Abstract

O desenvolvimento de agentes de produtos naturais com estratégias focalizadas é promissor para a terapia anticâncer aumentado com efeitos colaterais reduzidos associados à droga. O resveratrol encontrado no vinho tinto, possui actividade anti-cancro em vários tipos de tumores. Nós relatado anteriormente em um novo alvo molecular de resveratrol, a proteína associada a uma metástase (MTA1), que é uma parte de remodelação dos nucleossomas e desacetilação (NURD) complexo co-repressor, que medeia o silenciamento do gene. Foram identificados resveratrol como um regulador do complexo MTA1 /NURD e re-activador de acetilação p53 no cancro da próstata (CaP). No estudo atual, abordamos se análogos de resveratrol também possuem a capacidade de inibir MTA1 e inverter p53 desacetilação. Nós demonstramos que pterostilbene (PTER), encontrada em blueberries, tiveram maior aumento na acetilação p53 mediada por MTA1, confirmando potência superior sobre resveratrol como agente epigenético dietético. Em ortotópico CaP xenoenxertos, resveratrol e o crescimento do tumor inibiu significativamente PTER, progressão, metástase e invasão local espontânea. Além disso, MTA1-knockdown células a estes agentes, resultando em redução adicional de progressão tumoral e metástase sensibilizados. A redução foi dependente de sinalização MTA1 mostrando aumento da acetilação p53, um índice de apoptose e menos angiogênese

in vivo

em todos os xenoenxertos tratados com os compostos e, particularmente, com PTER. Ao todo, os nossos resultados indicam MTA1 como um dos principais contribuintes no tumor da próstata progressão maligna, e apoiar o uso de estratégias de segmentação MTA1. Nossos dados pré-clínicos indicam fortes PTER como um potente, selectivo e farmacologicamente seguro produto natural que pode ser testado em CaP avançado

Citation:. Li K, Dias SJ, Rimando AM, Dhar S, Mizuno CS, Penman AD, et ai. (2013) pterostilbene Atos até Proteínas Associadas Metástase 1 para inibir Tumor crescimento, progressão e metástase de câncer de próstata. PLoS ONE 8 (3): e57542. doi: 10.1371 /journal.pone.0057542

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 26 Setembro, 2012; Aceito: 25 de janeiro de 2013; Publicação: 01 de março de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. O estudo foi parcialmente financiado pelas subvenções do programa de suporte Intramural Research (# 59927 e # 68100231012) da Universidade de Mississippi Medical Center para ASL. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores declararam não existem interesses conflitantes

Introdução

tratamento

o câncer de próstata (PCA) ainda representa uma necessidade médica não atendida. polifenóis dieta de derivados, incluindo estilbenos, são candidatos clínicos atraentes para quimioprevenção do câncer primário e secundário devido à sua capacidade de não só bloco ou inibir a iniciação da carcinogênese, mas também para reverter os estágios promocionais. Esta última característica torna esses compostos promissores agentes terapêuticos. Resveratrol (Res) e outras estilbenos naturais são fitoalexinas que são produzidos pelas plantas em resposta ao estresse ambiental [1]. Resveratrol tem actividades cardioprotectores, anti-inflamatórios e anti-cancerígenos [2], [3]. As ações anticâncer do resveratrol envolver a regulação de alvos moleculares múltiplas e diversas e são mediadas por indução de parada do ciclo celular e apoptose [4] – [8] e inibição da angiogênese [9] – [13].

recentemente descoberto que o resveratrol regula negativamente associado a metástases proteína 1 (MTA1) em CaP [13]. superexpressão MTA1 está correlacionada com os parâmetros clínico que caracterizam a agressividade do tumor: metástase linfonodal, notas altas tumorais e angiogênese em vários tipos de câncer [14] – [19]. Nos tecidos da próstata humana, um nível MTA1 alta foi associada com hormônio-refratário CaP [15]. Nós inicialmente identificado MTA1 como participante romance no “ciclo vicioso” do CaP metástase óssea, e ainda demonstrado que a intensidade da coloração e localização nuclear de MTA1 em tecidos humanos foram correlacionados com a agressividade do APC e das lesões metastáticas ósseas [19]. Nós também estabeleceu que MTA1 tinha pró-sobrevivência, anti-apoptótica, propriedades invasivas e pró-angiogénicos em CaP

in vitro

e

in vivo

[19].

MTA1 é uma parte do complexo de remodelação dos nucleossomas e desacetilação (NURD) co-repressor envolvido na histona e desacetilação proteína não histona e regulação transcricional específica do gene de [20], [21]. O complexo também contém histona desacetilases 1 e 2 (HDAC1 e 2). Nós anteriormente mostraram que a degradação induzida pelo resveratrol MTA1 desestabiliza o complexo desacetilação MTA1 /HDAC /NURD levando ao aumento da acetilação /activação de p53 supressora de tumores em células de CaP [13]. MTA1 silenciar através RNAi sensibilizado significativamente as células APC, para acetilação p53 dependente de resveratrol e apoptose. Esta actividade inibidora de HDAC-like de resveratrol foi adicionalmente suportado pelas experiências com combinação clinicamente aprovado suberoilanilida do ácido hidroxâmico inibidor de HDAC (SAHA), em que o resveratrol sinergicamente aumentada p53-acetilação e a apoptose [13]. Nós também demonstraram que as células mta1 knockdown tinha suprimido invasão e atividade angiogênica

in vitro

, e atrasou a formação de tumores e desenvolvimento em xenoenxertos subcutâneos [19]. Tomados em conjunto, definimos um novo mecanismo epigenético da atividade anticâncer do resveratrol mediada através do regulador epigenética negativo, MTA1.

Apesar de suas propriedades promissoras, rápido metabolismo do resveratrol e baixa biodisponibilidade ter impedido seu avanço para o uso clínico [2] , [22] – [24]. As limitações do resveratrol levaram o nosso interesse em análogos naturais e sintéticos com farmacocinética melhorada e potência farmacológica superior que detêm maior potencial como drogas anticâncer de produtos naturais [25]. No entanto, como análogos de resveratrol comparar uns com os outros em termos de potência e de mecanismos de acção é, em grande parte desconhecida. O

in vivo

efeitos são principalmente inexplorado para os análogos de resveratrol, o que torna difícil para selecionar quais analógica (s) é o melhor para o desenvolvimento clínico.

No presente estudo, foi realizada uma análise comparativa de resveratrol e seis análogos na sua capacidade para inibir a expressão MTA1 e de sinalização, e focada sobre anticancerígeno mediada por MTA1 e efeitos antimetastáticos do análogo mais potente, PTER, utilizando xenoenxertos de CaP ortotópicos. Nossos resultados indicam MTA1 como um alvo poderoso para intervenção do PTER dietético como terapêutico de drogas produto natural para a terapia anticâncer em CaP primário e metastático.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todo o trabalho animal foi conduzido de acordo com protocolo aprovado animais # 1272 pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal da Universidade do Centro Médico Mississippi e credenciada pela Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório de animal Care International, em conformidade com a política dos EUA Serviço de Saúde Pública como assegurado pelo Gabinete do laboratório de Bem-Estar animal.

Materiais

Resveratrol e piceatannol (PIC) foram obtidos a partir de fontes comerciais (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO e Calbiochem-Novabiochem Corp. , San Diego, CA, respectivamente). Pterostilbene foi sintetizado de acordo com procedimentos publicados [26] trimetoxi-resveratrol (3M-Res) e (

E

) -4- (3,5-dimetoxiestiril) anilina (DMSA) foram sintetizados de acordo com métodos previamente descritos [27 ]. Triacetil-resveratrol (3AC-Res) e resveratrol 3,5-diacetil (2AC-Res) foram sintetizados como se segue: a 18 mg de resveratrol dissolvidos em 500 mL de MeOH, adicionaram-se 10 gotas de piridina e 500 mL de anidrido acético. A mistura foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. Acetato de etilo (EtOAc) foi adicionado à mistura reaccional, e depois repartiu-se com água para remover a piridina. A camada de EtOAc foi concentrada sob uma corrente de azoto, e manchada sobre uma placa de cromatografia em camada fina. A placa foi desenvolvida utilizando o sistema solvente de 30% de EtOAc: 70% de hexano. As bandas de 3AC-Res (Rf 0,8) e 2AC-Res (Rf 0,6) foram raspadas da placa e extraiu-se com EtOAc. As estruturas de 3AC-Res e 2AC-Res foram determinadas por ressonância magnética nuclear e espectrometria de massa. As estruturas de todos os outros estilbenos também foram confirmadas por espectroscopia. A pureza dos compostos foi determinado como sendo 99%. Os compostos foram dissolvidos em alta pureza etanol ou DMSO e armazenado no escuro a -20 ° C antes da utilização em ensaios.

Cultura celular

células LNCaP e DU145 CaP foram adquiridos da American Type Coleção de Culturas (ATCC). células PC3M foram uma oferta do Dr. R. Bergan (Northwestern University, Chicago, IL) [28], [29], e RWPE-1, células epiteliais da próstata imortalizadas “normais”, foram um presente do Dr. C. Lee ( Northwestern University, Chicago, IL) [30]. CaP células foram cultivadas em meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS, 5% de penicilina /estreptomicina como anteriormente descrito [13], [19]. células RWPE-1 foram cultivadas em meio de crescimento completo ATCC, que contêm meio isento de soro base de queratinócitos suplementado com extracto de pituitária bovina e o factor de crescimento epidérmico humano recombinante. As células foram mantidas numa incubadora a 37 ° C com 5% de CO

2. Meio foi substituído com fenol RPMI-1640 vermelho-livre com soro despojado carvão 5% 16-18 h antes de resveratrol /análogos tratamentos para fornecer fundo livre de esteróides.

Análise Western Blot

a análise por western blot foi realizada tal como descrito anteriormente [13], [19]. Resumidamente, as células foram tratadas com várias concentrações de análogos de resveratrol, ou durante 24 horas. As células foram lavadas com PBS frio e lisaram-se por tampão de lise RIPA e extracção contendo fosfatase Halt e Cocktail de Inibidor de Protease (Thermo Scientific). A concentração de proteína foi medida utilizando o reagente de ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Quantidades iguais de proteína (40-70 ug) foram resolvidas em 7-10% de Tris-TGX géis Ready e transferido para uma membrana PVDF por Mini Trans-Blot Electrophoresis Sistema de Transferência (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). As membranas foram depois bloqueadas com TBS-Tween e 5% de leite em pó durante 2 horas à temperatura ambiente e sondadas com MTA1, AR, p53 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ou Ac-p53 (K381) (Abcam) anticorpos. As membranas foram então sondadas com anticorpos p-actina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) como um controlo de carga. Os sinais foram visualizados usando quimioluminescência aumentada. A densitometria foi feita usando o programa Image J. dosagem efectiva (> 50

Geração de células estáveis ​​com a Tag luciferase

células DU145 mta1-knockdown foram previamente estabelecidos utilizando a expressão de detenção vetores GIPZ lentiviral shRNAmir expressando MTA1shRNA ou-silenciando não vector vazio (EV, Open Biosystems) e foram caracterizado

in vitro

e

in vivo

[13], [19]. Os vectores que continham a proteína verde fluorescente (GFP) e um gene de resistência à puromicina. Embora as células demonstraram alta GFP sinais

in vitro

, o

In vivo

experiências foram bem sucedidas devido a sinais de alta fundo dos tecidos animais. Como bioluminescência tem alta relação sinal-ruído em comparação com fluorescência, nós transduzidas células com a luciferase lentiviral (Luc) construir (uma oferta do Dr. R. Graeser, Departamento de Oncologia Médica, Freiburg, Alemanha) e clones estáveis ​​selecionados usando puromicina. populações de células clonais foram expandidas

In vitro

e testado para a sua actividade de luciferase (veja abaixo). Vários clones brilhantes foram repetidamente selecionado novamente e agrupados por células com alta expressão de luciferase para ser usado

in vivo.

In vitro

e

in vivo

Bioluminescent imagem

In vitro

e

in vivo

bioluminescência (BL) foi realizada utilizando um espectro IVIS (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Imagens e detecção de sinais BL foram adquiridos e analisados ​​por meio de Imagem Vivendo Software V. 4.1. Para

in vitro

de imagem, as células marcadas com luciferase foram diluídos em série em uma, clara placa de 96 poços de fundo preto (Costar, Corning, NY). D-luciferina (150 ug /ml) foi adicionada aos poços, a placa foi incubada a 37 ° C, 5% de CO

2 durante 10 min, após o que foram tiradas imagens. Para

in vivo

imagem BL, os ratos anestesiados foram injectados por via intraperitoneal (i.p.) com 150 mg /kg D-luciferina (Caliper) e colocado dentro da caixa de câmera por 10 min. A exposição contínua a 2% de isoflurano sustentada sedação durante o exame. o tempo de aquisição foi de normalmente um máximo de 3 minutos com auto-exposição, dependendo do BL de tumores. As medições de luz emitida foram realizados para as regiões de interesse (ROI) e quantificados como de fluxo de fótons (fotões /sec /cm 2 /SR). A normalização foi realizada para todas as imagens no final da experiência. imagens em escala de cinza de ratos também foram coletadas em cada sessão. A detecção de metástases durante o experimento foi contaminado por um forte sinal primário resultante em sinais falsos-positivos. Portanto, no fim do experimento, o sinal primário isolado por excisão do tecido circundante da próstata e do músculo para expor órgãos em cavidade abdominal. Rins, fígado e pulmão /coração de cada rato foram isolados e

ex vivo

fotografada pelo aumento binning e F /stop.

ortotópico CaP xenoenxertos

Sete semanas de idade ratinhos nus masculinos (Fox n1nu, Harlan) foram alimentados sem fitoestrógeno AIN-76A dieta do dia recebeu. Os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos principais antes da cirurgia e posteriormente injectados com células DU145-MTA1shRNA-Luc (MTA1shRNA) DU145-EV-Luc (EV) ou. Durante os ratinhos foram anestesiados cirurgia com 2% de isoflurano, um 7-9 mm da linha média abdominal incisão foi feita, e a próstata foi exposto. 2,5 × 10

6 células de cada linha celular, em 20 ul de PBS e Matrigel, foram injectadas na próstata anterior. A ferida foi suturada, ea pele foi fechada com Autoclips. Os animais foram monitorados de perto após a cirurgia e clipes foram removidos no dia 10. Os tumores colonizados e cresceu durante 14 dias. Os ratinhos que desenvolveram tumores em cada grupo foram divididos aleatoriamente em três subgrupos (n = 6) com i.p. diariamente administração de 10% DMSO controlo simulado (Ctrl); 50 mg /kg de resveratrol, ou PTER. Ambos os compostos eram solúveis em DMSO a 10%, quando aquecido utilizando um banho de água. A cada semana novas soluções foram preparadas para injectáveis. Os pesos corporais e os sinais BL foram monitorizados semanalmente. Os ratinhos foram sacrificados na semana 8 após a inoculação das células. Na necropsia, próstatas e outros órgãos foram excisadas,

ex vivo

fotografada e fixados com formalina a 10% neutra tamponada (Richard Allan Scientific, Kalamazoo, MI). O soro foi também recolhido e armazenado a -80 ° C

O exame histopatológico e imuno-histoquímica

Quatro mm de espessura foram preparados a partir de parafina tumores fixados em formol e corados com hematoxilina e eosina (H . E ) utilizando um protocolo padrão. A imuno-histoquímica (IHQ) foi aplicado para avaliar Ki-67, p53, p53 Ac-(K381), M30 e CD31 como previamente descrito [19]. Resumidamente, os cortes foram desparafinados, re-hidratados com xileno e descidas de álcool e água. A recuperação antigênica foi realizada por fervura as lâminas em Antigen Unmasking Solution (Vector Labs, CA) durante 30 minutos em um navio. As lâminas foram arrefecida e a actividade da peroxidase endógena foi extinta com 3% H

2O

2 em etanol durante 5 min. O bloqueio foi realizado em conformidade com os anticorpos apropriados utilizados para a coloração utilizando o kit Vectastain ABC Elite (Vector Labs, CA). As secções foram incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos seguintes: anti-Ki67 (1:100) e anti-p53 (1:100, Santa Cruz Biotechnologies, CA), anti-CD31 (1:100) e anti-Ac- p53 (1:100, Abcam, MA) e anti-M30 (1:100, Roche Diagnostics, GmbH, Alemanha). As secções foram lavadas e incubadas com anticorpos secundários apropriados a partir do kit ABC e coloração foi revelada utilizando o kit de IMMPACT DAB (Vector Labs, CA). As lâminas foram contrastadas em hematoxilina, desidratadas e montadas. As imagens foram visualizadas e gravadas em Nikon Eclipse E400 microscópio. O software ImageTool foi usado para contar as células positivamente coradas em cinco campos selecionados aleatoriamente.

Análise de Resveratrol e Pterostilbene conteúdo em Murino soro por cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS)

Serum , armazenado no congelador a -80 ° C antes da sua utilização, foi centrifugado a 4 ° C durante 15 min e tratou-se com 80 mL de β-glucuronidase (1250 U /ml de tampão fosfato de potássio 75 mM, pH 6,8 a 37 ° C). A mistura foi incubada a 37 ° C com agitação a 750 rpm, durante 17,5 horas, arrefecida até à temperatura ambiente, em seguida repartida entre 75 mL de EtOAc. A camada de EtOAc foi seca sob uma corrente de azoto, derivatizados com 30 mL de 01:01 mistura de N, O-bis [trimetilsilil] trifluoroacetamida e dimetilformamida (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) e utilizado para a análise. A análise de GC-MS foi realizada utilizando um JEOL GCMate II Instrumento (JEOL, EUA Inc., Peabody, MA) com um J W DB-5 de coluna capilar (diâmetro interno 0,25 mm, 0,25 mm de espessura de filme, 30 mm de comprimento; Agilent Technologies , Foster City, CA). O programa de temperatura GC foi: inicial 190 ° C, mantida durante 1 min, aumentada para 244 ° C à taxa de 30 ° C /min e mantida a esta temperatura durante 0,5 min, aumentada para 246 ° C a uma taxa de 0,5 ° C /min e mantida durante 0,5 min, aumentada para 280 ° C à taxa de 20 ° C /min e mantida durante 2 min e, em seguida, finalmente, aumentada para 300 ° C à taxa de 30 ° C /min e mantida durante 0,8 min. O gás transportador foi hélio ultra-elevada pureza, em 1 mL de caudal /min. A porta de injecção foi mantida a 250 ° C, a interface de GC-MS a 230 ° C, e a câmara de ionização a 230 ° C. O volume de injecção foi de 2 mL (injecção splitless). O espectro de massa foi adquirida no modo de monitoramento de íons selecionados, impacto de electrões 70 eV. Pterostilbene foi monitorizada com m /z 328, 313 e 297 (tempo de retenção 11,6 min). O resveratrol foi monitorizada com m /z 444, 428 e 414 (tempo de retenção 13,7 min). A quantificação foi feita utilizando padrões externos de uma amostra comercial de resveratrol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e uma amostra sintética de PTER [31].

Análises Estatísticas

Os valores são expressos como a média ± SE ou gráficos de caixas de medições. teste t pareado de uma cauda de Student foi utilizado para analisar

in vitro

dados. Diferenças de intensidade BL tumor

in vivo

foram analisados ​​por um ou outro à base de posto ou two-way ANOVA seguido de Bonferroni análise post hoc ou pelo teste de Kruskal-Wallis. Para alguns valores de dados de análise foram log transformados. As diferenças foram consideradas significativas para p . 0,05

Resultados

Pterostilbene é um potente inibidor da MTA1 expressão em células CaP

Recentemente, descobriu que o resveratrol inibe a MTA1 modificador epigenética , que em última análise conduz a um aumento da acetilação p53 e a apoptose de células CaP [13]. Aqui, testamos seis análogos de resveratrol (Fig. 1) para determinar se eles teriam melhor atividade anticancerígena através da inibição desta alvo molecular específico. Dos análogos, PTER, piceatannol (PIC) e trimetoxi-resveratrol (3M-Res) são de ocorrência natural, enquanto dimethoxystyrylaniline (DMSA), diacetylstilbene (2AC-Res) e triacetylstilbene (3AC-Res) são derivados sintéticos. Examinámos os efeitos destes análogos sobre a expressão MTA1 em três linhas de células APC, representando estádios diferentes da progressão CaP. As células expressam MTA1 em diferentes níveis, de androgénio moderadamente elevada em LNCaP que responde e o androgénio resistente DU145 para níveis muito elevados em células metastáticas PC3M (Fig. 2a). Nós tratamos as células com diferentes doses (5-100 uM) de resveratrol /análogos para 24 horas e proteína isolada de Western blot. Houve a sub-regulação de expressão no composto MTA1-tratado, em comparação com as células tratadas com veículo (Fig. 2). Os níveis de proteína MTA1 resveratrol e análogos inibida de um modo dependente da dose, mas com diferentes potências. MTA1-inibição por análogos era específico de células: enquanto que o efeito inibidor de PTER foi comparável com o de resveratrol em células LNCaP (Fig. 2B), em células DU145, 3AC-Res, PIC e PTER foram mais potentes do que o resveratrol, mas apenas PTER teve um

50 valor ED na faixa de baixa micromolar (13,9 mM) (Fig. 2C). Em células PC3M, 3M-Res e PTER demonstrou maior potência do que o resveratrol, e mais uma vez, PTER teve a menor ED

50 valores (41,6 mM; A Fig. 2D). Portanto, entre as seis análogos testados, PTER demonstraram o mais potente MTA1-inibição em todas as três linhas de células. Pterostilbene foi inicialmente isolado a partir de madeira de sândalo e mais tarde foi encontrado em uvas e mirtilos [31], [32]. Como o resveratrol, PTER é um antioxidante potente e agente anti-inflamatório com actividade anti-cancro e quimiopreventivo [33] – [42]. Em células DU145, PTER exibiu a maior potência inibidora MTA1-(mais do que sete vezes maior do que o resveratrol). Importante, PTER demonstrou maior aumento da acetilação p53 mediada por MTA1, especialmente em células sensibilizadas MTA1-knockdown (Fig. 3), o que implica potência superior sobre resveratrol como agente epigenético dietético que controla modificações pós-translacionais das proteínas.

Resveratrol ( Res),

trans

-3,5,4′-trihidroxiestilbeno; Pterostilbene (PTER),

trans

-3,5-dimetoxiestilbeno; Trimetoxi-Resveratrol (3M-Res),

trans

-3,5,4′-trimethoxystilbene; Piceatannol (PIC),

trans

-3,5,3’4′-tetra; Dimethoxystyrylaniline (DMSA),

trans-4- (3,5-dimetoxi) anilina; Diacetil-Resveratrol (2AC-Res),

trans

-3,5-diacetylstilbene; Triacetil-Resveratrol (3AC-Res),

trans

-3,5,4′-triacetylstilbene.

A. As linhas celulares representam diferentes fases de progressão PCA:, células epiteliais da próstata imortalizadas “normais” RWPE-1; LNCaP, células andrógeno-sensível; DU145, células de androgénio-resistente; PC3M, células metastáticas agressivos. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS e antibióticos. 75 ug de proteína foram separados em gel a 10%, transferidas para membrana e sondadas com anticorpos mta1. β-actina foi um controlo de carga. Pterostilbene tem a maior potência na inibição MTA1. efeitos B. Dose dependentes de RES /análogos nos níveis de proteína MTA1 em LNCaP; em DU145 (C) e em células PC3M (D). (I) as células foram tratadas com 5-100 uM de RES /análogos durante 24 h e analisadas por imunotransferência. (Ii) representação gráfica dos resultados. O Ctrl é definido como 1 e mudanças de nível MTA1 são expressas em percentagem do Ctrl. As médias ± SE de quatro experiências independentes são apresentados. • p 0,05, # P 0,01, * p 0,001. (Iii) as doses eficazes (ED

50) foram calculados pelo método de Chou-Martin.

DU145-EV e DU145-MTA1shRNA células (Fig. S1) foram tratados com 50 mM de Res ou PTER durante 24 h e analisadas por MTA1, p53, Ac-p53 por Western blot como descrito em “Materiais e métodos”. A blot representativo é mostrado. A quantificação da relação de Ac-p53 /p53 foi realizado por software J imagem e os dados apresentados como média ± SEM de três experiências independentes

efeitos do resveratrol e Pterostilbene no crescimento do tumor ortotópico, progressão e metástase:. Envolvimento de MTA1

Temos demonstrado anteriormente que os níveis endógenos de MTA1 promover o desenvolvimento do tumor em um modelo subcutâneo de CaP [19]. No entanto, o papel de MTA1 CaP em crescimento, progressão e metástase permanece desconhecida e os efeitos do resveratrol e PTER não foram avaliadas em modelos ortotópicos de CaP. Para comparar o

in vivo

eficácia do resveratrol e PTER, e estudar o papel de MTA1 no crescimento do tumor da próstata e progressão, utilizamos modelo de camundongo ortotópico clinicamente relevante, em que as células CaP humanos expressando ou silenciados para MTA1 pode crescer num ambiente relacionado ao seu tecido de origem. O objetivo deste experimento foi três vezes: 1) para avaliar a eficácia do resveratrol e PTER na inibição do crescimento ortotópico CaP e progressão; 2) para avaliar o papel de MTA1 no desenvolvimento do tumor de próstata, progressão e metástase, e 3) para determinar se MTA1 afecta a susceptibilidade do tumor da próstata primário e as metástases para o resveratrol e PTER.

Para examinar a-MTA1 dependente efeitos, utilizamos as nossas células DU145 previamente descritos e caracterizados transduzidas com EV lentivírus transporte e MTA1shRNA [13], [19]. Nós marcado estas células com luciferase e os usou para inoculação ortotópico (Fig. 4). Antes do transplante, a validação de expressão luciferase e knockdown MTA1 em células DU145-Luc foi realizada utilizando ensaio bioluminescente

in vitro

e Western blot, respectivamente (Fig. S1). No momento da cirurgia, os murganhos foram injectados na próstata com células EV-Luc e MTA1shRNA-Luc. Para assegurar a resposta específica a MTA1-knockdown e tratamento com compostos, que permitiu que os tumores de colonizar e desenvolver por 14 dias antes da randomização. O desenvolvimento do tumor foi monitorizado por imagiologia semanal BL. Os ratinhos que desenvolveram tumores (12/16 grupo EV e 15/16 MTA1shRNA grupo) foram distribuídos aleatoriamente por o tamanho das imagens em três subgrupos e tratadas com controlo de veículo (DMSO a 10%), o resveratrol ou PTER, PI, ao mesmo 50 mg /kg de dose /dia. a dose foi mantida Pterostilbene idêntico ao resveratrol para determinar diferenças de potência. Enquanto que os ratinhos tratados com veículo mostrou uma progressão rápida do tumor em xenoenxertos EV, o resveratrol e PTER causada atraso perceptível no crescimento do tumor (Figs. 4A e B). Resveratrol, mas mais assim PTER, mostrou efeitos inibidores tumorais, embora a significância estatística não foi alcançada devido ao pequeno número de ratos. Xenotransplantes expressando MTA1shRNA exibiram acentuadamente reduzido o crescimento do tumor na semana 5 pós-transplante com significância marginal em relação EV-Ctrl (p = 0,05). Além disso, os tumores knockdown mta1-tratados com os compostos tinham ainda mais a resposta, e as diferenças em comparação com EV-Ctrl tornou-se altamente significativa (p = 0,001 para o resveratrol, p = 0,0004 para o PTER). Portanto, MTA1-knockdown células ao resveratrol e particularmente para PTER sensibilizados. Consistente com os efeitos antitumorais potentes, resveratrol- e tratou-pter tumores mostraram redução da actividade mitótica em comparação com EV-tumores tratados com o veículo, como mostrado por Ki-67 IHC (Fig. 5A). Importante, consistente com a actividade MTA1 reduzida em tumores, acetil-alvo a jusante de MTA1, Ac-p53, tinham níveis significativamente aumentados mediante tratamentos, melhor visto com PTER (Fig. 5B). Assim, M30 coloração revelou um grande aumento da apoptose em tumores de ratos tratados com composto e EV grupo MTA1-knockdown (Fig. 5C). Além disso, a área de microvasos, tal como avaliado por imunocoloração CD31, diminuiu ~59% em EV-compostos e os tumores tratados por ~67% no grupo MTA1-knockdown comparação com EV-Ctrl (Fig. 5D).

Homem ratinhos nus foram injectados com células DU145 ortotopicamente-VE-Luc (EV), ou DU145-MTA1shRNA-Luc (MTA1shRNA) e tratados com veículo (Ctrl), ou PTER Res, 50 mg /kg /dia, todos os dias, ip imagens representante A. Normalizada BL dos ratos de cada grupo são mostrados. B,

esquerdo

, análise quantitativa de emissão de luz tumor no total Flux (fótons /seg /cm2 /sr) é plotado contra o tempo. Os meios ± SE são mostrados (n = 6 no início), * p = 0,05.

Direito

, registro tendências para cada grupo são mostrados. inibição do crescimento significativa foi detectada em EV- vs. MTA1shRNA-tumores como grupos, ** p 0,01 e entre EV-Ctrl vs. MTA1shRNA-Res e MTA1shRNA-PTER, *** p . 0.001

Esquerda,

imagens representante IHC de A. Ki-67 (proliferação); B. Ac-p53 /p53 (sinalização MTA1); C. M30 (apoptose); e D. CD31 (angiogênese) em EV- e MTA1shRNA-tumores são mostrados.

Right,

quantificação de células coradas positivamente como porcentagem do total de células. Os dados são gráficos de caixas de escolhidos aleatoriamente cinco campos analisados ​​independentemente por dois investigadores. comparações de pares, * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001 vs EV-Ctrl;

# p 0,05 e

## p 0,001 vs. MTA1shRNA-Ctrl; + P 0,05 e ++ p . 0.001, de compostos entre EV e grupos MTA1shRNA

Poucos pré CaP modelos de xenotransplante de progresso para a metástase, o que torna difícil para estudar o significado funcional de MTA1 na metástase. O nosso estudo anterior com células LNCaP-Luc não mostrou metástases quando ortotopicamente injetadas em ratos (dados não publicados). Por causa do fenótipo mais agressivo de células DU145, considerou-se a possibilidade de metástase espontânea em xenoenxertos DU145 ortotópicos. No início da semana 7, foram detectados sinais BL distintas a partir da fonte primária (próstata) no grupo VE-Ctrl simulada (Fig. 4A e 6A).

ex vivo

BL imagens de metástases foram detectados na necropsia no fígado, rins e pulmonar /cardíaca, e histologia foi confirmada por um patologista certificado (JRL) (Fig. 6B). Observou-se a maior incidência de metástases no grupo de VE (100%), enquanto que o grupo MTA1shRNA mostrou apenas 50-75% e com elevado grau de heterogeneidade (Fig. 6C). macrometástases extensivos em todos os órgãos observados em EV-Ctrl foram inibidas pelo resveratrol e PTER. tumores knockdown-mta1 desenvolveram metástases menores, e em menor número de órgãos. Notavelmente, os tumores MTA1shRNA tratados com compostos quer não desenvolveram nenhuma metástase renal ou teve pequenas lesões em um rim (Fig. 6D). A inibição de metástase em resposta a agentes de metas mta1 e silenciamento MTA1 indica contribuição MTA1 a invasão local, divulgação e metástase. Em conjunto, estes dados sugerem que a sinalização MTA1 desempenha um papel essencial no desenvolvimento e progressão do cancro da próstata metastático e que a segmentação via MTA1 por polifenóis pode ser eficaz em retardar a progressão do tumor e prevenir a metástase.

. imagens BL de metástases são mostrados. Os sinais detectados após a remoção da próstata consistiu de sinais metastáticos e não-específicos. A remoção da pele e dos músculos eliminado não especificidade. B.

Top, ex vivo

imagens de órgãos metastáticos.

Bottom,

Validação de lesões metastáticas (T) em rins (K), fígado (Li) e pulmão /coração (L /H) pela H E coloração. C, análise quantitativa do total de sinais Luc metastáticos no total Flux (fótons /seg /cm2 /sr). círculos abertos representam valores extremos. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001 são comparativos emparelhados vs EV-Ctrl. D, análise quantitativa de metástase específicas do órgão apurado por sinais de luciferase como a Total Flux (fótons /seg /cm

2 /sr). histogramas com códigos de cores de sinais para cada grupo são mostrados. PTER foi mais eficaz na inibição da metástase em todos os órgãos em comparação com Res em EV-grupo.