Abstract

Micro RNAs (miRNAs) são uma classe de espécies pequenas, RNA não codificante que desempenham papéis críticos em todo o desenvolvimento celular e regulação. padrões de expressão miRNA tomadas a partir de vários tipos de tecidos muitas vezes apontam para a linhagem celular de um tipo de tecido individuais, sendo, assim, uma característica mais invariante do tipo de tecido. Um trabalho recente demonstrou que estes padrões de expressão de miARN pode ser usada para classificar células tumorais, e que esta classificação pode ser mais precisa do que a classificação obtida usando RNA mensageiro padrões de expressão de genes. Um aspecto da miARN biogénese que os torna particularmente atraente como um biomarcador é o facto de que eles são mantidos em um estado protegido no soro e de plasma, permitindo assim a detecção de padrões de expressão de miARN directamente a partir do soro. Este estudo é focado sobre a avaliação de padrões de expressão de miARN no soro humano por cinco tipos de cancro humano, da próstata, do cólon, do ovário, da mama e do pulmão, utilizando um microRNA pan-humano, microarranjo de alta densidade. Esta plataforma de microarray permite a análise simultânea de todos os microARNs humanos, quer por sinais fluorescentes ou electroquímicos, e pode facilmente ser redesenhado para incluir miARNs recentemente identificados. Mostramos que miARNs suficientes estão presentes em um mililitro de soro, para detectar os padrões de expressão de miARN, sem a necessidade de técnicas de amplificação. Além disso, somos capazes de usar esses padrões de expressão de discriminar corretamente entre amostras normais e cancerosas do paciente

Citation:. Lodes MJ, Caraballo M, Suciu D, Munro S, Kumar A, B Anderson (2009) Detecção de Câncer com soro miRNAs em um oligonucleotídeo Microarray. PLoS ONE 4 (7): e6229. doi: 10.1371 /journal.pone.0006229

editor: Alfredo Herrera-Estrella, CINVESTAV, México |

Recebido: 03 de fevereiro de 2009; Aceito: 4 de junho de 2009; Publicação: 14 de julho de 2009

Direitos de autor: © 2009 Lodes et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. CombiMatrix é uma empresa comercial com fins lucrativos, que forneceu financiamento para o estudo. investigadores principais são funcionários da empresa. Permissão de departamentos jurídicos e financeiros da empresa foi obtida a submeter a publicação, e a permissão dos supervisores foi obtido para iniciar o estudo. pessoal científico desenhado o estudo, recolhidos e analisados ​​os dados e escreveu o manuscrito

Conflito de interesses:. CombiMatrix é um comercial de empresa com fins lucrativos e os investigadores principais são funcionários da empresa. Os autores declararam que não existem outros interesses concorrentes.

Introdução

Os microRNAs (miRNAs) são moléculas de RNA de cadeia simples de cerca de 21-23 nucleótidos de comprimento, que funcionam na regulação do gene expressão. miARNs são expressos como parte de transcritos primários na forma de gancho de cabelo com sinais de clivagem da nuclease de ARNdc específico pela ribonuclease-Drosha em combinação com uma proteína de ligação a ARN. Depois de o precursor de miARN é libertado como um aproximadamente 70 nt ARN, que é transportado a partir do núcleo para o citoplasma por exportina-5, e em seguida é clivado pela ARNase III Dicer para formar um ARN de cadeia dupla. Dicer inicia a formação do complexo de silenciamento (RISC), que é responsável para o silenciamento do gene observada devido à expressão de miARN e interferência de RNA [1], [2], [3].

MicroRNAs ter induzido por ARN foi encontrada em tecidos e também no soro e plasma, e outros fluidos corporais, em uma forma estável que estão protegidos da actividade de RNase endógena (em associação com o RISC, quer livres no sangue ou em exossomas (organelas derivadas do endossoma)). Estudos realizados por Lu et al [4] demonstrou a viabilidade e utilidade de monitorar a expressão de miRNAs no tecido canceroso humano. Eles encontraram um alto nível de diversidade na expressão de miRNA através de câncer, e descobriu que cerca de 200 miRNAs poderia ser suficiente para classificar os cânceres humanos. Tam [5] que adiciona porque a função miARNs tal como os gestores rede de transcrição, que são distintos de outros biomarcadores, porque eles têm um papel patogénico no processo da doença e não são sub-produtos do estado de doença. Porque a função miARNs por ligação específica para os seus alvos, polimorfismos (SNP) dentro da sequência de miARNs ou seus mRNAs alvo pode levar à doença, incluindo o cancro. Estes SNPs específicos de miARN pode influenciar o risco de doença e pode também ser utilizada no diagnóstico destas doenças [6]. miARNs desregulados foram descritos a partir de numerosos cancros humanos incluindo da mama, pulmão, cólon, ovariano, e cancro da próstata. Mitchell et al [7] descobriram que miARNs originários de tecido de cancro da próstata entrar na circulação e pode ser utilizado para distinguir pacientes com cancro da próstata a partir de controlos saudáveis ​​e estabelecida uma abordagem de PCR baseados em sangue para a detecção de cancro da próstata humano. Uma abordagem semelhante foi usada para detectar miARN no soro de pacientes de cancro do ovário [8]. Taylor e Gercel-Taylor [9] investigou o uso de exossomas circulante no diagnóstico do cancro. Eles descobriram que o teor de miARN de células do tumor dos ovários e de circulação exossomo foi semelhante e podem ser utilizados para distinguir pacientes com cancro a partir de doentes com doença benigna do ovário e de controlos normais.

assinaturas de miARN de tecidos normais e cancerosos têm sido utilizados para classificar vários tipos de cancro e pode também permitir que os clínicos para determinar um curso de tratamento com base no tipo de tecido original. Pode também ser possível a utilização de padrões de expressão de miARN como um biomarcador para monitorizar o efeito da terapia no cancro progressão [2]. Como os perfis de expressão de miARN paralelo as origens de desenvolvimento dos tecidos, e porque relativamente poucas miARN pode ser usada com o tipo de forma eficaz os tecidos, eles são potencialmente marcadores superiores aos RNAs mensageiros para diagnóstico [4] cancro. O potencial para a utilização de soro miARNs como biomarcadores da doença e como alvos da terapêutica é promissor [10], uma vez que implicaria um teste não invasivo, preciso para o cancro. Neste estudo, demonstramos que miRNAs soro pode ser usado para discriminar entre o soro do paciente de câncer e soros dador normal, usando um ensaio de microarray simples que não requer nenhum passo de amplificação.

Resultados

extração de soro microRNA

Determinámos que uma quantidade suficiente de miARNs está presente em menos do que 1 ml de soro humano para a produção de um sinal detectável num microarray utilizando fluorescência ou detecção electroquímica (ECD). Utilizando um protocolo de extracção com fenol /clorofórmio simples, que recuperado aproximadamente 1,3 ug de ARN de soro de cada 800 ul de soro (média de 18 amostras; desvio padrão de 0,3). O padrão resultante de expressão de miARN pode ser utilizado para distinguir entre pacientes com cancro e dadores normais.

O tamanho aproximado dos pequenos RNAs recuperados a partir de plasma foi determinada através do isolamento de grandes fragmentos de ARN (baixa concentração de etanol) e fragmentos de ARN pequenas (elevada concentração de etanol), utilizando o kit de isolamento de Invitrogen PureLink miARN, após extracção com fenol ácido /clorofórmio e precipitação. Os dois fraccionamentos de tamanho de ARN foram marcadas com biotina (Mirus) e hibridado com uma micromatriz. Os resultados (não mostrados) indicou que a grande maioria do sinal era da pequena fracção de ARN, o que foi semelhante para o sinal a partir da amostra Fraccionou-un.

a contaminação de ADN do ácido nucleico extraído do soro foi analisado por comparação de uma amostra extraída que foi dividido, e metade tratada com ADNase I. Após a marcação ambas as amostras tratadas e não tratadas com biotina e hibridação com diferentes setores da mesma matriz 4 × 2K, muito pouca diferença poderia ser visto entre as amostras tratadas e não tratadas (r

2 = 0,9 e 0,96, respectivamente, para duas repetições) o que indica que pouco ADN contamina amostras (dados não mostrados).

A sensibilidade do ensaio e estabilidade

A sensibilidade do nosso ensaio miARN foi determinada pela adição de diluições de um oligonucleótido de ARN sintético para o nosso ensaio de soro durante a extracção. Fomos capazes de detectar cerca de 4.000 cópias de microRNAs soro por microlitro de soro (Figura 1). Este nível de detecção é semelhante à relatada em Mitchell et ai [7] para o cancro da próstata específica microRNA miR-141 utilizando ensaios TaqMan. microarrays miRNA são relativamente mais sensíveis do que os microarrays de expressão padrão, pois pequenos oligonucleotídeos tendem a ter melhores cinética de hibridação do que moléculas de RNA ou DNA maiores. Para miARNs, tanto a sua protecção contra a digestão por vários factores celulares, e seu pequeno tamanho contribui para a sua detecção no soro por microarrays em níveis que são tão baixos como os observados com métodos que de outro modo seria considerado mais sensível.

ARN de miARN oligonucleótidos analógicos, em concentrações que variam de 0 a 40 milhões de cópias por microlitro, foram adicionadas em 400 ul de soro após a adição de tampão de RLT. O ARN foi, em seguida, extraiu-se a partir do soro usando extracção com fenol /clorofórmio e uma precipitação com etanol. As amostras foram então marcadas e hibridadas com uma micromatriz. As barras verticais indicam as intensidades de sinal de matriz de sondas de miARN específicas que representam a sequência de tipo selvagem (Wild) e sondas com duas mutações internas (mut) para (A) remo | miR-127 | (B) remo miR-431 e. As tabelas dos pontos de dados 4.000 e 0 cópias (encaixotado em painéis da esquerda) são expandidos nos painéis à direita:. (C) remo | miR-431, e (D) remo | miR-127

Nós também ter determinado que os dados recolhidos a partir das mesmas amostras de soro depois de ter sido congelado a -80 ° C durante 1 semana após os ensaios microRNA iniciais, foi semelhante aos dados originais. MicroRNAs a partir de alíquotas de 2 amostras de soro de pacientes com cancro da próstata e (1 1) foram extraídos do cólon, marcado e hibridado com matrizes, e depois de um congelamento /descongelamento evento, novas aliquotas foram novamente extraídos, marcado e hibridado com uma segunda matriz. conjuntos de dados, a partir de re-testadas amostras de câncer de próstata 811 e amostra de cólon 792, mostraram correlações fortes quando os dados de matriz matérias foram comparados (r

2 = 0,94 e 0,96 respectivamente). Este resultado indica que o ensaio é reprodutível e estável ao longo do tempo.

análise de dados Soro microARN

várias próstata, do ovário, do cólon, da mama e amostras de soro de cancro do pulmão, bem como macho e fêmea dadores normais os soros foram analisados ​​sobre a panela de miARN-microarrays para determinar perfis de miARN no soro e para confirmar a especificidade dos perfis para diferentes tipos de cancro e dadores normais. métodos de análise de vários dados foram testados para determinar o método mais relevante para a discriminação de câncer contra o normal. Para a análise preliminar, nós registramos

2-transformado sinais de soro sonda miRNA de um dador normal e comparou esses dados para registrar dados de sondagem

2 transformadas a partir de um paciente com câncer de próstata e de uma linha de células de câncer de próstata. Embora tanto a amostra de soro do cancro da próstata e a linhagem de células do cancro da próstata amostra (22Rv1) mostraram a sobre-regulação em comparação com uma amostra de soro normal, eles não mostrou muita semelhança uns com os outros. Neste ponto, nós simplesmente observar um aumento da regulação relativa de miRNAs soro no cancro, em comparação com o soro de dadores normais (Figura 2).

Log transformado sinais de miRNA de soro normal de doadores (linha azul) foram comparados com miRNA sinais de matriz de uma linha celular de cancro da próstata 22Rv (quadrados abertos) e de um paciente de cancro da próstata (diamantes fechados). Em geral, o câncer e linha celular miRNAs parecem ser regulada para cima quando comparado com miRNAs soro de doadores normais.

Em primeiro lugar temos a intenção de definir um conjunto mínimo de testes que nos permita distinguir entre próstata e amostras normais soro. Sinal de cada sonda de miRNA foi o primeiro fundo corrigida utilizando sondas de controlo negativo. Subsequentemente, cada sonda miARN foi expresso como o logaritmo natural do rácio entre si e a mesma sonda em uma amostra de soro humano do sexo masculino normais. Isto dá um valor de 0 para todas as sondas de amostra de soro e uma base de regulação para cima ou para baixo em relação a esta amostra (normal) para todas as outras amostras (normal e cancerosas). A Figura 3 mostra os índices de um subconjunto de sondas que passados ​​vários critérios. Todos os conjuntos de dados de sonda cancro da próstata foram filtradas para remover todas as sondas cujo sinal combinação perfeita não foi maior do que o seu sinal de mutante. Quinze miRNAs foram encontrados para ser sobre-expressos no soro de todas as fases 3 e 4 pacientes com câncer de próstata (miR-16, -92a, -103, -107, -197, -34b, -328, -485-3p, -486 -5p, -92b, -574-3p, -636, -640, -766, -885-5p) em relação a 8 controles normais (Figura 3). Esta análise também mostrou um sinal ligeiramente elevada para miR-141 na fase 3 e 4 de próstata soros de pacientes de câncer (média = 829, STD = 201) ao longo de soros dador normal (média = 555, STD = 64); que está de acordo com os dados reportados por Mitchell et al [7] utilizando RT-PCR.

Após normalização conjunto de dados, o logaritmo natural da razão entre o sinal para uma sonda específica através da mesma sonda do estado normal amostra de soro foi feita. 15 miRNAs apareceu-regulação em todas as amostras de câncer estágio 3 e 4 de próstata quando comparado com soros de dadores masculinos normais. Estes miRNAs estão listados abaixo de cada conjunto de dados. Cinco fase 3 e 4 soros de cancro da próstata (Amarelo), e 8 soros normais dador macho (vermelho) foram analisados. As linhas verticais indicam ou menos um desvio padrão, além da média.

intensidades de sinal z-score-corrigidos

Na Figura 4, temos traçado para três hibridações. Z-pontuação normalização foi calculado subtraindo-se o sinal em cada sonda pela média das sondas de teste a partir de toda a hibridação, e, em seguida, dividindo esse valor por o desvio padrão do sinal entre as sondas de teste, em cada hibridização. Isso sinaliza rendimentos normalização das sondas que estão centradas e normalizados para uma média de 0 e um desvio padrão de 1,0. Para cada parcela, sinal foi classificados do maior para o menor intensidade, e plotados como uma linha sólida. Perfeito jogo /não corresponde (pm /mm) rácios foram representados como triângulos abertos sobre a linha de intensidade do sinal. Claramente, as sondas com intensidades mais elevadas têm rácios /mm significativamente mais elevados pm. Para um sinal a partir de um miARN para ser considerado significativo, o seu sinal de sonda correspondência perfeita (de tipo selvagem anti-sentido) tem de ser maior do que a sua sonda de controlo negativo (mm) mutante duplo. Especificamente, a razão PM /mm deve ser maior do que 1,5 (representada no eixo dos y do lado direito). Por esta métrica, foram consideradas significativas para a amostra de soro normal (Figura 4A), pelo menos 34 sondas. Para a linha celular de cancro da próstata e cancro da próstata amostra amostra de soro 22Rv1 (Figura 4 B e C), houve 57 e 62, respectivamente, sondas significativas. No nível mais simples, o fato de que a maioria das sondas que têm alto sinal também têm altos índices pm /mm, indica que os sinais que estão lendo são reais. Também realizamos várias hibridizações controle negativo não-miRNA. Por estas hibridações, embora algumas sondas têm um maior sinal do que os outros, isto não é acompanhado por um aumento correspondente nas proporções pm /mm (não mostrado)

(A) Análise de sinal a partir de soro normal.; (B) Análise de sinal a partir de cultura de células 22Rv1; e (C) do sinal do cancro da próstata no soro do paciente. Z-scores (linhas azuis) foram determinados subtraindo o sinal em cada sonda pela média das sondas de teste de toda a hibridação, e, em seguida, dividindo o valor resultante pela desvio padrão do sinal entre as sondas de teste, ao longo de toda hibridização.

agrupamento hierárquico.

agrupamento hierárquico foi utilizado para amostras do grupo de doenças diferentes e estados normais (Figura 5). O conjunto de dados utilizado para agrupamento continha 35 amostras de soro que eram uma mistura de amostras de soro e soro normais cancro de diversos tipos e gravidade (fases) (ver Tabelas 1 e 2). Uma vez que a maioria dos miARNs utilizados no microarray não estão presentes em níveis detectáveis ​​na maior parte das amostras de soro, o agrupamento foi realizada somente em um subconjunto de miARN. Este subconjunto foi desenhado a partir do grupo de miARNs que foram julgadas para ser significativa. sinalizar apenas a partir de conjuntos de sonda de miRNA que foram encontrados para ter sido significativo em pelo menos 5 hibridações em todo o conjunto de dados foram obtidos e usados ​​para análise posterior. Sinal a partir de sondas de teste (do tipo selvagem anti-sentido) foi de log

2-transformado. Estas sondas foram então normalizados pela conversão ao Z-score. sondas de teste somente, não qualquer um dos controles negativos ou Spike-ins, foram utilizados para este cálculo. O sinal foi, em seguida, com base no significado de limiar definido. agrupamento hierárquico foi realizada utilizando um programa escrito em casa que usa a correlação de Spearman como a função de distância. A saída para este programa é um dendrograma que foi exibida usando o programa Treeview [11]. Clustering indica uma demarcação clara entre a maioria das amostras de câncer normal e (Figura 5).

amostras de cancro e amostras de doadores normais (suportes) foram agrupados usando um programa de agrupamento hierárquico para mostrar as relações amostra-a-amostra. etiquetas de amostra incluem condição de doador (tipo de câncer ou normal), número de lote da amostra (últimos três dígitos), gênero e estágio do câncer (2-4, ou 0 para normal). Rótulos marcados com a ou b indicam repetição do teste da mesma amostra.

Calor Mapa Analysis.

Para explorar ainda mais os miRNAs responsáveis ​​pelo agrupamento, Calor mapas foram usadas para procurar semelhanças entre os padrões de expressão de miRNA dentro de cada amostra. Este método é mais eficaz quando as linhas e colunas são ordenados para permitir que esses padrões a ser facilmente identificado. Clustering foi, assim, usada para dar essa ordem (através da identificação de miRNAs que têm padrões de expressão semelhantes, e organizando-os em estreita proximidade). Estes dados foram portados para o programa de código aberto, Cluster [12]. Os dados brutos para a amostra e sinal de miRNA foram mediana centrado e, em seguida, agrupados utilizando ligação média, coeficiente de Spearman como uma função de distância. Heatmaps foram exibidos usando Treeview [11]. Este método resultou num claro ordenação das amostras tomadas a partir de nosso set-teste (Figura 6). As amostras foram marcadas com um identificador único. As amostras de soro de pacientes com cólon, da próstata, do ovário, da mama e cancro do pulmão em vários estágios de doença e do tratamento foram utilizadas neste conjunto de dados. Esta análise resultou em dois ramos principais:. Um grande conjunto de sequências que contêm a maior parte das amostras de câncer, e um segundo ramo que contém o grupo normal junto com um segundo grupo com câncer (Figura 6)

O conjunto de miRNAs usado para análise foi escolhido em função da importância em, pelo menos, 5 hibridações. Uma sonda-conjunto foi considerada significativa se a relação de perfeita correspondência-sondas (AM) /incompatibilidade (MM) foi maior do que 1.5.For cada hibridação na análise, apenas o sinal significativo foi utilizado para a aglomeração. Sinal para esses miRNAs cujo sinal foi julgado significativa por razões /MM PM foi Log 2 convertido. Em seguida, o sinal foi normalizado médio durante esse hibridação e Média Linkage Clustering foi realizada utilizando um Spearman. Clustering foi visualizada utilizando o programa TreeView [12]. O verde indica os valores negativos e vermelho indica valores positivos. As amostras são identificadas quer como normal (barra azul) ou cancro (barra amarela) na parte superior da figura. nomes de miRNA são listados à direita e as amostras identificações estão listados acima

Decisão Análise da Árvore

Para cada região madura miRNA, dois controles foram escritos no chip:.. uma sensação selvagem sonda do tipo (s), uma forma anti-sentido do tipo selvagem (PM) e um mutante duplo de controlo (MM). Este conjunto de sondas foi utilizado para avaliar a significância, bem como a intensidade de cada forma madura miARN. Para cada hibridização, o sinal bruto foi extraído e sondas foram agrupados pelo miARN que eles foram concebidos para. sinal PM foi log

2 transformada, e Z-normalizado. Para o classificador e para o câncer focado contra o agrupamento hierárquico normal, utilizou-se uma heurística simples para determinar se a sonda era de fato presente. Para cada miRNA que foi avaliada, temos um sinal significativo se o sinal para PM /MM 1.0. Se assim for, em seguida, foi utilizado o log Z-normalizado

2 (sinal) para que miARN, caso contrário os dados de sonda para sonda, que em particular não foi usada. A normalização foi, assim, realizou mais de anti-senso sondas de tipo selvagem através do chip; no entanto, apenas dados de sondas significativas foram utilizados para agrupamento e classificação.

Data Mining foi realizada utilizando o pacote WEKA [13]. Normalizada de dados intensidade sonda foi convertido para o formato ARFF e na contribuição para o programa WEKA. As hibridações foram agrupados em duas classes, ‘câncer’ e ‘normais’. Usamos a rotina CfsSubsetEval para escolher de miRNA (atributos). Este método deu a melhor classificação dos dados para as duas classes. Esta rotina avalia a capacidade preditiva de cada atributo, bem como o grau de redundância entre cada miARN. Ele prefere atributos que são altamente correlacionados dentro de cada classe, mas que têm baixa inter-correlação. A escolha de atributos foi realizada usando 10 vezes de validação cruzada, e selecção dos 28 melhores atributos baseou-se do facto de serem seleccionados, pelo menos, 30% do tempo.

A seguir extraiu-se a partir de cada sinal de hibridação para apenas este conjunto seleccionado de miARN de. Na Figura 7A, dois classificadores diferentes foram usadas para distinguir do cancro versus amostras normais. A rede Bayesiana e um método baseado em instância chamada K * [14] foram capazes de diferenciar claramente as duas classes dentro de 36 amostras. Clustering foi próximo realizada utilizando o programa Cluster de Eisen et al. [12]. ligação média foi usado como critério de construção da árvore e Spearman foi utilizado como função de distância. Figura 7 B mostra uma separação muito melhorada do normal vs. amostras de pacientes com câncer.

Data Mining foi realizada utilizando o pacote WEKA [13]. sondas de miRNA (atributos) foram escolhidos usando uma rotina de seleção atributo chamado CfsSubsteEval. (A) 28 miARNs foram encontrados utilizando este método. Dois métodos classificadores distintos, tanto a implementação da rede Bayes e K * métodos [14] foram capazes de classificar corretamente essas amostras (utilizando 10-fold cross-validation). Os resultados para ambas as corridas do classificador são apresentadas como uma matriz de confusão no lado direito. (B) de agrupamento hierárquico de amostras normais e cancerosas foi realizada por meio de sinal a partir desses 28 miRNAs. blocos vermelhos são altamente expresso, verde são considerados sub-regulada e blocos negros são não-significativo como julgado por critérios PM /MM descritos no texto. As amostras são identificadas quer como normal (barra azul) ou cancro (barra amarela) na parte superior da figura. nomes de miRNA são listados à direita e as amostras identificações estão listados acima.

Análise de amostras codificadas.

dados de microarranjos de miRNA de pacientes com câncer e soros dador normal foram codificados para remover qualquer indicação do estágio da doença e enviado para análise. Usando o subconjunto de atributos descritos acima e na Figura 7, 16 amostras simples-cego, foram adicionados ao conjunto de dados e analisadas com o classificador. O classificador k-estrela era capaz de chamar 16/16 amostras corretamente como quer a partir de pacientes com câncer ou doadores normais, enquanto o classificador Bayes Rede produziu 3 erros de classificação de 16 (dados não mostrados).

Discussão

assinaturas de expressão miARN têm um potencial papel no diagnóstico, prognóstico e terapia de doenças humanas, incluindo cancro, doenças cardiovasculares, infecções virais e doenças inflamatórias [1] – [4], [10], [15] – [25 ]. Desregulamentação dos miRNAs em câncer pode ser causado por deleções cromossômicas, amplificações e translocações; por hipermetilação de ilhas de CpG; e pela regulação da transcrição e processamento pós-transcricional [1], [2], [23]. expressão aberrante de miARN pode influenciar a progressão do cancro ao afectar a expressão de oncogenes ou supressores de tumor, e miARNs, tais como o conjunto de miR-17-92, pode funcionar directamente como oncogenes [1], [2], [23]. miARNs também estão envolvidos no cancro através do seu efeito sobre o ciclo celular, apoptose, metástase e angiogénese [1], [2], [23].

Vários estudos têm descrito as miARNs que estão associados com cancros [ ,,,0],15], [23], [26] – [32]. A maioria destes estudos utilizaram amostras de biópsias, tecidos de arquivamento ou células cancerosas [5], [33] – [37]; ou usaram miRNAs extraídos de parafina ou formalina fixo tecidos [38]. Ao comparar tecidos não-cancerosas circundante tecidos cancerosos, ou de dadores normais versus doentes de cancro, aqueles miARNs que são reguladas para cima ou para baixo pode ser identificada, geralmente após a amplificação por PCR. Muitos estudos têm sido publicados descrevendo a especificidade dos miRNAs para diferentes tipos de cânceres, estágios do câncer e tratamentos de câncer e várias revisões têm sido publicadas que resumem as informações mais recentes sobre os papéis dos miRNAs em câncer [1], [2], [5 ], [6], [15], [23], [25], [32]. Estes estudos demonstram a utilidade dos miRNAs no diagnóstico e prognóstico de diversos cânceres e também diferenciar entre câncer e doenças benignas [34]. Enquanto numerosos estudos conduziram a uma compreensão da miARN no nível da célula ou tecido, há uma escassez de dados em estudos de soro que impedem a sua utilização em diagnóstico de rotina.

Recentemente, uma série de estudos foi realizado na presente miARNs no soro [7] – [9], [39] – [41]. Em um relatório recente, miRNAs se mostraram significativamente elevados em mulheres grávidas contra mulheres grávidas não [40]; e noutro estudo, miARNs placenta foram mostrados para estar presente no plasma materno [42]. Nestes estudos, os miARNs foram encontrados para ser muito estável no armazenamento, e também a qualquer degradação com RNAse. miARNs foram recentemente mostradas por Mitchell et [7] ai a circular no soro de pacientes [7] com cancro da próstata. Em particular, miR-141 pode diferenciar pacientes com câncer de próstata de indivíduos normais [7]. Em um trabalho de Taylor e Gercel-Taylor [9], que circulam exosomes tumorais foram isolados a partir do soro de pacientes com câncer ovariano usando pérolas magnéticas e um anticorpo antiEpCAM. miARNs foram, em seguida, extraído, etiquetado e detectado por microarranjo. Esta abordagem, usando grandes volumes de soro, indicou que oito miRNAs de diagnóstico foram regulados positivamente em exossomos câncer: miR-21, miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-200b, miR-203, miR-205, e miR-214. Até à data no entanto, nenhum ensaio de rotina está disponível para análise de assinaturas de miARN no soro ou no plasma de doentes com cancro.

Um problema que aparece nestes estudos é o facto de os padrões de expressão de miARN visto no soro não são idênticos aos vistos de miRNAs tiradas diretamente de linhas celulares de cancro. No nosso estudo, verificou-se que embora tanto a amostra de soro do cancro da próstata e a linhagem de células do cancro da próstata amostra (22Rv1) mostraram a sobre-regulação em comparação com a amostra de soro normal, eles não apresentaram muita semelhança uns com os outros. Esta discrepância aparente pode ter lugar por um número de razões. O mais óbvio dos quais é a possibilidade de que as amostras colhidas a partir das linhas de células em si não são representativos do que aparece no soro. Nós podemos especular que a fonte mais óbvia de miARNs que aparecem no soro é um produto de lise de células tumorais; No entanto, também pode ser possível que a sua aparição no soro é o produto de uma forma de transporte activo envolvendo a formação de exossomas (36). Isto confundir uma comparação directa entre os padrões de expressão de miARN derivados de linha de células de tumor e com aqueles que são derivados de soro.

A informação sobre a utilização de miARNs como biomarcadores está predominantemente associada com estudos sobre amostras de tecidos ou de células de cancro linhas. padrões distintos de expressão miARN são capazes de distinguir entre o tipo de célula e estádio de vários cancros. Este é um bom augúrio para aplicações de diagnóstico e prognóstico de perfis de miRNA. Ele também indica que há claramente uma necessidade de definir os perfis de expressão miARNs no soro de doentes com cancro e compará-los com os perfis observados no soro de indivíduos que representam uma variedade de estados de doença e saudáveis. Prevê-se que os perfis de miRNA no soro têm o potencial de ser os primeiros marcadores para a detecção do câncer e também vai desempenhar um papel na monitorização do estado da doença durante a quimioterapia.

Neste estudo, nós determinamos que uma quantidade suficiente de miARNs está presente em um mililitro de soro humano para a produção de um sinal detectável num microarray utilizando fluorescência ou detecção electroquímica. No nível mais simples, este estudo demonstrou que miARNs soro são supra-regulados em doentes com cancro, em comparação com dadores saudáveis. Em uma comparação dos estágios 3 e 4 de próstata soros cancro e soro dador normal níveis de miRNA, descobrimos que 15 miRNAs (miR-16, -92a, -103, -107, -197, -34b, -328, -485-3p , -486-5p, -92b, -574-3p, -636, -640, -766, -885-5p) foram regulados positivamente no soro de pacientes com câncer de próstata em comparação com soros de doadores normal.

Mapa de calor e de cachos análises mostram que o soro de assinaturas de miARN pode também ser usado para pacientes de cancro separados e dadores normais, na maioria dos casos. Sessenta e cinco miRNAs (ver Figura 6) foram utilizados em uma análise de Mapa de Calor, que isolava 21 amostras de câncer, além de 3 amostras ensaiadas-re, a partir de amostras normais. amostras de câncer de dezesseis agrupados juntos, enquanto cinco amostras de câncer formaram um grupo separado dentro do cluster amostra normal. A análise de agrupamento (consulte a Figura 5) também foi usado para distinguir 21 amostras de câncer a partir de 12 amostras normais. Três amostras cancerosas que foram re-analisados ​​após congelamento e descongelamento e armazenamento, também agrupado com as amostras de câncer

Temos também mostraram que os miRNAs de soro podem ser detectados em um nível semelhante ao relatado por TaqMan PCR a partir do soro, aproximadamente 4.000 cópias por ul [7], e que o ensaio é estável para testes por amostragem repetida após armazenamento. A sensibilidade relativa de microarrays de miARN mais matrizes de expressão padrão pode ser devido à cinética de hibridação de oligonucleótidos pequenos. As moléculas pequenas tendem a ter melhores cinética de hibridação do que moléculas de RNA ou DNA maiores. Na verdade, a maioria dos modelos termodinâmicos para prever o comportamento de hibridização DNA foram desenvolvidos usando oligonucleotídeos curtos [43]. Muitas das conclusões tiradas de tais estudos não se aplicam quando as moléculas maiores são usados ​​como estrutura secundária, a ligação não específica, e vários outros efeitos imprevisíveis interferir com o comportamento de hibridização previsto. Para miARNs, tanto a sua protecção contra a digestão por vários factores celulares, e seu pequeno tamanho contribui para a sua detecção no soro por microarrays em níveis que são tão baixos como os observados com métodos que de outro modo seriam consideradas mais sensíveis, tais como RT-PCR. A sensibilidade da plataforma de microarray usado aqui nos permitiu controlar miARN a partir de um pequeno volume de soro e para classificar os soros como quer a partir de dadores normais ou de doentes de cancro.

Os resultados obtidos, em geral, concordam, em muitos casos com estudos publicados anteriormente.