Abstract

Fundo

O cancro do pulmão é a principal causa de mortalidade por cancro em todo o mundo, no entanto, a estratégia terapêutica para o câncer avançado de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é limitadamente eficaz. Além disso, validado desacetilase de histona (HDAC) para o tratamento de tumores sólidos continuam a ser desenvolvidos. Aqui, propomos um novo inibidor HDAC, OSU-HDAC-44, como um quimioterápico para NSCLC.

Metodologia /Principais Achados

O efeito citotoxicidade de OSU-HDAC-44 foi examinada em três linhas celulares humanas incluindo NSCLC A549 (p53 de tipo selvagem), H1299 (p53 nulo), e CL1-1 (p53 mutante). Os mecanismos antiproliferatative de OSU-HDAC-44 foi investigada por análise do ciclo celular por citometria de fluxo, ensaios de apoptose e análise de todo o genoma cromatina-imunoprecipitação-on-chip (chip-on-chip). Os ratinhos com xenoenxerto de tumor A549 estabelecidos foram tratados com OSU-HDAC-44 ou veículo de controle e foram utilizados para avaliar os efeitos sobre o crescimento de tumores, inibição da apoptose e a citocinese. OSU-HDAC-44 era um inibidor da pan-HDAC e exibe 3-4 vezes mais eficácia do que suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA) em suprimir a viabilidade celular em várias linhas celulares de NSCLC. Após tratamento OSU-HDAC-44, citocinese foi inibida e subsequentemente levado a apoptose mediada por mitocôndrias. A inibição cytokinesis resultou da degradação OSU-HDAC-44 mediada por mitose e citocinese reguladores Auroroa B e survivina. A desregulamentação da F-actina dinâmica induzida por OSU-HDAC-44 foi associado com redução da atividade RhoA resultante da indução srGAP1. ChIP-on-chip análise revelou que OSU-HDAC-44 induzida cromatina afrouxamento e facilitou a transcrição de genes envolvidos nas vias de sinalização importantes, tais como a apoptose, axon orientação e ubiquitinação de proteínas. Finalmente, OSU-HDAC 44-crescimento A549 tumor xenoenxerto eficientemente inibida e acetilação induzido de histonas e proteínas não-histona e apoptose

in vivo

.

Conclusões /Significado

OSU -HDAC-44 suprime significativamente o crescimento do tumor através da indução de apoptose e a citocinese defeito intrínseco em modelos pré-clínicos de NSCLC. Nossos dados fornecem evidências convincentes de que OSU-HDAC-44 é um HDAC alvo inibidor potente e pode ser testado para NSCLC quimioterapia

Citation:. Tang YA, Wen WL, Chang JW, Wei TT, Tan Y-HC, Salunke S, et al. (2010) A Novel histona deacetilase Inibidor Exposições antitumoral Atividade via apoptose indução, Disruption F-actina e Gene acetilação no câncer pulmonar. PLoS ONE 5 (9): e12417. doi: 10.1371 /journal.pone.0012417

editor: Chun-Ming Wong, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 22 de fevereiro de 2010; Aceito: 02 de agosto de 2010; Publicação: 14 de setembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Tang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas NSC97-2627-M-006-005 e NSC99-2628-B-006-004-MY3 do Conselho Nacional de Ciência e conceder DOH98-TD-G-111-024 a partir do Departamento de Saúde (The Executive Yuan, República da China). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de mortalidade por cancro em todo o mundo. A sobrevivência global em 5 anos de cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) é inferior a 15% em muitos países [1], [2]. A estratégia terapêutica padrão para NSCLC avançado é a quimioterapia de duplo agente baseado em platina o qual, contudo, atingiu um patamar de potência na melhoria da sobrevivência de pacientes [3], [4]. Apenas alguns “agentes alvo” mostrou ter vantagens quando usado em combinação com o agente duplo à base de platina para NSCLC de quimioterapia, tal como bevacizumab, erlotinib e gefitinib, em um subconjunto de pacientes [5], [6]. Por conseguinte, o desenvolvimento de novas drogas-alvo moleculares com eficácia mais geral para os pacientes com cancro do pulmão é uma tarefa imperativo.

As alterações epigenética, bem como alterações genéticas estão associadas a tumorigénese [7]. Um recente relatório identifica que as mudanças epigenéticas que envolvem modificações das histonas H2A e H3 em pacientes com NSCLC influenciar a sobrevida global ea sobrevida livre de doença, desde que o valor prognóstico de modificações de histonas [8]. Também revela a razão para o uso de medicamentos contra a modificação da histona como uma estratégia terapêutica para o NSCLC.

histona desacetilases (HDACs) são as enzimas que catalisam a desacetilação das histonas e epigeneticamente regulam arquitectura da cromatina e a expressão do gene. Tem sido demonstrado que a inibição de HDAC inverte estado epigenética aberrante e exibe actividades anti-tumorais potentes através da indução de paragem do ciclo celular, a diferenciação e /ou apoptose em células cancerosas diversas [9], [10]. inibidores de HDAC são classificadas em seis grupos de acordo com suas estruturas químicas e pelo menos 12 deles evoluíram para ensaios clínicos [9], [11]. Até à data, os EUA Food and Drug Administration aprova dois inibidores de HDAC, vorinostat (SAHA, ácido hidroxâmico suberoylanilide, Zolinza®) e Romidepsin (FK228, depsipéptido, Istodax®), para o tratamento de manifestações cutâneas de linfoma cutâneo de células T (CTCL ) [12]. No entanto, alguns eventos adversos ocorrem em doentes tratados com vorinostat ou outros inibidores de HDAC, que podem resultar de as concentrações elevadas de dose utilizada durante o tratamento de tumores sólidos em ensaios clínicos [11], [13].

no presente estudo, nós propomos uma nova classe de potentes inibidores de HDAC baseia-fenilbutirato, OSU-HDAC-44 [4- (2,2-dimetil-4-fenil-butirilamino) –

N

– hidroxi-benzamida ], um derivado de inibidor de HDAC conhecidos,

N

benzamida hidroxi-4- (4-fenilbutiril-amino) (HTPB) [14]. As actividades anti-tumorais e mecanismos de OSU-HDAC-44 foram estudados em células e modelos de xenoenxerto ratinhos NSCLC. Descobrimos que OSU-HDAC-44 era um inibidor pan-HDAC e exibiu 3-4 vezes mais eficácia em suprimir a proliferação de células

in vitro

e tumor de crescimento

in vivo

comparação com SAHA ou tricostatina A (TSA). Além disso, OSU-HDAC-44 induzida a mitose e citocinese defeito seguido de apoptose mediada por mitocôndrias em ambos os modelos celulares e animais. Cromatina-imunoprecipitação-on-chip análise revelou os genes-alvo do genoma, que foram induzidas por hiperacetila�o OSU-HDAC-44-mediada de cromatina. Nossos dados sugerem que OSU-HDAC-44 era um inibidor HDAC e poderia ser aplicado como droga anticâncer direcionados para NSCLC quimioterapia.

Resultados

OSU-HDAC-44 inibe a proliferação celular e mostra efeitos sinérgicos com cisplatina, independentemente do estado de p53

A estrutura de OSU-HDAC-44 e SAHA são mostrados na Fig. 1A. A análise demonstrou que ancoragem OSU-HDAC-44 interagiu com o domínio catalítico de HDAC 8, sugerindo a função directa da OSU-HDAC-44 no direccionamento HDACs (Fig. 1B).

(A) Estrutura química de OSU -HDAC-44 e SAHA. (B) Análise de ancoragem Molecular da OSU-HDAC-44 e SAHA. As estruturas de OSU-HDAC-44 e SAHA foram calculadas e o modo de acoplamento no domínio catalítico da HDAC8 foi prevista utilizando o programa de ancoragem OURO 4.0.1. efeitos (C) dependentes da dose de OSU-HDAC-44 (

esquerdo

) e SAHA (

direita) sobre a viabilidade celular em IMR90, H1299, A549 e células CL1-1. As células foram tratadas com 0,5-10 uM de OSU-HDAC-44 ou SAHA durante 48 h, e a viabilidade celular foi avaliada por ensaio de exclusão de azul de tripano. (D) OSU-HDAC-44 em sinergia com a cisplatina para suprimir a proliferação celular. As células foram expostas à cisplatina (cis) sozinho durante 4 h, OSU-HDAC-44 (HDAC-44) por si só durante 48 h, ou pré-tratados com OSU-HDAC-44 durante 48 h antes do tratamento com cisplatina durante 4 h, e, em seguida, drogas eram retirou-se e as células foram incubadas com meio isento de droga por mais 48 h. A viabilidade celular foi avaliada por ensaio de exclusão de azul de tripano. células CL1-1 foram tratados com 4,4 mM cisplatina ou 0,3 mM OSU-HDAC-44. As células A549 foram tratadas com 1,6 uM ou 0,2 uM cisplatina OSU-HDAC-44. Os dados representam a média ± SEM de três experiências independentes. *

P Art 0,05; **

P Art 0,01; ***

P

. 0,001

As atividades de inibição do crescimento de células de OSU-HDAC-44 foram avaliados em três linhagens de células NSCLC humanas, incluindo A549 (p53 wild-type) , H1299 (p53 nulo), e CL1-1 (p53 mutante). SAHA foi incluído como um inibidor de HDAC de controlo positivo. OSU-HDAC-44 inibiu significativamente a proliferação de células em todas as linhas de células de cancro, apesar das diferenças em fundo de p53, e não causa aparente citotoxicidade para células IMR90, uma linha de células de pulmão normal (Fig. 1C). OSU-HDAC-44 suprimiu a viabilidade celular das células A549 e CL1-1 com submicromolar IC

50 valores (0,65 ± 0,08 e 0,67 ± 0,01 pM, respectivamente) e o CI

50 valor de H1299 foram extrapolados para ser 1,14 ± 0,14 uM. Notavelmente, OSU-HDAC-44 exibiu 3-4 vezes mais potência do que o SAHA na capacidade anticancerígena (IC

50: A549, 1,90 ± 0,16; CL1-1, 2,85 ± 0,27; H1299, 4,87 ± 0,98 mM). Além disso, a Fig. 1D mostraram que OSU-HDAC-44 agiu em sinergia com a cisplatina para melhorar a morte celular em CL1-1 e células A549, que eram ambas as células resistentes à cisplatina.

OSU-HDAC-44 induz a inibição citocinese e apoptose

Para investigar o mecanismo subjacente de repressão do crescimento celular por OSU-HDAC-44, os efeitos da OSU-HDAC-44 na progressão do ciclo celular foi avaliado por citometria de fluxo. O tratamento com 2,5 uM OSU-HDAC-44 durante 24 horas causada células A549 e H1299 a acumular-se na fase G2 /M (4N células), e subsequentemente levado a apoptose (células sub-G1) às 48 horas de tratamento, enquanto que a exposição a concentrações mais elevadas (5 uM) de SAHA durante 48 horas teve um efeito semelhante (Fig. 2A), indicando que OSU-HDAC-44 exerceu um efeito desregulação do ciclo celular mais potente do que a SAHA. Para examinar as conseqüências celulares da acumulação de células 4N OSU-HDAC-44 mediada, foram realizadas análises microscópicas de lapso de tempo. Como mostrado na Fig. S1A, OSU-HDAC-44 causou o aparecimento da estrutura de clivagem sulco defeituoso e as duas células filhas foram fundidos em conjunto para trás, enquanto que as células não tratadas passou normalmente através da divisão celular. Concordantemente, a cerca de 20% das células tratadas com OSU-HDAC-44 foram acumulados como células bi-nucleadas, em comparação com menos de 5% das células de controlo (Fig. 2B e Fig. S1B). OSU-HDAC-44 também causou a formação de micronúcleos e interrompido a estrutura normal da F-actina de A549 e células H1299 (Fig. 2B). Assim, estes resultados sugerem que OSU-HDAC-44 pode causar citocinese aberrante e, posteriormente, levou a apoptose em células de câncer de pulmão.

(A) Os efeitos da-44 OSU-HDAC sobre a distribuição do ciclo celular em A549 e H1299 células. As células foram tratadas com 2,5 uM de OSU-HDAC-44 ou 5