Abstract

Fundo

RNAs não codificadores Longo (lncRNAs) desempenham papéis generalizadas na regulação de genes e processos celulares. No entanto, os papéis funcionais de lncRNAs no cancro colorectal (CRC) ainda não estão bem esclarecidos. O objetivo do presente estudo foi medir os níveis de expressão 91H lncRNA no CRC e avaliar a sua importância clínica e funções biológicas no desenvolvimento e na progressão da CRC.

Métodos

expressão 91H e cópia a variação do número (CNV) foram medidos em 72 tecidos de tumor e tecidos normais CRC adjacentes por meio de PCR em tempo real. Os papéis biológicos de 91H foram avaliados por MTT, ensaio de zero ferida, ensaios de migração e invasão, e citometria de fluxo.

Resultados

91H foi significativamente sobre-expressos no tecido canceroso e linhas celulares de CRC comparação com adjacente tecido normal e uma linha epitelial intestinal humana normal celular. Além disso, a superexpressão 91H estava intimamente associada com metástases à distância e mau prognóstico em pacientes com CCR, com exceção de CNV de 91H. A análise multivariada indicaram que a expressão 91H era um indicador independente de prognóstico, bem como metástase distante. Os nossos dados in vitro indicam que knockdown de 91H inibiu a proliferação, migração e invasão de células de CRC.

Conclusões

91H desempenhou um papel importante na etiologia molecular de CDC e pode ser considerada um indicador de prognóstico romance em pacientes com CCR

Citation:. Deng Q, Ele B, Gao T, Pan Y, Sun H, Xu Y, et al. (2014)-regulação de 91H promove metástase tumoral e prediz mau prognóstico para pacientes com câncer colorretal. PLoS ONE 9 (7): e103022. doi: 10.1371 /journal.pone.0103022

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 15 Abril de 2014; Aceito: 23 de junho de 2014; Publicação: 24 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Deng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este projecto foi apoiado por subsídios da National Nature Science Foundation da China, Nanquim Ciência e Tecnologia Projeto Comissão ((sem 81172141, 81200401). no.201108025), Nanjing Projeto Medical Technology Development (no. ZKX11025), Projeto Talento Nanjing Saúde Young, talentos Jiangsu Provincial Key médicas para SKW, Nanjing Medical Fundação Ciência e técnica de Desenvolvimento para YQP (N. QRX11255) e B.S.H. (N. QRX11254). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é uma causa comum de morte por câncer no mundo devido à apresentação tumor tarde e rápida progressão, com cerca de 14,1 milhões de novos casos de câncer e 8,2 milhões de mortes por câncer em 2012, em todo o mundo [1]. Em países economicamente em desenvolvimento, CRC está se tornando mais prevalente, especialmente na China [2]. Apesar de substanciais progressos alcançados no diagnóstico e tratamento de CRC nos últimos anos, a taxa de sobrevida global em 5 anos continua a ser insatisfatória devido à metástase levando a resultados pobres [3]. . Portanto, a procurar marcadores ou factores moleculares romance é necessário e urgente para a detecção precoce antes de metástases à distância aparece e predizer o prognóstico em pacientes com CRC

Estudos recentes revelaram que lncRNAs, 200 nucleótidos de comprimento, jogo um papel crucial no desenvolvimento e progressão do cancro. Apesar de menos compreensão poço de lncRNAs comparação com microARNs [3], [4], [5], evidências que se acumulam indicam que a biologia lncRNAs mediada poderia estar envolvida na regulação de diversos processos celulares, tais como o crescimento celular e apoptose, caule pluripotência das células e desenvolvimento, a entrada da meiose e dos telômeros de comprimento [6], [7], [8], [9], [10], [11]. No entanto, semelhantes a genes codificadores de proteínas e micorRNAs, lncRNAs pode funcionar como oncogenes ou supressão do tumor, e expressão aberrante deles foi associada com a carcinogénese. Alta expressão de PVT-1 expressão em tecidos cancerosos foi considerado como um fator de risco independente para a sobrevida global dos pacientes CRC [12], e HOTAIR, funcionando como um oncogene ou um supressor de tumor, foi implicado na regulação epigenética para cânceres [7], [13], que foi considerado como um forte fabricante de prognóstico que contribuiu para prever a metástase ea sobrevida dos pacientes no cancro da mama primário [7].

91H, RNA antisense H19, foi um romance lncRNA que foi localizado no posição do H19 /IGF2 lócus (número de acesso NC_000011.9) com 119.329 kbs de comprimento. A transcrição das 91H foi sobre-expresso em cancro da mama humano que estava envolvido na regulação da expressão de IGF2 em trans [14]. No entanto, poucos estudos têm investigado as funções de 91H em outras formas de câncer humano, inclusive CRC. Para explorar os potenciais funções biológicas de 91H no desenvolvimento e progressão de CRC, o presente estudo foi levado a cabo através da análise do padrão de expressão de 91H, em tecidos de tumor de CRC e tecidos normais adjacentes e investigar as funções biológicas por avaliação da capacidade de invasão, migração, e apoptose das células CRC com knockdown 91H in vitro.

Materiais e Métodos

As amostras clínicas e linhas celulares

72 tecidos tumorais e combinados tecidos normais adjacentes foram obtidos a partir CRC inscritos pacientes submetidos a cirurgia em Nanjing primeiro Hospital Filiado à Universidade médica de Nanjing, entre 2011 e 2014. Em particular, os tecidos normais adjacentes foram tomadas 5-10 cm de distância dos tecidos tumorais. Todos os espécimes foram imediatamente congeladas em azoto líquido depois da cirurgia e armazenado a -80 ° C até à extracção de ADN e ARN. Nenhum paciente recebeu quimioterapia ou radioterapia no pré-operação. As informações clínicas dos pacientes foram coletadas, incluindo idade, sexo, localização do tumor, estágio TNM, o grau do tumor e instabilidade microstellite (MSI) status como estudo anterior [15] relatou. Os períodos de acompanhamento variou de 2 meses a 3 anos, com uma média de 26,6 meses. Todas as amostras foram obtidas com consentimento informado por escrito dos pacientes e foram confirmados histologicamente. A Comissão de Ética Médica do Nanjing Primeiro Hospital Filiado à Universidade Médica de Nanjing aprovou o estudo.

As linhas celulares HCT8, HT29, HCT116, SW620 (linhas celulares de cancro do cólon humano) e FHC (linha intestinal humana normal das células epiteliais) foram obtidos a partir de Xangai Coleção Cell, Academia chinesa de Ciências. Todos os acima linhas celulares foram mantidas em DMEM (Hyclone, EUA) contendo soro fetal bovino a 10% (FBS; Hyclone) e cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2

A extracção. de ARN total e de ADN genómico, a síntese de ADNc, e qRT-PCR

o ARN total e o ADN genómico (ADNg) foram extraídos a partir de tecidos e linhas celulares, utilizando o reagente Trizol (Invitrogen, CA) e EZNA Kit DNA de tecidos (Omega, EUA), seguindo o protocolo dos fabricantes separadamente. O ADNc foi sintetizado utilizando o kit de reagentes PrimeScript RT com ADNg Borracha (Takara, China) e foi utilizado para análise do nível de expressão 91H quantitativa por PCR em tempo real (qRT-PCR) com os seguintes iniciadores: para a frente, 5′-GCTTGTCAGTAGAGTGCGCC-3; e reverter, 5-CATCCAGTTGACCGAGCTTG-3. β-actina foi utilizado como um controlo interno com as seguintes sequências: para a frente, 5-CAAGATCATTGCTCCTCCTGA-3; reverso: 5-AGTCCGCCTAGAAGCATTTG-3. A

-ΔΔCt método 2 foi realizado para calcular a quantidade relativa de 91H comparação com a expressão β-actina. qRT-PCR foi realizada utilizando o SYBR Premix Ex TagTM II (Takara, China) e ABI 7500 System (Applied Biosystems, EUA).

Copiar variação número de identificação 91H

Análise da CNV para ADNg também foi realizada por qRT-PCR acima descrito método. RNase P foi utilizado como um gene de referência. O número de cópias de 91H foi contado após a equação 2 × 2

-ΔΔCT.

A transfecção de siRNA

interferência de RNA foi realizada usando ARNic em cadeia dupla sintéticos, como descrito em estudos anteriores [ ,,,0],16], [17]. Dois ARNic em cadeia dupla sintético (Si-91H: si91H1, 5′-GGCGUCAUUCUGAUGGGACTT-3 ‘e si91H2, 5′-UUCAGGAGCUUAAGAUGCUTT-3′) correspondentes às sequências de ARN 91H e um controlo negativo (Si-CN, 5’-3-CGUGGGUGGAUGCAUGGAUTT ‘) foram transfectados em células HCT-116 com 400 pmol, respectivamente, utilizando o reagente de transfeco Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA) na placa de 6 poços. Após 48 horas, os níveis de expressão 91H foram examinados através de qRT-PCR.

proliferação celular ensaio

Após a transfecção durante 48 horas tal como descrito acima, infectadas células HCT-116 foram subsequentemente colhidas para ensaio de proliferação celular (ensaio de MTT) seguindo o protocolo do fabricante. As células infectadas (1 x 10

4) foram plaqueadas em placas planas 96 poços de fundo suplementado com 100 ul por poço de DMEM. Após incubação durante 6, 24, 48, 72 e 96 horas respectivamente, a 10 ul de MTT foram adicionados a cada poço, em seguida, o meio foi removido depois de 4 horas de cultura e subsequentemente suplementada com 150 ul por poço de DMSO. A análise colorimétrica foi realizada num leitor de microplacas a 490 nm de comprimento de onda. Cada subgrupo foi repetido por cinco poços.

ensaios de migração e invasão

Para o ensaio de migração, infectados HCT-116 células (1 × 10

5 em 200 mL de DMEM isento de soro) , tal como descrito anteriormente, foram semeadas para dentro da câmara superior de placas Transwell num formato de 24 poços, com 8 mm de diâmetro (Corning Costar, EUA). 600 ul de DMEM contendo FBS a 5% foram adicionados à câmara inferior, como um quimioatractor. Após 24 horas de cultura, as células foram fixadas com metanol e foram corados com violeta de cristal. As células restantes foram removidos a partir do topo da membrana permeável utilizando um cotonete. Em seguida, as células que migraram através da câmara superior foram contadas em cinco campos aleatórios sob um microscópio de luz, e o valor médio de cinco campos foi expressa.

Para o ensaio de invasão, as câmaras superiores foram revestidas com Matrigel da membrana basal (40 mg /ml, Becton-Dickinson, EUA) a 37 ° C durante 30 min. As células infectadas (3 × 10

5) com DMEM isento de soro, foram adicionados nas câmaras superiores, as câmaras inferiores foram cheias com DMEM contendo 10% de FBS. Após 24 horas de incubação, as células que invadiram o lado reverso das câmaras superiores foram fixadas, coradas, e calculada utilizando um microscópio de luz. Cada ensaio de invasão foi realizada em três ou mais repetições.

ferida zero ensaio

placas de seis poços foram revestidas com células HCT-116 infectadas. As feridas foram criadas em células confluentes utilizando uma ponta de pipeta 10 ul às 48 horas pós-transfecção. Subsequentemente as células flutuantes e os detritos foram removidos utilizando PBS, e foi adicionado meio com FBS a-livre. Em seguida, observamos a cicatrização de feridas em diferentes períodos de tempo e fotografado linhas raspar representativos usando o microscópio de luz. Cada experiência foi repetida em triplicado.

Análise de Apoptose

apoptose celular foi determinada por citometria de fluxo, após coloração com anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI, BD Bioscience, CA). As células HCT-116 foram infectadas com Si-91H ou Si-CN na placa de 6 poços. A apoptose foi analisada após 48 horas de infecção. Todos os ensaios de apoptose foram realizadas em triplicado.

A análise estatística

níveis de corte ótimo de 91H em canceroso /não cancerosos foram calculados através da aplicação do receptor análise da curva característica (ROC) [18], [19]. Comparação de dados contínuos foram analisados ​​usando um independente

t

-teste e dados categóricos foram analisados ​​pelo teste do qui-quadrado. Enquanto isso, as taxas de sobrevivência foram calculadas por análise de sobrevivência de Kaplan-Meier e teste de Log-rank. Um modelo de riscos proporcionais de análise uni e multivariada Cox foram conduzidos para determinar o impacto de expressão 91H e os parâmetros clínico-patológicas sobre a sobrevida global (OS). Nomograma para OS foi criado através da aplicação de software R. índice de concordância de Harrel (C-índice) foi usada para avaliar a precisão de previsão do mesmo. Estatística com

P

-valor 0,05 foram considerados como estatisticamente significativos. Todos esses cálculos estatísticos foram realizados usando o IBM SPSS 20.0 software (IBM, EUA), R 3.0.3 software (Instituto de Estatística e Matemática, Viena, Áustria), OriginLab 8.5.1 software (OriginLab Corp, Northampton, EUA) e GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, EUA).

resultados

Correlação entre 91H expressão relativa e fatores clínico-patológicos em CRC

A 91H níveis de expressão foram determinadas por qRT-PCR para 72 cancerosos e tecidos cancerosos adjacentes a partir de pacientes de CRC. níveis 91h em tecidos cancerosos foram, obviamente, maior do que aqueles nos tecidos não cancerosos (

P Art 0,001; Figura 1). análise da curva ROC revelou que os níveis de corte ideais para expressão 91H eram 2,86 vezes para o OS em canceroso /não cancerosos (Figura 2). Em seguida, os 72 pacientes com CCR foram divididos num grupo de expressão elevada 91H (n = 42) que rácio expressão 91H ≥2.86 e um grupo expressão baixo 91H (n = 30) que rácio expressão 91H 2.86 (Figura 3), de acordo com a cut-off nível. fatores clínico-patológicas foram comparados entre os dois grupos de expressão 91H (Tabela 1). expressão 91H foi significativamente correlacionada com metástases à distância (

P

= 0,027). No entanto, a expressão 91H quase não foi correlacionada com o sexo dos pacientes, idade, localização do tumor, estágio TNM, fase N ou grau. Para estimar ainda mais a correlação entre a expressão 91H e prognóstico de pacientes com CRC, análise de sobrevivência de Kaplan-Meier e Log-Rank testes foram realizados utilizando o tempo de sobrevivência pós-operatória dos pacientes. Os resultados indicaram que os pacientes com expressão alta 91H teve um prognóstico, obviamente, mais pobres do que aqueles com baixa expressão 91H (

P Art 0,001, Figura 4).

A análise univariada da análise global revelou que 91H expressão relativa, estágio TNM, metástase ou grau distante foram indicadores prognósticos (Tabela 2). Além disso, expressão relativa 91H e metástases à distância foram indicadores prognósticos independentes para a taxa de sobrevida global de pacientes com CRC (HR: 3,66,

P

= 0,001; HR: 8,97,

P Art 0,001 ), respectivamente, por meio de análise multivariada (Tabela 2). Além disso, com factores de prognóstico nomograma clinicopatológicas e expressão 91H foi estabelecido para predizer a probabilidade que os pacientes com CCR que morrem dentro de 3 anos da sua cirurgia inicial, assumindo que os pacientes não morreu de outras causas primeira (Figura 5). Enquanto isso, a precisão da previsão do nomograma foi medida através de um índice de concordância (c-index). Para CRC, nomograma contendo 91H teve precisão mais preditiva do que isso, sem 91H (c-index: 0,90 contra 0,85 respectivamente)

DNA número de cópias variação (CNV) não foi envolvido na actualização. regulação da expressão 91H

Para determinar se o nível de expressão na 91H CRC foi associada a CNV, o padrão de expressão 91H foi medida por qRT-PCR, e estima ainda mais a concordância entre o número de cópias de ADN e nível de expressão 91H relativa 91H . Apenas 2,8% (2/72) de tecidos normais e tumorais emparelhados com CNV mostraram a sobre-expressão de 91H. No entanto, a expressão aberrante de 91H foi detectada em 95,8% (69/72) de tecidos normais e tumorais emparelhado, sem alteração do número de cópias (Figura 6).

A, A expressão relativa 91H em tecidos cancerosos e cancerosos correspondentes foi medida por qRT-PCR. β-actina foi considerado como o controlo interno. B, a variação do número de cópias de 91H, em tecidos cancerosos e cancerosos foi também medida por qRT-PCR. RNase P foi utilizado como um gene de referência.

proliferação 91H promovido, invasão e migração de células de CRC in vitro

Para avaliar as funções biológicas de 91H, 91H níveis de expressão foram medidos em uma variedade de linhas celulares (FHC, HCT-8, HT-29, HCT-116, e SW-620) por qRT-PCR. Como mostrado na Figura 7, a expressão foi detectada 91H os níveis mais elevados no HCT-8, HT-29 e HCT-116 em comparação com FHC, excepto para SW-620. Depois, as células HCT-116 foram transfectadas com si-91H ou si-NC. Após transfecção por 48 horas, 91H foi efetivamente silenciados no HCT-116 células (Figura 8).

A seguir, procuraram determinar se 91H knockdown proliferação de células afetadas pelo ensaio MTT. Os dados, em comparação com HCT-116 células infectadas com Si-CN, mostraram que a proliferação de células HCT-116 com Si-91H foi habitada para 36,7% (

P

0,05), 45,4% (

P Art 0,05), 43,2% (

P Art 0,05), 65,6% (

P Art 0,01) e 65,3% (

P

0,01) em 6, 24, 48, 72 e 96 h, respectivamente (Figura 9). Além disso, a indução de apoptose após 48 horas de tratamento com SI-91H ou Si-NC foi medida utilizando citometria de fluxo. HCT-116 células com knockdown 91H não, obviamente, exibir apoptose comparados com aqueles no controle (Figura 10).

Em seguida, para acessar os efeitos da supressão 91H no HCT-116 células motilidade, um ensaio de zero ferida foi realizada para avaliar o efeito do knockdown 91H sobre a motilidade celular. supressão 91H resultou na atenuação da motilidade das células HCT-116. Em particular, em comparação com células infectadas com Si-CN, a recuperação da ferida foi significativamente retardado em células infectadas por siRNA (Figura 11). Além disso, os ensaios de migração e invasão foram usadas para acessar ainda mais este efeito da knockdown 91H sobre a migração e invasão de células CRC. Os resultados revelaram que a migração e invasão foram significativamente inibida em células infectadas com Si-91H, em comparação com células Si-CN-infectados (Figura 12). Além disso, a migração de células HCT-116 e invasão foram reduzidos de 49,4% (P 0,05) e 43,9% (P 0,05), respectivamente, na sequência de supressão 91H (Figura 13). Estes resultados indicaram que a inibição 91H pode ser estreitamente relacionado com a proliferação, migração e invasão de linhas celulares de CRC.

O número de células invasoras ou migraram para cada grupo experimental foi contado como a média de 5 de cinco campos de visão sob um microscópio (*

P Art 0,05)

Discussão

Como uma estrela molecular da novela para lncRNA, estudos acumulando ter. incidiu sobre o impacto da lncRNA na patogênese do câncer, e poderia fornecer novos insights sobre a biologia destes cancros [20], [21], [22]. Apesar do progresso substancial de lncRNAs na patogénese do cancro, as funções biológicas de lncRNAs não são claras no CRC. Para explorar a biologia do lncRNA no CRC, este estudo foi realizado para investigar em primeiro lugar os papéis biológicos de 91H em progressão CRC e avaliar o efeito de 91H em características clínicas e prognóstico.

Neste estudo, os dados revelaram que os níveis de expressão 91H no tecido CRC foram significativamente maiores do que aqueles em tecido não canceroso correspondente. O resultado foi identificada in vitro com linhas celulares de CRC e linha humana normal das células epiteliais do intestino (Figura 7). Além disso, a sobre-expressão de 91H foi associada com metástases distantes de factores clinicopatológicas (

P

0,05). 91H foi detectada expressão de ser estável em linhas celulares de cancro da mama, e observou-se ser regulada para cima em pacientes com cancro da mama primário [14]. Mais importante, em mioblastos de rato, 91H estava determinado a estar implicados na co-regulação dos genes no locus H19 /IGF2 contribuindo para carcinogênese e progressão do câncer [16]. No entanto, a expressão 91H não foi associada com metástases distantes de factores clínico-patológicos em carcinoma do esófago de células escamosas (CICAc) [23]. As conclusões inconsistentes para conectar-se a expressão 91H com fatores clínico-patológicos pode ser devido a diferentes tipos histopatológicos. Além disso, usando os dados in vitro, que mostrou que 91H knockdown inibiu a motilidade celular, migração e invasão de células de CRC. Estes resultados indicaram que 91H pode desempenhar um papel potencial na promoção da metástase do CRC.

Além disso, nós primeiramente descrita a evidência de que os níveis de expressão alta 91H no tecido tumoral foram relacionados com mau prognóstico e 91h relativa níveis de expressão foram intimamente inter-relacionados com a má evolução clínica de pacientes, indicando a expressão de 91H pode ser servido como um valioso independente biomarcador prognóstico independente sobre as principais características clínico-patológicas, exceto para o estado de metástase. De facto, estudos anteriores indicaram que lncRNAs também foram considerados como biomarcadores moleculares em cancros. PVT-1, gerando atividade anti-apoptótica no CRC, foi identificado como um romance indicador de prognóstico para pacientes de CRC [12], [24]. Enquanto isso, HOTAIR estava envolvido na progressão do tumor e foi considerado como um romance biomarcador molecular epigenética em pacientes com CICAc ou CRC [18], [25], [26]. Por isso, consideramos que 91H pode ser um novo indicador de prognóstico potencial em pacientes com CRC.

Geralmente, nomogramas foram desenvolvidos na maioria dos tipos de câncer [27], [28], [29], que cria uma representação gráfica simples de um modelo de previsão estatística que gera uma probabilidade numérica de um evento clínico [30]. Além disso, a capacidade de nomogramas para produzir previsões individualizadas permite a sua utilização na identificação e estratificação dos doentes para a participação em ensaios clínicos [30]. Neste estudo, com base na expressão relativa 91H no tumor e factores clinicopatológicas, nomograma foi realizada para prever a probabilidade de que os pacientes no pós-operatório morreriam de CRC no prazo de 3 anos, com excepção para a morte de uma outra causa em primeiro lugar. Enquanto isso, nomograma contendo 91H teve precisão mais preditiva do que isso, sem 91H (c-index: 0,90 contra 0,85, respectivamente), indicando que a expressão 91H no tumor, obviamente, afectada nomograma precisão da previsão. Mais importante, o nomograma pode ser usado por médicos para identificar pacientes calculando sua probabilidade de pacientes no pós-operatório com CRC, e para oferecer a terapia apropriada e uma estratégia ideal. Portanto, pacientes com superexpressão de 91H devem ser cuidadosamente monitorizados e receberam terapias adjuvantes adequadas, após CRC ressecção.

A superexpressão de 91H estava envolvido na progressão do cancro [14], [23]. No entanto, razão pela qual 91H foi desregulado no tumor permaneceu desconhecida. variação do número de cópia foi uma importante forma de alteração de estrutura genômica, contribuindo para certas doenças genéticas e de desenvolvimento, incluindo o cancro do ovário e cancro da mama [31], [32]. H19 /IGF2 com variações no número de cópias, localizados na região impressa do 11p15, foi relatado em Beckwith-Wiedemann e síndromes Silver-Russell [33], [34]. Enquanto isso, o gene 91H, ARN anti-sentido de H19, também foi localizado no cromossoma 11p15.5 [14]. Por isso, pode-se especular que a sobre-expressão de 91H, em CRC pode ser associada com CNV. No presente estudo, a CNV de 91H foi observada em dois pacientes com expressão elevada 91H, e do número de cópias da eliminação 91H foi ocorreu em um paciente com CRC (Figura 2). Embora o resultado não mostrou estatisticamente significativa, forneceu uma nova estratégia potencial na investigação de regulação de genes mediada por 91H sobre o câncer. Devido ao tamanho limitado de casos incluídos neste estudo, a um estudo mais aprofundado foi precisa, no futuro, para ilustrar a relação potencial.

Algumas limitações deste estudo devem ser reconhecidas. Em primeiro lugar, o número de pacientes com CCR não foi grande. Novos estudos devem ser realizados para verificar a associação entre a expressão 91H e CRC, e para determinar se a expressão 91H foi associada a CNV em pacientes com CRC. Em segundo lugar, os períodos de seguimento não foram suficientes longa (variação, 2-36 meses), que previu com precisão não sobrevida global dos pacientes com CCR. Outras investigações foram realizadas para validar este resultado pelo acompanhamento prolongado da coorte paciente ou outra coorte de pacientes com CRC. Finalmente, todos os ensaios in vitro para as funções biológicas única foram realizados em uma única linha de células. Apesar das limitações mostrou neste estudo, esses resultados suportada a importância do papel de 91H, em várias fases de progressão do cancro promover metástases de CRC.

Em resumo, 91H expressão foi significativamente sobre-regulada em amostras de tecido e CRC linhas de celular. A expressão elevada de 91H foi associada com mau prognóstico e metástases à distância. Além disso, 91H CNV explicados apenas uma pequena percentagem de sobre-expressão observada. Cumulativamente, estes resultados indicaram que 91H desempenhou um papel vital no desenvolvimento e na progressão da CRC. Ao compreender o papel preciso da 91H na patogênese da CRC, um romance e uma estratégia terapêutica promissora seria desenvolvido para tratamento posterior CRC, com base em infra-regulação destas lncRNAs oncogênicos.

Informações de Apoio

Figura S1 . .

A relação entre a variação do número de cópias e expressão 91H em tecidos tumorais e tecidos normais adjacentes

doi: 10.1371 /journal.pone.0103022.s001

(TIF)

Figura S2.

91H expressão relativa foi quantificada em quatro linhas celulares de CRC e uma linha epitelial intestinal humana normal de células por qRT-PCR (média ± SEM; **

P

0,01)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022.s002

(TIF)

Figura S3.

células HCT-116 foram transfectadas com si-NC e si-91H. Após 48 h, expressão 91H foi efetivamente inibida por qRT-PCR em comparação com o si-NC (média ± SEM; **

P Art 0,01)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022. S003

(TIF)

Figura S4.

91H promoveu a proliferação de HCT-116 células por meio de ensaio de MTT (média ± SEM;

P Art 0,05)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022.s004

( TIF)

Figura S5.

apoptose foi investigada utilizando análise por citometria às 48 h após a infecção com si-91H ou si-NC

doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022.s005

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Figura S6.

O ensaio zero ferida foi avaliado para motilidade celular. O knockdown de 91H inibiu a motilidade celular HCT-116

doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022.s006

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Figura S7.

91H promovido invasão e migração de células HCT-116 baseado em transpoço ensaio

doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022.s007

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Figura S8.

O número de células que migraram invadido ou através da câmara foi avaliado em 5 campos de cada grupo experimental e média. O número de células invasivas ou migraram para cada grupo experimental foi considerado como a média de 5 cinco campos de visão sob um microscópio (*

P

0,05)

doi: 10.1371 /journal.pone.. 0103022.s008

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Tabela S1. informações

dos pacientes

doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022.s009

(DOCX)

Tabela S2.

Os resultados de qRT-PCR para cada amostra

doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022.s010

(XLSX)