Abstract

Cancro desenvolve através de um processo de várias etapas em que as células normais progredir para tumores malignos através da evolução da sua genomes como um resultado da aquisição de mutações em genes do controlador de cancro. O número, identidade e modo de ação dos genes do controlador de câncer, e como elas contribuem para a evolução do tumor é desconhecida. Este estudo implantou o vírus do tumor mamário de ratinho (MMTV) como um agente mutagênico de inserção para encontrar ambos os genes controladores e redes em que atuam. Usando sequenciamento local de inserção profunda que identificou cerca de 31.000 locais de integração retrovirais em 604 tumores mamários induzidos por MMTV de camundongos com deleção específicas de glândula mamária de

Trp53

,

PTEN

camundongos knockout heterozigotos, ou estirpes de tipo selvagem . Foram identificados 18 locais conhecidos comuns de integração (CISS) e 12 marcam novos genes do cancro candidato anteriormente desconhecidos CISS. Os membros do

Wnt

,

Fgf

,

FGFR

,

RSPO

e

PDGFR

famílias de genes eram comumente mutado em uma solução mutuamente moda exclusiva. Os dados de sequência geramos rendeu também informações sobre a clonalidade de inserções em tumores individuais, o que nos permite desenvolver um modelo baseado em dados de desenvolvimento de tumor induzida por MMTV. mutações de inserção próximo

Wnt

e

Fgf

genes marcar os primeiros “Iniciando” eventos em tumorigênese induzida MMTV, enquanto que

FGFR

genes são direcionados mais tarde, durante a progressão do tumor. Nossos dados mostram que mutagénese de inserção pode ser usado para descobrir as redes de mutação, o tempo de mutações, e os genes que iniciam e conduzir a evolução do tumor

Citation:. Klijn C, Koudijs MJ, Kool J, dez Hoeve J , Boer M, de Moes J, et al. (2013) Análise da heterogeneidade do tumor e Câncer Gene Networks Usando Sequenciamento profundo do MMTV induzida mamário de ratinho tumores. PLoS ONE 8 (5): e62113. doi: 10.1371 /journal.pone.0062113

editor: Robert Oshima, Sanford Burnham Medical Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de fevereiro de 2013; Aceito: 25 de fevereiro de 2013; Publicado: 14 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Klijn et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Sociedade holandesa Câncer (concessão 2001-2489 para JH), a Associação de Câncer Research International (AICR conceder 07-585 para JJ), a Iniciativa /Organização Holanda Holanda Genomics para a Investigação Científica (concessão NGI /Programa NWO 050 -10-008 para MVL; NGI /NWO Horizon Breakthrough concessão 40-41009-98-9109 e NGI /NWO Horizon Zenith conceder 40-41009-98-11097 para JJ), o Consórcio dos Países Baixos para Biologia de Sistemas (NCSB), o Cancer Genomics Centre (CGC), e do Centro de Biologia do Câncer de Sistemas (CSBC). D.J.A. é financiado pelo Cancer Research do Reino Unido e da Wellcome Trust (76943). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Com o advento das tecnologias de sequenciamento de DNA da próxima geração da paisagem mutacional de vários tipos de tumores foi definido revelando que existem inúmeros caminhos genéticos para malignidade [1]. Tumor heterogeneidade contribui ainda mais para essa complexidade [2], [3], complicando assim a nossa capacidade de distinguir mutações motorista dos passageiros. modelos de tumor de rato apresentar um ambiente limpo, reprodutível

in vivo

sistema para estudar a contribuição de genes driver para tumorigênese e definir seus mecanismos biológicos subjacentes de ação [4].

mutagénese de inserção (IM) empregando retrovírus ou transposões tem sido uma das principais ferramentas para induzir tumores em ratinhos [5] – [8]. Mamário de ratinho Vírus do Tumor (MMTV) é um retrovírus que transforma lenta que tem sido usado para estudar a tumorigénese mamário em ratos. Este vírus causa tumores mamários pela integração de seu DNA pró-viral em ou próximo a genes do cancro. ciclos repetidos de mutação de inserção e expansão clonal conduz a tumores mamários que transportam várias integrações MMTV clonais e sub-clonal, incluindo mutações ligadas a ambos os genes condutor, bem como mutações de passageiros.

A clonagem molecular das inserções proviral em MMTV- tumores mamários induzidos levaram à descoberta do primeiro MMTV Inserção local comum (CIS) e o gene associado

Wnt1

(originalmente chamado

Int1

) em 1982 [9]. Verificou-se que MMTV inserções perto do

gene Wnt1

promoveu o desenvolvimento do tumor mamário através da activação de Wnt1, o membro fundador da via de sinalização Wnt. Logo após a descoberta de

Wnt1

outro oncogene,

Fgf3

(originalmente denominado

Int2

) foi identificado. Outras pesquisas mostraram que este membro da família do gene do fator de crescimento de fibroblastos colabora efetivamente com

Wnt1

na formação de tumores [10]. Seguindo a promessa de estes estudos iniciais, a crescente popularidade de MMTV como um sistema de rastreio resultou na descoberta de vários genes adicionais implicados no desenvolvimento do cancro [11] – [17]

A heterogeneidade e progressão da MMTV-. tumores induzidos podem ser avaliados por meio da análise da abundância relativa ( “clonalidade”) de inserções individuais de uma dada amostra. Altamente inserções abundantes indicam cedo, iniciando eventos de inserção e humilde inserções abundantes indicam eventos que ocorrem mais tarde, durante o desenvolvimento do tumor, análogos aos estudos recentes de mutações de um único nucleotídeo em tumores humanos [2], [3]. Anteriormente utilizadas abordagens baseadas em PCR é possível quantificar com fiabilidade a clonalidade de locais de inserção devido ao viés de amplificação sequência. Por conseguinte, desenvolveu um método para a identificação simultânea e avaliação quantitativa de clonalidade de mutações por inserção chamado Shear-Splink [18]. Aplicamos esse método para analisar um grande conjunto de tumores induzidos por MMTV de duas estirpes do tipo selvagem do rato (BALB /c e FVB /N) e dois camundongo geneticamente modificado (GEM) modelos de câncer de mama: o

Pten

+/-

estirpe [19] e o

K14Cre; Trp53

modelo [20]. Utilizou-se o conjunto de dados resultante de abordar quatro questões-chave: Em primeiro lugar, podemos identificar romance MMTV CISs e, assim, ampliar o repertório de genes do cancro candidatos associados com esses modelos? Em segundo lugar, podemos identificar genes driver específico genótipo em cada uma das origens genéticas? Em terceiro lugar, podemos identificar relacionamentos co-ocorrência ou mutuamente exclusivos entre CISs e, assim, definir relações funcionais entre os genes driver associado? Finalmente, pode-se gerar um modelo de progressão do tumor a partir das informações clonalidade derivada da sequência lê das inserções individuais? Tal modelo poderia especificar a ordem dos eventos com base no perfil de inserção e lançar luz sobre as relações funcionais entre os genes envolvidos na tumorigênese mamária induzida por MMTV.

Materiais e Métodos

mouse modelos utilizados para MMTV infecção

recém-nascido BALB /c /He /a (denotado BALB /c) os ratinhos foram infectados com MMTV pela enfermagem Foster em animais C3H /a fêmeas portadoras do leite transmitido MMTV [21]. /c ratinhos fêmea BALB infectados desenvolvem tumores mamários com incidência elevada ( 95% antes da idade de 1 ano). Os animais infectados com vírus foram denotado BALB /c

camundongos +. Neste estudo foram utilizadas duas linhagens de camundongos transgênicos e seus controles do tipo selvagem: uma estirpe condicionalmente deficiente em

Trp53

no tecido epitelial mamária em um /c fundo BALB (Balb /c

K14Cre; Trp53

F /F

) e uma de linha germinal knockout heterozigóticos para

Pten

em um fundo FVB /N

O BALB /c

K14Cre;. Trp53

F /F

estirpe de ratinhos foi gerado por nove retrocruzamentos consecutivos de

K14Cre; Trp53

F /F

animais em um misto 129P2 /Ola e FVB /N fundo [22] para camundongos BALB /c. A resultante Balb /c

K14Cre; Trp53

F /F

estirpe mostrou apenas uma baixa incidência de tumor mamário antes da idade de 300 dias. Estes condicional

Trp53

knockout camundongos foram infectados por MMTV através de enfermagem Foster por BALB /c

+ fêmeas.

Para a comparação dos tumorigênese induzida MMTV entre o tipo selvagem e

Pten

+/- camundongos, a condicional

Pten

alelo knockout [23] foi usado para gerar

camundongos Pten

+/- FVB /N.

Pten

+/- ratos foram cruzados com N ratos FVB /do tipo selvagem. Os irmãos de ninhada do sexo feminino na progenitura, tanto do tipo selvagem e heterozigotos para

Pten

, foram infectados com MMTV pela enfermagem Foster em BALB /c

fêmeas + abrigando o leite transmitida MMTV.

Todos os animais de MMTV-infectadas foram monitorizados quanto ao desenvolvimento de tumores mamários que foram isoladas quando cerca de 1 cm de diâmetro. Este estudo foi realizado em estrita conformidade com o Código de Prática Holandês de Pesquisa com Animais de Laboratório em Cancer Research. O protocolo foi aprovado pela Comissão experimental locais animal ética (DEC) (Números permitir: 04065, 08061, 03008) e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Todos os ratos foram sacrificados quando o tumor atingiu 1 cm

3 (ponto final) de dióxido de carbono. Gráficos de Kaplan-Meier de tempo de vida do rato foram tabulados e testes de log-rank foram calculados utilizando o pacote de sobrevivência como implementado na linguagem de programação estatística R.

Cre mediada eliminação dos

Trp53

alelos floxed em tumores de

K14Cre; Trp53

F /F

ratinhos foi avaliada por análise de Southern blot, conforme descrito anteriormente 2001 [24]. Resumidamente, o ADN de elevado peso molecular genómico a partir de tumores induzidos MMTV foi digerido com BglII. Os fragmentos de ADN foram separados em geles de agarose a 0,6% e transferido para filtros de nitrocelulose. A PCR marcado 700 fragmento nt XbaI correspondente ao exão 11 do

Trp53

foi usado como sonda para detectar alelos apagados e não apagados. Cre supressão mediada do exão 2-10 do floxed

Trp53

alelo pode ser avaliada com base em uma mudança de mobilidade do

Bgl fragmento de DNA

II. Aproximadamente 50% dos tumores mostrou perda de bi-alélico dos exões floxed. Foram utilizados apenas os tumores para análise IM.

método Shear-Splink para local de inserção mapeamento

Para sequenciar os locais de inserção em tumores foi utilizado o protocolo de Shear-Splink como descrito anteriormente [18]. Resumidamente, o DNA foi cortado para 100-1000 pb fragmentos, que foram cerses e ligados a splinkerette adaptadores. Um PCR primária foi realizada para amplificar especificamente fragmentos de junção virais-a-hospedeiro. Um segundo PCR foi realizada para introduzir as sequências de código de barras e os adaptadores 454 necessários para sequenciação. Estes produtos de PCR foram reunidas e sequenciado por sequenciação 454. Os dados de sequenciação cru foi depositado na sequência lida Arquivo sob o número de ERP002483.

A análise dos dados

métodos de análise de dados são descritas nos métodos de apoio (Texto S1).

RNA sequenciamento

RNA foi extraído de 4 tumores que transportam

HBEGF

inserções, e 4 casos carregando um

Myb

inserção. Nós determinamos FPKMs tanto para

HBEGF

e

Myb

usando abotoaduras [25] após o alinhamento usando BWA [26]

Resultados

MMTV mutagénese de inserção em selvagem -tipo e ratos Trp53 ou PTEN mutantes

a fim de avaliar a heterogeneidade do tumor e identificar as redes do gene do cancro em MMTV induzido tumores mamários de rato, foi realizado um estudo Insercional Mutagênese de alto rendimento, em larga escala, em combinação com profunda seqüenciamento em uma grande coorte de camundongos a partir de 4 origens genéticas diferentes. Uma visão geral esquemática da nossa abordagem é representada na Figura S1. Analisamos coortes de ratos de duas diferentes origens genéticas: FVB /N (doravante referida como FVB) e BALB /c. Para cada fundo genético que adquiriu tumores, tanto a estirpe de tipo selvagem, bem como a partir de modelos específicos de rato geneticamente modificadas (GEM). Dentro do fundo FVB, tumores mamários foram colhidas de camundongos selvagens MMTV-infectadas e

PTEN

+/-

camundongos knockout heterozigotos. Dentro do /c fundo BALB tumores induzidos MMTV foram obtidos a partir de animais do tipo selvagem e

K14cre; Trp53

F /F

camundongos com deleção específica do epitélio da p53. Como pode ser visto na Figura 1a, existe uma diferença de tempo de vida entre os controlos de tipo selvagem e os modelos GEM combinados, indicando uma interacção entre a tumorigénese induzida por VTMR e a mutação geneticamente modificadas. Curiosamente, a latência média de desenvolvimento do tumor induzida por MMTV foi diminuída no

Pten

+/-

coorte, mas aumentou no

K14cre; Trp53

F /F

coorte quando comparados aos seus controles do tipo selvagem. Esta observação levou-nos a hipótese de que as inserções MMTV pode atingir genes que colaboram com

Pten

haploinsuficiência em

Pten

+/-

ratos. Em contraste, a infecção MMTV pode influenciar negativamente a transformação maligna do

Trp53

– /-

células epiteliais mamárias ou vice-versa. Há também uma grande diferença no tempo de vida entre MMTV-infectadas de tipo selvagem FVB /N e ratinhos BALB /c (Figura 1B). Isto poderia indicar simplesmente que o vírus tem replicação mais lento na estirpe FVB em comparação com a linhagem BALB /c, ou pode indicar a presença de BALB /c alelos que promovem a tumorigénese induzida por VTMR. Em apoio deste último, ratinhos BALB /c contêm um alelo hipomórfico do gene supressor de tumores

Cdk2na

[27].

Cada gráfico representa uma comparação entre duas coortes. Um teste de log-rank de pares foi realizada para todos os gráficos para determinar se existem diferenças significativas entre vida útil das coortes plotados em cada gráfico. Os valores de p são mostrados no canto superior direito. A. Dentro de cada estirpe fundo do rato específico (FVB ou BALB /c +) comparou-se a MMTV-infectados coorte de tipo selvagem com a linha geneticamente modificados infectados (ou

Pten

heterozigotos para a coorte FVB ou

Trp53

deficiente para o BALB /c + coorte). B. A diferença na expectativa de vida entre as duas estirpes do tipo selvagem é mostrada aqui.

Para mapear os locais de inserção MMTV usamos nosso protocolo Shear-Splink [18] para extrair e amplificar DNA do vírus-anfitrião fragmentos de junção contendo o MMTV LTR 5 ‘, bem como a sequência genómica de rato adjacente. Nós barcoded os fragmentos que nos permite reunir até 48 tumores individuais e sequenciar-los no sistema 454 Genome Sequencer FLX. sequências em bruto foram pré-processados ​​usando scripts personalizados Perl. Identificou-se a sequência genómica do lê e mapeado-los para o genoma de referência C57BL /6J (MGSC37). Para cada leitura confirmou-se a presença da extremidade 5 ‘da sequência viral, bem como a presença do código de barras de ADN para de-convolve as piscinas em dados de tumores individuais. Um dos aspectos únicos da nossa abordagem é que somos capazes de quantificar a clonalidade de inserções através da contagem do número de tumor-hospedeiro fragmentos únicos junção DNA marcados por pontos de ligação únicos (LPS) entre a sequência genómica do rato eo adaptador splinkerette. Uma vez que o número de discos originais corresponde ao número de células que transportam a inserção de MMTV correspondente, a contagem de LP podem ser usadas como uma medida para a clonalidade relativa de inserções MMTV individuais dentro de cada tumor [18].

várias adicional etapas de filtragem foram realizados como descrito na secção de Métodos e representado na Figura S1 antes de os dados foram inseridos na base de dados a mutagénese por inserção (title; https://imdb.nki.nl). Após a filtragem, ficamos com 30942 integrações em 604 tumores. Quaisquer inserções que têm

n

LPs originais são garantidos para ter estado presente em pelo menos

n

células independentes. Para enriquecer para inserções que tinham integrado em mais do que uma célula de tumor, que desprezada inserções com apenas um LP. Usando este filtro reduzimos os dados para 6605 inserções únicas em 600 tumores (4 tumores realizadas apenas inserções com 1 LP). Esta é uma redução de 78% no número total de locais de inserção, mas só constitui uma redução de 21% no número total de leituras, o que sugere que a filtragem contra a inserções com LPS único reduz efectivamente o número de mutações fundo em nossos dados.

análise CIS de locais de integração MMTV

Nós determinamos CISs global para todos os tumores no conjunto de dados. Para determinar significativa CISs usamos o quadro Gaussian Kernel Convolution [28] implementado no IMDB. A maioria dos tumores de ratinhos de tipo selvagem contribuído pelo menos uma inserção de um CEI (Tabela 1). Esta percentagem é mais baixa para os fundos predispostos. Este é provavelmente devido ao fato de que algumas das

K14Cre; Trp53

F /F Comprar e

Pten

+/-

ratos desenvolvem tumores mamários que não são movidos por MMTV mutagénese de inserção. No total, encontramos 30 significativa CISs, dos quais 18 já eram conhecidas e 12 eram novel (Tabela 2). Todas as inserções associada a uma CIS são acessíveis através da IMDb. Nós atribuído manualmente genes alvo em potencial para esses CISs. Como uma ilustração que mostra os dois mais frequente romance CISs e o mapeamento dos pontos de inserção de VTMR nestas CISs em relação ao gene alvo na Figura 2. Tanto o

HBEGF

e

Myb

são muito plausível genes-alvo candidato como as integrações MMTV são muito susceptíveis de aumentar a expressão (integrações a montante e a jusante) ou estabilizar o ARNm de terminação da transcrição precoce e a remoção concomitante de ARNm motivos desestabilizadores devido à integração na UTR 3 ‘(no caso de

HBEGF

). Além disso, tanto

HBEGF

[29], [30] e

Myb

[31] tenham sido previamente implicado no cancro. Finalmente, a expressão de ambos HBEGF e Myb é elevada em amostras que transportam a integração, indicando que estes genes são alvos directos da integração virai (Figura S2).

O alvo putativo gene é mostrado, com a seta a indicar a direcção da transcrição. As setas indicam a localização genómica das integrações virais, com a direcção da seta indica a direcção da transcrição viral. As cores indicam a coorte a partir da qual as integrações foram recuperados.

Muitos dos CISS recuperamos são canônicos CIS para MMTV mutagénese de inserção. Em tumores mamários induzidos por MMTV, inserções proviral são frequentemente encontrados perto

Wnt

membros da família de genes (

Wnt1

,

Wnt3

e

Wnt3a

), o crescimento genes fator relacionado (

Fgf

e

FGFR

genes,

PDGFR

genes e

Igf2

), membros da família gene R-espondina (

Rspo1

,

Rspo2

e

Rspo3

) e mitogen sinalização genes da via (

Eras

e

Map3k8

) [11]. Foram identificados vários novela CISs nessas famílias que não foram previamente identificados:

HBEGF

,

Rspo1 e

Fgfr3

. Estes novos alvos só pode ser recuperado em um grande estudo, uma vez que ocorrem com muito menos frequência em comparação com os membros da família previamente identificados. Nós também recuperou vários CISs raro que são susceptíveis de ser verdade MMTV bate porque os genes alvo candidato pertence a famílias de genes que incluem também os membros que são alvos frequentes MMTV. Esta constatação reforça a validade da outra rara, mas romance significativa CISs identificamos em nossa tela, como

Sfi1

,

Dock5

e

Fezf1

. Com efeito, o homólogo humano de

Fezf1

(conhecido como o

ZNF312B

) tem sido descrito como um oncogene no cancro gástrico [32]. Além disso, vários genes alvo conhecidos e novos foram encontrados para ser recorrentemente amplificado num painel de mais de 700 linhas de células de cancro humano (https://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/genetics/CGP/conan/search.cgi ) ou listados como alvos de mutação no banco de dados COSMIC (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/). Isso mostra que os genes associados com CISs nos tumores mamários induzidos por MMTV podem também ser relevantes no câncer humano.

específicas de genótipo CISs

Além de encontrar romance MMTV CISs estávamos interessados ​​em encontrar específicas do genótipo inserções. MMTV infectado

Pten

+/- ratos desenvolvem tumores mamários mais rápido do que seus controles do tipo selvagem, sugerindo que as inserções MMTV pode mutar genes do cancro relevantes que colaboram com Pten haploinsuficiência na tumorigênese mamária. Se este for o caso, seria de esperar encontrar enriquecimento para CISs específico em MMTV induzido

Pten

+/-

tumores mamários, em comparação com tumores de controlo. No entanto, não conseguimos encontrar qualquer associação significativa com qualquer fundo em nosso estudo (Tabela 2). Isto sugere que as integrações MMTV ocorrer em ou perto dos mesmos genes motorista câncer, independentemente da

Trp53

ou

Status Pten

. Houve também uma grande diferença no tempo de vida entre a FVB MMTV-infectadas e BALB /c ratinhos de tipo selvagem (Figura 1B). Também aqui, não conseguimos encontrar qualquer associação significativa entre CISs de fundo e tensão. Embora tenhamos observado inserções perto de

HBEGF

apenas no fundo FVB (Figura 2), essa diferença não foi estatisticamente significativa, provavelmente devido à baixa incidência de inserções perto deste gene. Isto, contudo, sugerir para a possibilidade que a ativação de

HBEGF

pode ser oncogénico em ratinhos FVB mas não camundongos BALB /c.

Co-ocorrência e exclusividade mútua entre CISs

nossa análise de locais de inserção comuns rendeu várias romance, mas raramente com etiquetas loci. Foram analisados ​​os padrões de inserção para todos CISs em todos os tumores de estabelecer relações entre os padrões de inserção nestes CISs. As inserções podem exibir um padrão de integração mutuamente exclusivos, o que poderia significar a redundância funcional entre os genes-alvo como foi mostrado para

Myc

e sua parálogos

N-myc [33]. Por outro lado, as inserções co-ocorrem podem ser observadas nos casos em que o efeito oncogénico de ambas as inserções é sinérgica. Para identificar estas relações funcionais, determinou-se a co-ocorrência e exclusividade mútua entre CISS estatisticamente significativa no nosso estudo, como descrito na secção de Métodos (Figura 3).

CISs são indicados pelo seu gene alvo curada manualmente. bordas vermelhas indicam uma relação de co-ocorrência, enquanto bordas verdes indicam uma relação mutuamente exclusivos. O número entre parênteses e o tamanho dos nódulos indicam o número de tumores com uma inserção viral no SIA relevantes. A espessura das arestas é uma medida da importância das relações entre os nós.

Várias observações podem ser feitas a partir dessa análise. Em primeiro lugar, co-ocorrência significativa ocorre principalmente entre as inserções pouco frequentes e exclusividade mútua, principalmente entre as inserções altamente frequentes. Esse viés é, provavelmente, devido ao modo de teste, que é de fraca potência para baixas frequências de inserção. Infreqüentes, inserções mutuamente exclusivas precisa de um maior tamanho da amostra para se tornar significativo, enquanto infrequentes, inserções co-ocorrência pode rapidamente tornar-se significativo.

Em segundo lugar, as relações interessantes foram encontradas entre os membros da

Fgf

família ligando e seus receptores, o

FGFR

genes. Por exemplo, o FGFR ligantes FGF8 e FGF3 parecem ter uma preferência recíprocos para o receptor FGFR1, uma vez que

Fgf3

inserções são mutuamente exclusivos com

FGFR1

inserções, enquanto que

FGF8

inserções significativamente co-ocorrer com

FGFR1

inserções. Isso pode indicar parceiros preferenciais de ligação para os diferentes ligantes e uma vantagem seletiva para aumento da regulação tanto do ligando e do seu receptor combinado.

Por fim, observamos exclusividade mútua entre membros de famílias de genes individuais (por exemplo,

Wnt

genes e

genes FGF-HBEGF

). Trama de padrões de inserção cumulativos por cinco famílias distintas de genes da CEI (

Wnt

,

Fgf /EGF

,

FGFR

,

RSPO Comprar e

PDGFR

) revelou um padrão de integração mutuamente exclusivos típico para os genes dentro de cada família (Figura 4), que mostra que as células infectadas MMTV ganhar pouca ou nenhuma vantagem selectiva de MMTV inserções próximos múltiplos membros da mesma família de genes. Com base nestes resultados, decidimos olhar para as relações entre famílias de genes CIS em vez de genes da CEI individuais

.

Para cada uma das cinco famílias as colunas indicam que tumores continham uma inserção para esse membro específico de uma família. Linhas indicam tumores específicos.

Modelo de MMTV Tumor Progression

Nossos dados mostram que MMTV preferencialmente alvos um grupo bastante limitado de genes e famílias de genes. Se nos restringirmos aos genes da CEI e famílias da CEI que são afetados por inserções MMTV em dez ou mais tumores, ficamos com apenas 11 grupos de genes da CEI (Tabela 2). Nós estávamos interessados ​​para ver se poderíamos encontrar uma diferença de clonalidade entre estes grupos de genes. Ao comparar inserções perto de dois membros desses grupos dentro de um tumor, aquele com mais inserções clonais também terá uma pontuação mais elevada clonalidade com base nos LPs contagens únicas. Isto poderia indicar um evento anterior e /ou uma batida mais potente, resultando na selecção positiva forte. Nós testamos para todos os 11 grupos de genes da CEI todos os pares de inserções que ocorreram no mesmo tumor, a fim de testar se os membros de um grupo têm uma pontuação clonalidade consistentemente mais elevados do que membros de outro grupo, quando co-mutado no mesmo tumor (ver métodos para detalhes).

Figura 5a mostra um mapa de calor com os pares de genes /família da CEI que tinham uma relação significativa clonalidade acordo com o teste binominal. Essa análise revela relações significativas entre o

Wnt /Fgf

famílias de genes (clonalidade superior) e

RSPO

,

Sfmbt2

,

PDGFR

,

FGFR

,

Irs4

,

Eras

e

Map3k8

(clonalidade inferior). Na Figura 5b visualizamos apenas estes relacionamentos significativos, juntamente com a sua direcionalidade. A partir deste modelo baseado em dados, podemos formular um modelo simples progressão de rato induzida por MMTV tumorigênese mamária. -Iniciando tumorais integrações MMTV são mais prováveis ​​de ocorrer perto de um

Fgf

ou

Wnt

gene, enquanto que inserções perto de outros genes da CEI são eventos secundários. Para todas as outras relações testado ou não há relação clonalidade clara ou não existem tumores nos quais são co-mutada. Em todos os 47 tumores que apresentaram co-mutação do

Fgf

e seu receptor

FGFR

, o

Fgf

inserção foi mais clonal, mostrando que o ligando de FGF está sempre ativado anteriormente que o receptor FGF durante a progressão do tumor MMTV.

a. A heatmap de todas as combinações de famílias de genes e genes isolados não atribuído a uma família. diferença significativa na clonalidade para cada família são calculados usando um teste binominal para todas as amostras que são co-inseridos nesse par de genes específicos (família). quadrados azuis indicam uma relação clonal significativa relativamente ao grupo indicado no eixo Y para o grupo indicado no eixo dos X. quadrados amarelos indicam uma relação clonal significativa a partir do eixo-X para o eixo Y. quadrados pretos indicam qualquer relação significativa. B. Uma visão de rede do heatmap em A. mostrando apenas significativa (P 0,05) relações clonalidade. Uma pontos de borda do gene mais clonal (família) com o gene clonal menor (família). A espessura de um bordo é uma medida da importância da relação clonalidade. Para a fracção exibido nas bordas, o numerador representa o número de vezes que o nó pai tinha uma pontuação mais elevada clonalidade, enquanto o denominador representa o número de vezes que o nó filho tinha uma pontuação mais elevada clonalidade, em um tumor que continham as inserções em ambos os nós.

Discussão

estudos recentes têm mergulhou na heterogêneo make-up de tumores humanos [2], [3] que mostram que uma acumulação constante de mutações fundo cobre o facto de apenas uma punhado de mutações de condução provoca diferenciação oncogênico. Usando o sistema de rato, fomos capazes de definir claramente os genes de driver para tumores mamários induzidos por MMTV e a ordem em que eles ficam desregulados.

MMTV mutagénese de inserção

Neste estudo analisamos a grande grupo de ratos que desenvolveram tumores através MMTV inserção mutagênese. Dentro de um conjunto de dados de 6600 não-fundo MMTV inserções de 600 tumores, foram identificados 30 locais de inserção comuns englobando 1271 dos 6600 inserções (19,3%). Utilizou-se este conjunto de dados para abordar várias questões relacionadas induzida por MMTV tumorigênese do mouse mamária. Em primeiro lugar, queríamos ver se pudéssemos identificar romance MMTV CISs neste grande conjunto de dados utilizando a nossa abordagem de alto rendimento Shear-Splink. Descobrimos que o 30 MMTV CISs alvo um número limitado de famílias de genes bem definidos e muito poucos outros genes. No total, 53 MMTV CISs foram anteriormente identificados (Tabela S1). A sobreposição entre esta lista de conhecido MMTV CISs e nossa lista é de apenas 18 CISs. Isto significa que 66% da CISs anteriormente encontrada não pôde ser confirmada no presente estudo. Embora seja possível que CISs com inserções muito subclonal não são detectados pelo nosso método Shear-Splink, acreditamos que nosso estudo é tanto menos tendencioso (através do uso de DNA corte em vez de clivagem da enzima de restrição) e mais robusto (desde medimos muitos lê da mesma inserção) do que os estudos mais antigos baseados no isolamento e sequenciamento Sanger de sites individuais de inserção MMTV. Além disso, a utilização do marcador de LP para filtrar inserções fundo a partir dos dados é um método poderoso para limitar resultados falsos positivos. Embora seja possível que o nosso método gera falsos-negativos, é talvez mais provável que alguns dos CISS anteriormente identificados são passageiros ou locais de integração aleatória. Os nossos dados sugerem que a induzida por VTMR tumorigénese mamaria é uma doença muito específico, envolvendo um número limitado de genes-alvo celulares que podem promover a proliferação, a sobrevivência e /ou a auto-renovação de células epiteliais mamárias de MMTV-infectados. Como tal, MMTV não é um sistema de mutagénese de inserção muito flexível e, portanto, provavelmente não é a melhor abordagem para identificar genes de câncer de mama candidato novos em camundongos selvagens ou modelos GEM predispostos a tumores. Esta noção é apoiada pelo fato de que não podemos encontrar inserções MMTV específicos em camundongos tumor propenso mamária com heterozigotos

Pten

exclusão ou específica de tecido perda de

Trp53

, apesar de MMTV-infectados

camundongos heterozigotos Pten

desenvolveram tumores mamários mais rápido do que os seus homólogos do tipo selvagem. tumorigênese induzida por MMTV aparentemente lucra com haploinsuficiência para

Pten

mas não é necessária mutação de colaboradores específicos para esta condição. Nossos resultados não descartam que MMTV pode mostrar um padrão de inserção diferente em ratos com glândula mamária específica sobre-expressão de um oncogene forte.

Apesar do forte viés de MMTV em direção ativação de membros da família Wnt /FGF nós ainda conseguiu identificar vários novela CIS para MMTV devido ao grande número de amostras incluídas em nossa análise. Alguns dos novos CISs cair dentro das famílias de genes alvo estabelecidos, que mostra que o nosso método é capaz de identificar os verdadeiros positivos, mesmo que só ocorrem em 1% das amostras, como é o caso com

Fgfr3

.