Abstract

Fundo

AKT1 (timoma murino homólogo do oncogene viral v-akt 1) cinase é um dos mais frequentemente ativada proliferaram e via de sobrevivência de câncer. Recentemente, foi mostrado que a mutação E17K no domínio de homologia plecstrina (PH) da proteína AKT1 conduz ao cancro, amplificando a fosforilação e a localização da membrana de proteína. O mutante mostrou resistência ao AKT1 /2 VIII inibidor da molécula de fármaco. Neste estudo nós demonstramos as consequências estruturais e moleculares detalhados associados com a regulação da proteína mutante atividade.

Métodos

A pontuação de ancoragem exibiram perda significativa na afinidade interação para AKT1 /inibidor 2 VIII molécula de fármaco. Além disso, os estudos de simulação de dinâmica molecular apresentou uma evidência da rápida desvio conformacional observado na estrutura mutante.

Resultados

Não houve perda de estabilidade no mutante em comparação a estrutura nativa eo principal cátion-π interacções também foram exibidas para serem retidos. Além disso, os resíduos activos envolvidos na localização da membrana de proteína exibiram aumento significativo na formação NHbonds no mutante. O aumento na formação de resíduos na NHbond activas a causa do aumento de 4 vezes no potencial localização da membrana de proteína.

Conclusão

O resultado global sugeriu que, embora a mutação não induziu qualquer estabilidade perda na estrutura, as consequências patológicas associadas pode ter ocorrido devido ao rápido desvios de conformação observadas no domínio AKT1 PH mutante.

importância geral

a metodologia aplicada e os resultados obtidos neste trabalho será facilitar a determinar o núcleo mecanismos moleculares de mutações associadas ao câncer e na concepção dos seus potenciais inibidores de drogas

Citation:. Kumar a, Purohit R (2013) Cancer Associated E17K mutação causa rápida conformacional desvio na AKT1 plecstrina homologia (PH ) Domínio. PLoS ONE 8 (5): e64364. doi: 10.1371 /journal.pone.0064364

editor: Reiner Albert Veitia, Institut Jacques Monod, França |

Recebido: 30 Janeiro, 2013; Aceito: 12 de abril de 2013; Publicado em: 31 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Kumar, Purohit. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esses autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

AKT1 (timoma murino homólogo do oncogene viral v-akt 1) cinase é um membro de, possivelmente, a via de proliferação e sobrevivência mais frequentemente no cancro activado [1] – [6]. membros da família de genes AKT estão associados com câncer em humanos; especialmente importante é a amplificação genética de AKT2. mutação pontual em AKT1 foi detectada em síndrome de Proteus [2], carcinomas endometriais [4], [7] e da leucemia [5], [8] – [9], a amplificação do gene num único carcinoma gástrico de uma tela de mais de 225 diferentes doenças malignas humanos [10], e em 1 gliosarcoma de 103 cancros gliais malignas [11]. Em outro estudo verificou-se que a atividade AKT1 quinase foi frequentemente elevados em vários de alta qualidade, cânceres em estágio final [12], embora os mecanismos exatos de tais observações ainda não estão claros. A activação de AKT1 é accionado por a localização da membrana, que por sua vez é iniciada pela ligação da homologia plecstrina (PH) domínio para o fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PtdIns (3,4,5) P3) ou phosphatidylinositol- 3,4-bifosfato (PtdIns (3,4) P2), seguida por fosforilação do regulador aminoácidos serina 473 (Ser 473) e de treonina 308 (Thr 308) [3], [13]. A associação patológica da AKT com a membrana plasmática é uma linha comum que liga AKT ao câncer [1] – [7], [14] – [15]. O comportamento oncogénico da proteína de fusão Gag-AKT do retrovírus AKT8 leucemia murina (timoma murino homólogo do oncogene viral v-akt 8) requer um sinal a miristoilação primeira evidência presuntiva de direccionamento membrana que a localização da membrana patológica da actividade de AKT1 de quinase poderia ser transformador em ratos [16]. Além disso, a importância de AKT em cancro humano é largamente inferida a partir de mutações que ocorrem frequentemente nas enzimas que regula a actividade destes fosfolípidos segundo mensageiro (PtdIns (3,4,5) P3, PtdIns (3,4) P2) e, finalmente, provoca a activação de AKT através da membrana recrutamento [1], [3], [17], [18]. Tumores amostras de pacientes com cancro da mama, cancro colo-rectal e os casos de leucemia foi mostrado para abrigar frequência de activação de mutações somáticas no AKT1 [1], [5]. Além disso, a perda de membros interagindo associados, tais como a actividade de fosfatase lipídica fosfatase e tensina homólogo (PTEN) tem sido relatada em glioblastoma, próstata e cancro do endométrio por meio de mutações somáticas [11], ou no cancro da mama por meio de silenciamento epigenético [12], o que representa um mecanismo indireto alternativa para activar AKT. Assim, AKT1 parece ter um papel crucial, mas passivo na oncogênese e atua como um intermediário indireta entre proteínas reguladoras a montante mutantes e moléculas de sinalização a jusante.

A activação oncogénica de AKT1 pode ser induzida por vários meios, ocorrendo mais comumente quer devido ao compromisso em sua membrana segmentação por domínio PH, ou devido às patológicas mudanças conformacionais que ocorrem na estrutura mutante. As mutações genéticas no domínio PH foi previamente relatado para perturbar o comportamento localização e na perda de sensibilidade para com os PtdIns e tem levado a consequências importantes ao seu comportamento funcional [1]. Para o rastreamento das causas por trás de tal observação, a abordagem computacional forma um backbone significativo e serve na realização observações experimentais interessados ​​na entrada de baixo custo. Uma mutação pontual no nucleótido 49 que resulta na substituição de lisina por ácido glutâmico no aminoácido 17 (AKT (E17K)) tem sido implicado em casos de cancro [1], [3], [19] – [21]. A causa molecular por trás do resultado oncológico associado ainda não foi estudada aprofundadamente. Sabe-se que a ligação de fosfoinositidos ao domínio PH AKT1 activa. Na conformação da apo, Glu 17 ocupa a bolsa de ligação de fosfoinositida e forma uma rede de ligações de hidrogénio. Na obra de Carpten et al. (2007), mostrou-se que os 17 Lys substituição resulta em uma mudança na carga de superfície em torno da bolsa de negativo com 17 a Glu eficazmente neutra no mutante [1]. Esta mutação resultou num aumento do nível de fosforilação de Akt em Thr 308 e Ser 473, em comparação com o tipo selvagem. AKT1 actividade de quinase (E17K) foi demonstrado ser aproximadamente quatro vezes maior do que a de AKT1 (WT), sugerindo que a mutação alterou a regulação AKT1 e, portanto, aumenta a actividade celular [1]. Além disso, também foi proposto que induz a mutação grande aumento de afinidade para o PI (4,5) P2 que é essencial para a membrana plasmática constitutiva segmentação do domínio PH mutante e, portanto, a natureza oncogénica da proteína E17K AKT1 de comprimento completo [3]. Além disso, foi também sugerido que a mutação E17K domínio PH causou alterações estruturais do domínio PH, o que afetou ainda mais a sua interacção com AKT1 /2 VIII inibidor [1]. Todas estas observações sugerem fortemente que os prejudiciais mudanças conformacionais no domínio de PH mutante pode ter causado tais resultados patológicos.

A simulação dinâmica molecular (MDS) tem sido uma abordagem promissora para investigar as alterações conformacionais na estrutura da proteína mutante com relativamente à sua conformação nativa [22] – [29]. Sabe-se que a mudança na orientação conformacional de uma molécula de proteína afecta a sua interacção com o ligando, bem como os seus parceiros biológicos. Neste trabalho focado nosso estudo em investigar as mudanças no comportamento dinâmico de domínio AKT1 PH induzida pelo câncer causando mutação E17K. Investigações anteriores demonstraram que a mutação E17K tem um potencial papel na indução de alterações significativas na conformação do domínio PH-AKT1, bem como em induzir resistência contra AKT1 /2 VIII inibidor [1]. Realizamos MDS no noção de inferir as mudanças conformacionais que ocorrem na estrutura mutante que pode contribuir para as alterações moleculares observadas e os resultados patológicos associados. Além disso, os estudos de ancoragem também ajudou a determinar as alterações na afinidade de interacção ligando de proteína. No geral, nossos resultados forneceram uma forte evidência de grande ocorrendo desvio conformacional na proteína mutante em comparação com o nativo.

Materiais e Métodos

Os conjuntos de dados

Nós selecionados estruturas cristalinas de natal PH (PDB ID: 1UNP), estrutura E17K (PDB ID: 2UZS) ea estrutura do AKT1 /2 inibidor VIII (PDB ID: 3O96) a partir de Brookhaven Protein Data Bank [30] para a nossa investigação. As estruturas obtidas foram de energia minimizado usando GROMOS96 43a1 campo de força através gromacs 4.5.4.package [31].

Cation-π Interações

interações Cation-¸ foram calculados usando o programa de captura [32]. interações cátion-¸ em estruturas de proteínas foram identificados e avaliados por meio de um critério baseado em energia para a seleção de pares de cadeia lateral significativos. A composição percentual de um resíduo de aminoácido específica para contribuir para interacções catiões π é obtido a partir da equação: onde “i” representa os cinco resíduos (Lys, Arg, Phe, Trp e Tyr),

N

cat-π é o número de resíduos envolvidos em interacções catiões π, e

N

(i) é o número de resíduos de tipo “I” nas estruturas proteicas considerados.

o Furthere interação cátion-π é cada vez mais reconhecida como uma importante interacção de ligação não covalente relevantes para biologia estrutural. Ele usa uma variante dos potenciais otimizadas para campo simulações líquidos (OPLS) a força para fornecer uma avaliação energética de todas as potenciais interações cátion-π em uma proteína. A energia eletrostática () é calculada usando a equação: onde e são os encargos para os átomos

i

e

j

, respectivamente, e é a distância entre eles. A energia de van der Waals é dada por:

Onde e; e são o van der Waals raio e profundidade do poço, respectivamente.

Se ≤-2,0 kcal /mol, o par é contado como uma interação cátion-π. Se -1.0 kcal /mol, a estrutura é rejeitada. Se -2,0 ≤-1,0 kcal /mol, a estrutura é mantida apenas se ≤-1,0 kcal /mol

A ligação do ligando análise da fossa

Ligando cavidade de ligao de estrutura do domínio PH foi AKT1. examinado por ferramenta CASTp [33]. CASTp implementa triangulações regulares incrementais, comumente referido como triangulação de Delaunay ponderada e do complexo alfa para medir a complementaridade forma dada macromolécula. Ele também mede os bolsos acessíveis de superfície e as cavidades interiores que são inacessíveis. Medidas siga os cálculos analíticos área e volume de cada bolso e cavidade [33] de identificação.

Análise Complementaridade

Foi utilizado o PatchDock servidor web [34] para calcular a complementaridade dos AKT1 inibidor /2 domínio PH VIII e AKT1. O princípio subjacente a este servidor é baseado na representação molecular forma, a correspondência remendo de superfície além de filtragem e de pontuação. É destinado a encontrar transformações de encaixe que produzem boa forma complementaridade molecular. Tais transformações, quando aplicada, induzir ambas as áreas de interface de largura e pequenas quantidades de confrontos estéricos. algoritmo de segmentação é implementated para detecção de manchas geométricas. Os patches são filtrados, de modo que apenas as amostras com resíduos de ‘hot spot’ são mantidas. Além disso, as técnicas híbrida do Geometric Hashing e Pose-Clustering correspondentes são implimented para coincidir com os patches. Todos os complexos com penetrações inaceitáveis ​​dos átomos do receptor para os átomos do ligando são descartados. Finalmente, os restantes candidatos são classificados de acordo com uma contagem geométrica forma complementaridade. coordenadas 3D de estruturas nativas e mutantes foram submetidos a acoplamento com AKT1 /2 inibidor VIII.

Análise de ancoragem

estudos de docking molecular foram realizadas para investigar o papel da mutação que afecta o inibidor de AKT1 /2 atividade de ligação VIII do domínio kinesin usando AutoDock 4.0 [35]. AutoDockTools 1.4.6 foi utilizado para estabelecer os pontos AutoGrid, bem como a visualização de estruturas Ligando de Ácido-amino ancorados [35]. Grelha mapa centrado sobre os ligandos locais de estruturas nativas e mutantes de ligação foram construídos de modo a cobrir as bolsas de ligao de AKT1 /2 inibidor VIII. algoritmo genético Lamarckian foi usado para realizar simulações de docking molecular. As simulações foram realizadas utilizando-se para 2,5 milhões de avaliações de energia com um máximo de 27000 gerações. Os menores conformações de energia foram considerados como as conformações de ligação entre AKT1 /2 inibidor VIII e PH domínio.

Simulação de Dinâmica Molecular

Simulação de Dinâmica Molecular foi realizada utilizando gromacs 4.5.4 pacote [31] . Estruturas de PH nativa e mutante foram utilizados como ponto de partida para simulações de DM. Sistemas foram solvatados em uma caixa retangular com moléculas de água TIP3P em 10 raio marginal Å. Em pH fisiológico das estruturas foram encontrados para ser negativamente carregada, assim, a fim de tornar o sistema de simulação eletricamente neutro, nós adicionamos 2 íons cloreto (CL

-) na caixa de simulação usando a função “Genion” que acompanha com o pacote gromacs . Inicialmente, as moléculas de solvente foram relaxadas enquanto todos os átomos de soluto foram harmonicamente restringido às suas posições originais, com uma constante de força de 100 kcal /mol para 5000 passos. foi usada Emtol critério de convergência de 1.000 kcal /mol e fourierspacing de 0,12 nm. Após isto, o sistema molecular todo foi submetido a minimização de energia usando o método do gradiente conjugado. Berendsen método de acoplamento da temperatura [36] foi usada para regular a temperatura no interior da caixa. acoplamento pressão isotrópica foi realizada usando o método Parrinello-Rahman. interacções electrostáticas, foram calculados usando o método de partículas de malha Ewald [37]. Os estados de ionização de os resíduos foram conjunto apropriado para pH 7 com todas as histidinas assumido neutro. A pressão foi mantida a 1 atm com a gama de compressibilidade permitido de 4.5e

-5 atm. AGITAÇÃO algoritmo foi utilizado para restringir comprimentos de ligação envolvendo hidrogênio, permitindo um intervalo de tempo de 2 fs. Van der Waals e Coulomb interações foram truncados a 1,0 nm. A lista não ligados par foi atualizado a cada 10 passos e conformações foram armazenados a cada 0,5 ps. Posição simulação de contenção para 2000 ps foi implementado para permitir que moléculas de solvente de entrar na região da cavidade da estrutura. Finalmente, os sistemas foram submetidos a simulação MD durante 50 ns. Calculamos a análise comparativa dos desvios estruturais na estrutura PH nativa e mutante. RMSD, RMSF, SAS e análise Rg foram realizadas usando g_rms, g_rmsf, ​​g_sas e ferramenta g_gyrate respectivamente. Número de ligações de hidrogénio distintos formados por resíduos específicos para outros aminoácidos dentro da proteína durante a simulação (NHbond) foi calculada usando g_hbond. NHbond determinada com base no dador-aceitador distância menor do que 0,35 nm e de doador-aceitador-hidrogénio. Os gráficos foram traçados usando Graça GUI Toolkit 5.1.22 versão.

Resultados e Discussão

Carpten et al. (2007) propuseram que a mutação E17K tinha causado maior elevação da actividade AKT1 [1]. De acordo com as conclusões apresentadas no seu trabalho, a mutação faz com que uma mudança significativa na conformação do domínio PH AKT1 que em última análise conduz a mais de fosforilação, 4,5 origem dobra na sua tendência a localização da membrana e elevação da actividade da quinase, que pode conduzir ao cancro [1] – [6]. Além disso, a mutação faz com que a perda na ligação com AKT1 /2 inibidor VIII. Embora os resultados experimentais apresentaram a visão geral marginal do mecanismo molecular associado com a mutação E17K, ainda não temos a explicação detalhada do fenótipo observado a nível molecular e atômico. A fim de compreender as mudanças estruturais e moleculares associados, realizamos acoplagem molecular e simulação de dinâmica molecular. Os resultados obtidos em nosso estudo forneceu inferências interessantes, que aponta para a rápida desvio conformacional no domínio E17K PH. Primeiro examinamos a cavidade do domínio AKT1 PH utilizando a ferramenta CASTp ligação do ligante mais acessível. A partir dos resultados CASTp, ficou claro que os resíduos 38 a 52 e as posições de aminoácidos 77 a 87 formam as regiões da cavidade mais acessíveis para a interacção do ligando. Para examinar a alteração na afinidade de ligação na proteína nativa e mutante, realizamos uma análise mais aprofundada complementaridade com a ferramenta patchdock. Em resultados patchdock a pontuação total de ancoragem de mutante com ligando foram encontrados para ser menor em comparação com a estrutura nativa (Tabela 1).

Análise de ancoragem Molecular foi realizada utilizando AutoDock pacote 4.0 para desvendar as mudanças na AKT1 /2 VIII inibidor de afinidade na estrutura de ligação do mutante, em comparação com nativa. Uma perda notável de afinidade de interacção foi observada na estrutura mutante, em comparação com nativa. Em nativa a energia de ligação óptima era -12,32 kcal /mol enquanto que no mutante verificou-se ser -3,87 kcal /mol (Tabela 1). Uma melhor compreensão das alterações na interacção molecular pode ser visto na Fig. 1. Observou-se um total de interacções de resíduos de ácido 6 amino com AKT1 /2 inibidor VIII na estrutura nativa, enquanto que no mutante houve apenas uma interacção encontrado. Além disso, os padrões de interacções nativas não foram retidas na estrutura de mutante. Os resíduos Met 1, Ser 2, 3 Asp, Gln 59, Gln 79 e Arg 86, que foram participam activamente na interacção inibidor em nativo, não mostraram qualquer papel na estrutura mutante (Fig. 1). Essas interações moleculares revelaram as consequências prejudiciais da mutação no AKT1 /2 inibidor VIII interação afinidade do domínio PH.

Estrutura da esquerda mostra nativa /2 inibidor VIII complexo e estrutura PH AKT1 à direita mostra PH mutante ( E17K) -. AKT1 /2 inibidor VIII complexo

interações proteína-ligante foram muitas vezes acompanhado por mudanças significativas na sua conformação. Assim, para investigar a causa raiz do AKT1 /2 inibidor VIII obrigatório perda de afinidade na estrutura mutante e compreender as consequências estruturais da mutação E17K, realizamos dinâmicas de simulação molecular de espécies nativas eo domínio AKT1 PH mutante. Nós investigamos RMSD, RMSF, Rg, SASA ea variação NHbond, e as flutuações distância entre os resíduos que interagem importantes na estrutura nativa e mutante. RMSD para todos os átomos de C a partir da estrutura inicial foram calculados que foram considerados como a origem central para medir o sistema de proteína. Aqui o RMSD mede a distância média entre os átomos de proteína nos dois estados consecutivos. Na Fig. 2 e fig. 3, a proteína PH nativa e mutante mostraram forma distinta de desvio até 13 ns de sua estrutura inicial, resultando em RMSD backbone ~0.3 em nativa e ~0.4 no mutante. Depois de 13 ns, a proteína mutante de PH mostraram padrão desvio extremo até o fim da simulação quando comparado com nativa. No 13137 PS a estrutura mutante mostrou um aumento brusco do valor RMSD atingindo até 3,36 nm e ainda mais voltou a 0,44 nm a 16078 PS (Fig. 2, Fig. 3). Esta tendência de flutuação continuou na estrutura mutante até ao fim e mostraram desvios extremos quando comparados com nativa. Além disso, o mutante estendeu a mão para seu nível mais alto RMSD em 35931 ps, chegando a 4,9 nm. Todos estes dados sugerem do que a estrutura mutante foram submetidos a desvio conformacional distinta por toda a simulação, que tais desvios não foram observadas na estrutura nativa. Os desvios acima conformacionais observados foram ainda mais em concordância com os resultados obtidos pela análise de variação da estrutura secundária dependentes do tempo através da análise DSSP. Os resíduos terminais estrutura mutantes mostraram desvio conformacional da alfa-hélice de dobrar forma, enquanto tal deriva não foi visto na estrutura nativa (Fig. 2). Além disso, desvios extremos conformacionais foram observados no mutante entre 25 ns 35 ns-. A quantidade de curvas aumentou consideravelmente após 34 ns instante temporal em estrutura mutante (Fig. 2). Particularmente na região do resíduo de 80-105, forma distinta de desvio conformacional de hélice alfa de dobrar e forma de bobina foram observadas na estrutura de mutante (Fig. 2), e é mostrado na Fig. 4. Todos os resultados foram intimamente em concordância com os desvios RMSD (Fig. 2, a Fig. 3, Fig. 4). Temos também mostraram as estruturas sobrepostas para nativa e mutante no início da simulação e para intervalos de tempo específicos, quando os desvios conformacionais ocorreram em maior gama (Fig. 2). Parecia que também se o rápido deriva tinha causado certas transições de domínio e mudanças de conformação na estrutura mutante, especialmente na região do terminal C do domínio PH, em comparação com nativa.

Figura mostrada no topo representa nativa e enredo DSSP mutante. No meio, as estruturas nativas e mutantes são mostradas sobrepostas. Aqui o nativo é mostrada em verde e mutante em vermelho. No fundo, o enredo RMSD é mostrado. Native é mostrado em preto e mutante em vermelho.

Native é mostrado em preto e mutante em vermelho.

Aqui o nativo é mostrada em verde e mutante em vermelho.

com o objectivo de determinar se a mutação afetou o comportamento dinâmico de resíduos e examinar a causa de tais desvios de conformação observadas no resultado RMSD e PSSD, foram calculados os valores RMSF de resíduos de backbone nativas e mutantes ( A Fig. 5). RMSF valores de resíduos mutantes foram encontrados para ser significativamente mais elevada na estrutura de mutante em comparação com a nativa (Fig. 5). Isso mostrou que a deriva observada foi acompanhada por aumento flutuações atômicas na estrutura mutante. O raio de giro (Rg) é definida como a raiz de peso médio de massa do quadrado da distância do conjunto de átomos de seu centro de massa comum. Por isso, dá uma visão sobre a dimensão global da proteína e tem ajudado a examinar a noção de rápidos desvios de conformação observadas na estrutura do mutante. O raio de giração para o lote átomos Ca de proteína em função do tempo a 300 K é mostrado na Fig. 6. As flutuações Rg na estrutura mutante foram muito semelhantes às alterações observadas RMSD acima. Depois 13137 ps foram observadas uma elevação abrupta nos valores Rg na estrutura mutante, chegando a seu nível mais alto de 4,1 nm, enquanto o valor Rg da estrutura nativa manteve-se em 1,5 nm. Além disso, no 35931 ps chegou até o valor máximo de 5,62 no mutante. No final da simulação, a estrutura mutante mostrou valor Rg de 4,16 enquanto que em nativa foi encontrado para ser 1.42.

Native é mostrado em preto e mutante em vermelho.

( a) flutuações completos Rg. (B) restrito a limite máximo superior Rg de 6 nm. Native é mostrado em preto e mutante em vermelho.

contas da área de superfície de acessibilidade solvente para área de superfície bimolecular avaliável para moléculas de solvente. Elevação no valor do SASA na estrutura mutante denota que é expansão relativa, em comparação com nativa. A mudança de SASA de proteína nativa e mutante com o tempo é mostrada na Fig. 7. proteína mutante indicou maior valor da SASA com o tempo, enquanto nativa apresentaram menor valor SASA. Mais flutuação em Rg trama indicou que a proteína mutante, bem como o domínio de ligação ao ATP pode ser submetido a uma transição estrutural significativa. Isto foi ainda apoiado pelos resultados SASA, onde o mutante exibia grande SASA, em comparação com nativa. Todos estes observação sugeriu coletivamente que o mutante pode ter sofrido deriva o que levou a sua transição para uma conformação aberta e pode ter ocorrido devido às perdas de estabilidade na estrutura da proteína. Assim, para elucidar se a mutação tinha causado qualquer dano para a estabilidade estrutural da proteína durante o processo de derivação, foi investigada a flutuação total de energia por toda a simulação. Os resultados mostraram muito ligeiro aumento no valor total de energia na estrutura mutante que descartou a noção de perdas de estabilidade induzida por mutação (Fig. 8).

Native é mostrado em preto e mutante em vermelho.

Native é mostrado em preto e mutante em vermelho.

ligação de hidrogênio é o principal fator para a manutenção da conformação nativa da proteína e flexibilidade da proteína é diretamente proporcional à NHbonds intramolecular entre os resíduos de aminoácidos [38] – [40]. análise NHbond intramolecular de proteínas nativas e mutantes foram realizadas em função do tempo, a fim de entender a relação entre a flexibilidade e a formação da ligação de hidrogénio. estrutura do mutante mostrou um número significativamente menor de formação NHbond durante a simulação quando em comparação com a estrutura nativa (Fig. 9). Esta observação foi em concordância com o aumento dos valores Rg e SASA no mutante e sugerem fortemente que os desvios observados conformacionais e aumento em flutuações atómicas pode ter despertado, devido à perda de formação NHbond em proteínas. Além disso, os resíduos de aminoácido K30, K32, W36, R38, R40, Q53, R56, K57 e V58 tinha sido mostrado para ser componentes activos na sua localização a membrana [41]. Assim, foi calculado o número de NHbond formando por esses resíduos para estudar o efeito da mutação sobre a localização da membrana. Embora o número total de NHbonds formadas na estrutura de mutante foram significativamente mais baixos em comparação com nativo, o número total de NHbonds formados nestes resíduos não sofrem de quaisquer grandes perdas impostas pela mutação. Perda na formação NHbond foi observada em resíduos K30 e Q53, ao passo que outros resíduos, quer tenha apresentaram maior número de NHbonds ou mantida a contagem nativa de NHbonds toda a simulação na estrutura de mutante (Fig. 10). Estes resultados foram também em forte concordância com a observação relatado por Carpten et al., (2007) [1], onde foi demonstrado que a mutação tinha causado aumento significativo no potencial localização da membrana de proteína. O aumento na formação NHbond nestes resíduos poderia ser um forte fator para explicar o aumento do potencial de localização da membrana de proteína mutante.

Native é mostrado em preto e mutante em vermelho.

(a) K30 (b) K32 (c) W36 (d) R38 (e), R40 (f) Q53 (g) R56 (h) K57 (i) V58. Native é mostrado em preto e mutante em vermelho.

A importância da interação cátion-π tinham sido examinados em diversas pesquisas para o seu papel correspondente na manutenção da estabilidade de proteínas. Investigamos um total de 3 interacções catiões π energicamente significativas incluindo Arg86-Phe55 (Fig. 11a), Lis8-Trp99 (Fig. 11b) e Arg69-Trp22 no domínio PH AKT1 (Fig. 11c). Para examinar se as interações cátion-π são mantidos na estrutura mutante, investigamos ainda mais as flutuações comprimento de ligação para estes distante interação cátion-π. Foi notável observação de que as interacções catiões π em nativa, bem como mutantes foram retidas. Além disso, a interação Arg69-Trp22 mostrou padrão de flutuação distinta e pode estar jogando papel influente na indução de desvio conformacional (Fig. 11-C). Ao estudar coletivamente todas as mudanças estruturais e moleculares para o domínio PH AKT1 poderíamos dizer que a deriva conformacional observado, subir em flutuações atômicas e perda do total NHbonds na estrutura mutante contribuiu significativamente em causar consequências patológicas observadas impostas por mutação E17K. Além disso, o aumento de 4 vezes no potencial de membrana de localização pode ter sido induzida por aumento da NHbonds em resíduos de localização activos do domínio PH. Estas observações levaram-nos a concluir que o cancro associado fenótipo observado no caso da mutação E17K domínio AKT1 PH é causado pelas alterações moleculares e conformacionais relatados que também causam resistência à AKT1 /2 inibidor VIII através da indução de forma deriva na sua bolsa de ligao correspondentes .

(a) Arg86-Phe55 (b) Lis8-Trp99 (c) Arg69-Trp22. Native é mostrado em preto e mutante em vermelho.

Conclusão

de aminoácidos variantes geralmente induz resultados patológicos por danificar a conformação nativa da proteína. A mutação E17K no domínio PH AKT1 tinha sido relatado para induzir o cancro e resistência à AKT1 /2 inibidor VIII. Para examinar o mecanismo molecular detalhada por trás de tal resultado, realizamos molecular de ancoragem e dinâmica molecular simulação da estrutura nativa e mutante. As interações de estabilidade e de aminoácidos importantes foram retidos na estrutura mutante, que descartou a possibilidade de efeitos prejudiciais da mutação. Além disso, um aumento abrupto na RMSD valores e desvios conformacionais foram observadas em sructure mutante. Além disso, a resistência à AKT1 /2 VIII poder inibidor tinha sido causado pelas alterações na estrutura conformacional da bolsa de ligação. Em conclusão, o resultado global exaplained que a causa molecular de 4 aumento vezes na localização de proteínas mutantes e atividade da quinase, que tem em última análise, causado câncer associado fenótipos.

Reconhecimentos

Agradecemos a gestão de Instituto Vellore, da Universidade de Tecnologia e Prof Riccardo Zecchina de HuGeF-Torino para fornecer as facilidades para realizar este trabalho.