tratadas. Estes resultados em conjunto indicam que TRIM59 é importante para a regulação do ciclo celular afectando as proteínas do ciclo celular.

H1299 células transitoriamente transfectadas com ARNsi TRIM59-1, 2-TRIM59 ARNsi de controlo ou ARNsi foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 10% de FBS durante 48 horas. (A) Os níveis de expressão de ARNm de G2 /M de genes relacionada com a fase CDC2, CCNA1, CCNB1, CCNB2 e cdc25C foram testados por quantitativa PCR em Tempo Real. (B) Os níveis de CDK1 (também conhecido como CDC2) expressão da proteína, Cdc25C e ciclina B1 foram verificados por western blot com anticorpos indicados.

TRIM 59 promove o crescimento celular NSCLC não através de via de sinalização p53

Zhou et al (2014) relataram que no tumor gástrico, TRIM59 interage com o p53, promovendo a sua ubiquitinação e degradação; TRIM59 pode promover a carcinogênese gástrica através deste mecanismo [13]. Para investigar o mecanismo de TRIM59 promoção do crescimento celular em células NSCLC, nós derrubado TRIM59 e verificou os níveis de proteína de p53 em linhas celulares de NSCLC e células HBE. Para células H1299, é uma linha celular de p53 eliminação, da proteína p53 não pode ser detectado. Curiosamente, para HBE, H292 e células A549, eles são linhas de células de tipo selvagem p53 [17], os níveis de proteína p53 não foram afetados pela TRIM59 derrubando. No entanto, para as células SPC-A1, os níveis de proteína p53 diminuíram quando TRIM59 foi derrubado (Fig 6). Tomados em conjunto, propusemos que TRIM59 pode promover o crescimento de células NSCLC através de outros caminhos, mas não a via de sinalização p53.

Quatro tipos de células NSCLC indicados e células HBE transitoriamente transfectadas com TRIM59 siRNA-1, TRIM59 siRNA-2, ARNsi de controlo ou não transfectadas foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 10% de FBS durante 48 horas. Os níveis de p53 expressão de proteínas foram verificados por western blot utilizando anti-p53 e anticorpos anti-TRIM59.

Discussão e Conclusões

TRIM proteínas compreendem um grande superfamília e são importantes reguladores do processos celulares, incluindo a inflamação, a imunidade, a proliferação celular e apoptose, e antiviral [1, 4-6, 10]. O objetivo deste estudo é identificar as proteínas TRIM que são potencialmente envolvidos na regulação da proliferação, a formação de colónias e migração de células NSCLC. Utilizou-se Q-PCR para o perfil dos níveis de 72 genes TRIM expressão em quatro linhas celulares de NSCLC e uma linha de células epiteliais brônquicas normais humano (HBE). Descobrimos que os níveis de 10 genes TRIM incluindo TRIM3, TRIM7, TRIM14, TRIM16, TRIM21, TRIM22, TRIM29, TRIM59, TRIM66 e TRIM70 expressão foram significativamente upregulated em células NSCLC em comparação com a de células HBE, ao passo que os níveis de outros 7 expressão genes TRIM incluindo TRIM4, TRIM9, TRIM36, TRIM46, TRIM54, TRIM67 e TRIM76 foram significativamente regulada em células NSCLC em comparação com a de células HBE. Embora a maior parte das proteínas são menos caracterizado TRIM, algumas proteínas TRIM desempenham papéis importantes nos processos celulares relacionados com o cancro. Por exemplo, TRIM3, TRIM16, TRIM29 e TRIM36 têm sido relatados para funcionar como supressores de tumor [18-21]. Curiosamente, TRIM7 foi identificado como uma proteína que interactua com glicogenina e envolvida na regulação do metabolismo da glucose celular [22]. Como a característica única no metabolismo celular do cancro é essencial para o crescimento e migração de células de cancro, seria importante investigar ainda mais o papel da TRIM7 no metabolismo celular de células NSCLC. Além disso, tem sido relatado TRIM67 funcionar como um inibidor de Ras [23]. A regulação negativa da TRIM67 em células NSCLC pode contribuir para a sobre-activação de sinalização de Ras e sobre o crescimento de células NSCLC.

caracterizado adicionalmente a função biológica de TRIM59 na proliferação, a formação de colónias e migração de células NSCLC . induzida siRNA derrubar de TRIM59 atenuou significativamente o crescimento, a formação de colónias e migração de células NSCLC, mas não afectou significativamente o crescimento das células HBE. No entanto, em experiências in vivo tem de ser realizados para verificar estes resultados. Khatamianfar et ai. recentemente identificado TRIM59 como um transdutor de sinal no início de dois (SV40Tag e Ras) vias de oncogenes em modelos de câncer de próstata de ratinho. Além disso, Zhou et al. também informou que TRIM59 promovido tumorigênese gástrica através infra-regulação de abundância da proteína p53 e p53 supressão de sinais a jusante. Para verificar se TRIM59 promove a proliferação de células NSCLC também através de via p53, nós derrubado TRIM59 e verificada a expressão da p53. Para células H1299, é uma linha celular de p53 eliminação, por outras linhas de células, nenhum efeito, ou mesmo de p53 diminuiu. Assim TRIM59 regula a proliferação e migração de células NSCLC pela segmentação do que outras proteínas p53.

Em conclusão, nós identificamos que TRIM59 é um potencial regulador importante para a proliferação e migração de células NSCLC. induzida siRNA derrubar de TRIM59 inibiu significativamente a proliferação e migração de células NSCLC linhas prendendo ciclo celular na fase G2. Além disso, TRIM59 derrubar afectou a expressão de um número de proteínas do ciclo celular Cdc25C e incluindo CDK1. No entanto, a in vivo papel fisiológico e mecanismos de proteína TRIM59 precisa ser investigado.

Informações de Apoio

S1 Fig. Os níveis de genes TRIM incluindo TRIM4, TRIM9, TRIM36, TRIM46, TRIM54, TRIM67 e TRIM76 expressão de mRNA foram significativamente regulada em linhas celulares de NSCLC em comparação com a de células HBE

doi:. 10.1371 /journal.pone.0142596. S001

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Tabela S1. O perfil para os padrões de família de genes TRIM em linhas celulares de NSCLC de expressão.

Foram selecionados quatro linhas celulares de NSCLC, incluindo H1299, SPC-A1, A549 e H292. A célula epitelial brônquica humano (HBE) foi serviu como controlo. Os níveis de ARNm da família de genes de compensação para dentro destas linhas de células foram medidas por Q-PCR. O nível de expressão de mRNA de genes aparar com tempos de ciclo ≥ 34 estavam determinados a não ser detectado. TRIM17, TRIM40, TRIM42, TRIM43, TRIM48, TRIM49, TRIM50, TRIM51, TRIM63, TRIM60, TRIM64 e TRIM77 foram detectados. Dizer: média; SD: erro padrão; CT:. Tempo de ciclo

doi: 10.1371 /journal.pone.0142596.s002

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