Abstract

Fundo

DNA metiltransferase (DNMT) é um dos principais factores que medeiam a metilação de genes relacionados com o cancro, tais como os receptores de TGF-β (TβRs). Este por sua vez pode resultar numa perda de sensibilidade a níveis fisiológicos de TGF-β no cancro agressivo da próstata (CaP). Os mecanismos específicos de papel de DNMT em Cap permanecem indeterminados. Neste estudo, descrevemos o mecanismo de DNMT TGF-β-mediada no tampão e sua associação com os resultados clínicos após prostatectomia radical.

Metodologia /Principais Achados

Nós usamos linhas de células CaP humanos com diferentes graus de capacidade invasiva para descrever como TGF-β medeia a expressão de DNMT em Cap, e seus efeitos sobre o estado de metilação de receptores de TGF-β ea capacidade invasiva de Cap in vitro e in vivo. Além disso, determinou-se a associação entre a expressão DNMT e evolução clínica após a prostatectomia radical. Descobrimos que as células PAC mais agressivos tinham níveis de TGF-p significativamente mais elevadas, o aumento da expressão de DNMT, mas reduziu TβRs quando comparado com as células benignas da próstata e células de cancro da próstata menos agressivos. O bloqueio da sinalização de TGF-β ou activação de ERK (ERK-p) foi associada com uma diminuição drástica na expressão de DNMT, o que resulta em um aumento na expressão coincidente de TβRs. O bloqueio de qualquer sinalização TGF-β ou DNMT diminuiu drasticamente as capacidades invasivas do PAC. Inibição de TGF-β num modelo TRAMP-C2 PAC em ratinhos C57BL /6 usando 1D11 foi associada com regulação negativa de DNMTs e p-ERK e deficiência no crescimento do tumor. Finalmente, independente do grau de Gleason, o aumento da expressão DNMT1 foi associada com recorrência bioquímica após o tratamento cirúrgico para o câncer de próstata.

Conclusões e significado

Nossas descobertas demonstram que a CAP derivada TGF-β pode induzir a expressão de DNMTs em Cap, que está associado com a metilação dos seus receptores eo potencial agressivo da PAC. Além disso, DNMTs é um preditor independente de recorrência da doença após a prostatectomia, e pode ter implicações clínicas para Cap prognóstico e terapia

Citation:. Zhang Q, Chen L, Helfand BT, Jang TL, Sharma V, Kozlowski J , et ai. (2011) TGF-β Regula DNA metiltransferase Expressão em cancro da próstata, correlaciona-se com capacidades agressivas, e prevê recorrência da doença. PLoS ONE 6 (9): e25168. doi: 10.1371 /journal.pone.0025168

editor: Chun-Ming Wong, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 20 de junho de 2011; Aceito: 26 de agosto de 2011; Publicado: September 30, 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte por Grant Number 2 P50CA090386-06A2 do National Cancer Institute, NIH, bem como doações do Instituto Nacional do Câncer (U01 CA152738), Sociedade americana do Câncer, Illinois (# 08-22), Departamento de Defesa (W81XWH -09-1-0311), Portes Center /Instituto de Medicina de Chicago (QZ), American Cancer Society Institutional Research Grant (ACS-IRG 93-037-12), uma bolsa da Genzyme Corporation, uma bolsa da Saúde da NorthShore University , e um presente do Sr. Fred L. Turner. Através do emprego de SL, JH e BT, o papel da Genzyme Corporation incluíram: fornecimento de reagentes, oferecendo sugestões de desenho experimental e ajudar com a preparação do manuscrito. Os outros financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. SL, JH e BT são funcionários da Genzyme. Não existem patentes ou produtos em desenvolvimento a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

TGF-β é um fator de crescimento pleiotrópico que tem sido implicado em múltiplos, e muitas vezes funções diametralmente opostas, incluindo a proliferação celular, a paragem do crescimento celular, diferenciação e a apoptose [1], [2]. Uma pergunta óbvia levantada por estas diversas funções é como TGF-β medeia essas funções aparentemente contraditórias em ambos câncer e células benignas. Em células de cancro, de TGF-p actua como um factor de crescimento e SIDA em metástases, enquanto que em células normais parece inibir o crescimento celular e induzir a apoptose [3]. Características de cancro da próstata agressivo (PAC) incluem uma perda gradual da sensibilidade ao TGF-β e sobre-expressão de TGF-β, que aparece para iniciar um ciclo vicioso de progressão tumoral. Embora seja bem conhecido que a redução ou a perda de expressão dos receptores de TGF-β (TβRs) permite que as células cancerosas para escapar o efeito inibidor do crescimento de TGF-β e para ganhar uma vantagem de crescimento, o mecanismo celular (s) subjacente a estes eventos em células CaP humanos permanece indefinida. Anteriormente, nós demonstramos que a perda de expressão TβRs por metilação do promotor está associado com a falta de sensibilidade à inibição do crescimento de TGF-β-mediada [4].

metilação de DNA é levada a cabo por metiltransferases de ADN (DNMTs). Existem pelo menos três DNMTs funcionais que foram identificados em sistemas eucarióticos. DNMT1 tem sido implicado principalmente na manutenção de padrões de metilação que ocorre durante a replicação celular, e é, preferencialmente, metila-hemi metilado ADN [5]. Tem sido a metiltransferase de manutenção mais extensivamente estudada e é abundante nas células tumorais e tecidos. Em comparação, DNMT2 não parece ter actividade de metilação significativa e DNMT3L é susceptível de ser limitada a metilação do DNA durante o desenvolvimento da linha germinal [5]. Finalmente, DNMT3A e DNMT3B são conhecidas por serem de novo de methylators de sites CpG [6], que têm maior atividade metiltransferase de ADN não metilado que DNMT1 e podem contribuir para de metilação novo durante a embriogênese [7], [8]. Embora DNMT é relatado para ser associado a alguns cancros agressivos como os carcinomas hepatocelulares, cancro do estômago, cancros do pulmão de células não-pequenas, linfoma e cancro da próstata [9], [10], [11], [12], [13], a sua papel permanece controversa ea regulação global, a coordenação ea atividade de DNMTs é claro, com diferentes tipos de câncer. Além disso, não foram descritos o mecanismo de DNMTs em células cancerosas e sua associação com capacidades malignos invasivos e resultados clínicos após o tratamento.

Recentemente, relatou que a regulação epigenética da expressão induzida por TGF-β de Foxp3 pode ser mediada pela inactivação das cinases reguladas por sinais extracelulares (ERK), que pode regular negativamente DNMTs em células benignas [14]. Tal como acima referido, as células e tecido PAC são insensíveis à inibição do crescimento mediada por TGF-β-e têm padrões de metilação do promotor que diminuem a expressão de TβRs (TβRI e TβRII) [4], [15], [16]. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a insensibilidade ao TGF-β em algumas células tampa é pelo menos em parte devido à metilação do promotor de TβRs. Estas descobertas levaram-nos a explorar as seguintes duas hipóteses no presente estudo: 1) Pode haver interferência entre derivada tumor TGF-β e DNMTs que está relacionado com a metilação no câncer; 2) DNMTs pode estar intimamente associado com a progressão do câncer de próstata e os resultados após prostatectomia radical. Para nosso conhecimento, este assunto ainda não foi relatado.

O objetivo do nosso estudo foi várias vezes. Em primeiro lugar, procurou-se investigar as alterações correspondentes na expressão DNMT e TβRs e ativação ERK, após tratamento de células de boné e com diferentes graus de capacidade invasiva e células epiteliais benignas da próstata com TGF-β. Em seguida, examinou-se o efeito de um anticorpo neutralizante de TGF-β sobre a expressão de DNMTs e o crescimento do tumor in vivo utilizando um modelo de xenoenxerto. Por fim, determinou-se a ativação de DNMTs foi associada com recorrência bioquímica após prostatectomia radical.

Materiais e Métodos

(Uma explicação detalhada é apresentada no Método S1)

Linhas Celulares

O rato linha de células CaP células TRAMP-C2 foi obtida de Dr. N. Greenberg [12]. A linha epitelial humana benigna da próstata célula, RWPE-1, foi adquirido a partir de American Type Culture Collection (ATCC). Células BPH-1 foram gentilmente cedidas pelo Dr. Simon Hayward. Quatro variantes da PAC humano linhas-3 PC celulares (PC-3, PC-3M-Pro4, PC-3M e PC-3M-LN4) com diferentes graus de capacidades invasivas foram gentilmente cedidas pelo Dr. Fidler e Dr. Pettaway [ ,,,0],17], [18], [19], [20]. O motivo escolheu PC-3 variantes foi porque estas variantes se originam a partir da mesma linha de células, mas variam nas suas capacidades agressivos. Os resultados de sinalização regulação eram mais comparáveis ​​em contraste utilizando os diferentes tipos de linhas de células de PAC. Para algumas experiências, as células foram tornados insensíveis ao TGF-β (como controlo negativo) através da introdução de um TβRIIDN como descrito anteriormente [21], [22]. Em algumas experiências, as células foram tratadas com ou sem TGF-β1 ou MEK inibidor U0126 (Promega). Finalmente, algumas experiências envolveram o uso de anti-TGF-β (1, -2, -3) neutralização mAb (clone 1D11; um presente de Genzyme Corporation) como descrito anteriormente [23], [24]. (Método S1).

TGF-β1 ELISA

RWPE-1, todas as variantes PC3 BPH-1 e a correspondente e TβRIIDN infectadas linhas celulares foram cultivadas em meios frescos isentos de soro durante 24 horas . TGF-β1 ELISA foi realizado utilizando o Kit humano TGF-β1 Immunoassay (R D Systems). (Método S1)

[

3H] -timidina Ensaio de Incorporação de

Todas as células foram cultivadas em cultura durante 48 horas. As células foram então expostas a um meio contendo [

3H] -timidina (0,5 uCi /ml; Amersham Biosciences) durante mais 5 horas. a incorporação de timidina foi expressa como a fracção de contagens encontrado em células de controlos não tratados (Método S1).

análise Western blot

análises de Western blot foram realizadas para comparar TβRs, DNMTs e expressão de ERK após diferentes tratamentos ao longo do tempo (Método S1).

PCR de metilação-específica (MSP) e Sequenciação

MSP para o estado de metilação de TβRs foi realizada de acordo com nosso relatório anterior [4]. Foram identificados os locais metilados em posições de citosina com /sem tratamento de 5-Aza ou TGF-β.

imunofluorescência e Co-coloração

estudos de imunofluorescência foram realizados em todos os derivados de linhas celulares PC-3 como descrito anteriormente [22], [25]. Para a co-localização de DNMTs e ERK fosforilada (p-ERK), as células foram analisadas usando núcleo (DAPI) -DNMTs (TR) -p-ERK (ITCF) coloração tripla (Método S1).

Quantitative RT-PCR

células epiteliais benignas da próstata humanos RWPE-1 e BPH-1, e tampão PC-3 periódicos) foram cultivadas em meio fresco durante 24 horas, em seguida, expostas durante 24 horas quer a: 1) recombinante externa TGF-β1 (10 ng /ml), 2) Ab monoclonal neutralizante (1D11 anti-TGF-β; 5 ug /ml), ou 3) MEK inibidor U0126 (5 uM). O RNA total foi extraído usando um kit RNeasy (Qiagen). Primers para humano por DNMTs [26] e TβRs [4] foram listados no Método S1.

invasão celular ensaio

ensaio celular invasão (ensaio de invasão Matrigel) foi feito em um de 24 poços Transwell câmara (8 um de tamanho de poro; CytoSelect celular; Biolabs). As células foram colocadas em placas a uma densidade de 0,5 x 10

6-1,0 x 10

6 /mL em meio isento de soro. TGF-β1 e /ou UO126 inibidor Erk, 5-Aza foram adicionados directamente à suspensão de células, e 24 h mais tarde, a suspensão foi aspirado e as células invadidas foram contadas com um microscópio de luz sob objectivo ampliação elevada (× 100; Olympus) e mensurado pelo nm A560 num leitor de placas após o tratamento com a solução de extracção.

os estudos em animais

o estudo foi iniciado usando a via subcutânea (sc) a injecção de câncer de próstata do rato células TRAMP-C2 transfectadas com HSV1-TK-GFP-luciferase (SFG-NTGL) vector de expressão do gene repórter de [27], [28] para a região do flanco direito de 30 ratinhos C57BL /6 como descrito anteriormente [25]. Os animais foram aleatoriamente atribuídos a um de três grupos após injecções intraperitoneais com o anticorpo neutralizante anti-TGF-β 1D11 ou controlo de anticorpo específico 13C4, tal como descrito antes [23], [24]. Todos os ratinhos foram sacrificados após 15 injecções de anticorpos e o grupo 3 foram sacrificados no mesmo intervalo de tempo. (Método S1). Este estudo recebeu aprovação do Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Northwestern (Evanston, IL). Northwestern University ACUC número de protocolo de aprovação 2.007-0.565. “(Carta S1).

Construção de arrays de tecido (TMA) e evolução clínica Assement

As informações caso clínico existente e bancados tecido estabelecido na nossa foi usada próstata banco de dados do programa SPORE na Universidade Northwestern. Todos os indivíduos incluídos fornecidos consentimento informado por escrito pela Northwestern Memorial Hospital e o estudo foi aprovado pela Universidade Northwestern Institutional Review Board (IRB O número é 1480-002, Carta S2). Um total de 243 espécimes de prostatectomia radical estavam disponíveis com informação clínica associada. Uma série de próstata TMAs foram construídas com, espécimes de prostatectomia radical embebidos em parafina fixadas em formalina como descrito anteriormente [4], (Método S1 e S2 Método).

Imunohistoquímica

Todos os anticorpos produzidos contra DNMTs, ERK fosforilada (p-ERK), ERK total (T-ERK), fosforilado Smad2, TβRI e TβRII foram testados e optimizados em secções de tecido inteiro e matrizes de teste como previamente descrito [4], [17], [29 ], [30], (Método S1 e S2 Método).

Análise estatística.

O pacote de software SPSS 10.0.7 (SPSS, Inc.) foi utilizada para todas as análises. curva de sobrevivência de Kaplan-Meier foi analisada pelo teste de log-rank usando o software Graphpad Prism 4.02 (Graphpad Software) (Método S1).

Resultados

1. DNMTs expressão está associada com a regulação para baixo de TβRs e mais invasivos de cancro da próstata fenótipos

Um ensaio de ELISA foi inicialmente realizado para determinar se havia diferenças nos níveis de expressão endógenos de TGF-β em diferentes linhas celulares de CaP em comparação com quando linhas de células benignas da próstata. Verificou-se que todas as linhas celulares de PC-3 expressaram níveis significativamente mais elevados de TGF-β (× 2 a 6 vezes) em comparação com a HBP-1 e RWPE-1 (p 0,05). Além disso, verificou-se que as células mais invasivos (PC-3M e PC-3M-LN4) segregado quase 2 vezes mais elevados níveis da linha de base de TGF-β1 quando comparado com as linhas de células menos invasivos (PC-3 e PC-3M-Pro4) ( Fig. 1A).

A. ensaio ELISA demonstrando que as linhas de células PC-3 expressam de forma significativa (p 0,05) mais elevadas (2-6 × vezes) os níveis de TGF-β comparados às linhas de células benignas da próstata, BPH-1 e RWPE-1. Além disso, PC-3M e PC-3M-LN4, segregados níveis quase duas vezes mais altas da linha de base de TGF-β1 comparação com as células PC-3M-Pro4 PC-3 e, respectivamente, que são menos invasivos. B. Um ensaio de incorporação de timidina indica que o crescimento de células RWPE-1 e BPH-1 é inibida significativamente por exposição a TGF-β1. Em comparação, o crescimento de células PC-3M-Pro4 PC-3 e é apenas ligeiramente inibida, e as células PC-3M-LN4 e PC-3M não apresenta uma resposta significativa a exposição a TGF-β1. C. Em todas as linhas celulares de cancro (aqui mostram que PC-3 como um exemplo), a inibição de TGF-β usando o TβRIIDN construir resulta na expressão significativamente mais elevada TβRII naïve, e D. maior secreção de TGF-β. Achados similares são encontrados nos achados nas linhas celulares mais invasivos. Em comparação, não houve diferença na expressão de TβRII em células BPH-1 ou RWPE-1 quando eles foram infectados com TßRIIDN (Tabela S1).

confirmou que diferentes linhas de células de próstata comportam de maneira diferente em resposta à exposição exógena de TGF-β1. Por exemplo, verificou-se que as células RWPE-1 e BPH-1 foram mais sensíveis à exógena de TGF-β1 como o seu crescimento foi inibida por 64,1% e 61,9%, respectivamente, após 24 horas de tratamento com TGF-β1. Em comparação, as células PC-3M-Pro4 PC-3, e foram inibidas em 13,7% e 12,3%, respectivamente. Finalmente, a taxa de crescimento de PC-3M-LN4 e PC-3M foi afectada pela exposição a TGF-β1 (Fig. 1B). Curiosamente, em linhas celulares de CaP, a inibição da sinalização de TGF-β, usando o tipo dominante negativo do receptor de FTC-β II (TßRIIDN) construir, foi associada com significativamente maior expressão TβRII endógena (anticorpos utilizando dirigido contra o domínio intracelular, porque TβRIIDN inclui apenas extracelular e domínios transmembranares, mas não domínio intracelular) (Fig. 1C) e maior secreção de TGF-β (Fig. 1D). Em comparação, não houve diferença na expressão de TGF-β em células BPH-1 ou RWPE-1 quando elas foram infectadas com a construção retroviral TβRIIDN (Tabela S1).

Em contraste com a expressão de TGF- β, tanto TβRI e expressão TβRII foi significativamente reduzida nas linhas de células mais invasivos, PC-3M-LN04 e PC-3M, em comparação com as células PC-3M-Pro4 (Fig. 2a) e PC-3. O bloqueio da sinalização de TGF-β com o vector TβRIIDN causou um aumento de cerca de duas a dez vezes na expressão de ambas TβRI TβRII e em todas as linhas de células de fixação (Fig. 2B). Tomados em conjunto sugere que este aumento dos níveis de linha de base de TGF-β estão associados com a inibição da expressão TβRs. O bloqueio da sinalização de TGF-β intracelular resultou na sobre-regulação da secreção de TGF-β em células cancerosas.

. análises de Western blot mostram que, em contraste com a expressão de TGF-β, tanto TβRI e expressão TβRII (como descrito na Figura 1B), é significativamente reduzida nas linhas de células mais invasivas em comparação com linhas celulares menos invasivos. B. O bloqueio da sinalização de TGF-β com o TβRIIDN provoca um aumento significativo nos TβRIs expressão em todas as linhas celulares. C. Em contraste com a expressão de TβRs, a sobre-expressão de DNMTs está relacionado com linhas de células mais invasivas em comparação com as linhas celulares menos invasivos. D. O bloqueio da sinalização de TGF-β com TβRIIDN causou uma diminuição ≥3 vezes na expressão de DNMTs. O valor correspondente (razão relativa de TβRs /GAPDH, ou DNMTs /GAPDH) é mostrado nos gráficos à direita. (Fig. 2A e 2B foram da mesma imagem de Western Blot, e a Fig. 2C e 2D eram da outra imagem única mancha Ocidental).

Desde metilação do promotor de TβRs está associada com a diminuição da expressão [ ,,,0],4], foram comparados os níveis de expressão de DNMTs nas diferentes linhas celulares de CaP. Em geral, as células PC-3M-LN4 e PC-3M mais invasivos apresentaram um aumento na expressão de DNMTs, quando comparado com o menos invasivo PC-3 e PC-3M-Pro4 (Fig. 2C). O bloqueio da sinalização de TGF-β com o vector TβRIIDN causou uma diminuição ≥3 vezes na expressão de DNMTs em todas as linhas de células de fixação (Fig. 2D), e houve um aumento correspondente na expressão de ambas TβRI e TβRII (Fig. 2B). O valor correspondente (razão relativa de TβRs /GAPDH, ou DNMTs /GAPDH) é mostrado em painéis à direita. Esta conclusão foi também apoiada por estudos confirmatórios adicionais. análises de imunotransferência demonstraram que após o tratamento com 5-Aza-2′-desoxicitidina (5-Aza), a expressão de TβRI e TβRII em PC-3 aumentou dramaticamente. Em contraste, a expressão de ambos TβRI e TβRII diminuiu significativamente com o tratamento de TGF-β e esta alteração pode ser recuperada quando 5-Aza é adicionada (Figura S1A). Da mesma forma, PCR em tempo real confirmou que a expressão de ambos TβRI e TβRII foi aumentada de 2 a 2,5 dobras após o tratamento de 5-aza em células PC-3. O tratamento com TGF-β suprimidas as expressões de TβRI e TβRII 46% e 29% respectivamente (Figura S1B). Também identificou o estado de metilação de TβRI e TβRII promotores, usando as mesmas metodologias de abordagem MSP e sequenciamento [4]. Usando esta técnica, encontramos os mesmos locais metilados como nosso estudo anterior [4], em que a citosina posiciona -251, -231, -244, -348, -356 e -365 no promotor de TβRI e +27, +32 e -140 para o promotor de TβRII foram metilados (Figura S1C). As células PC-3 também tem uma porção de TβRI TβRII e promotores que são não metilado. Curiosamente, o tratamento com TGF-β aumentou o estado de metilação, mas o tratamento com 5-Aza convertido para todos os locais metilados não metilado. O ensaio de incorporação de timidina indicou que a proliferação de células PC-3 foram apenas modestamente inibida modestamente por exógena de TGF-β. Em comparação, 5-Aza tratamento resultou na inibição significativa da proliferação de células, independentemente do facto de exógena de TGF-β foi adicionada à cultura ou não. Não houve diferença significativa observada entre o tratamento com 5-Aza ambos e TGF-β ou apenas com 5-Aza (P 0,05) (Figura S1D)

2.. DNMTs expressão é mediada através de uma via dependente de ERK fosforilada-

Os nossos estudos anteriores demonstram que a ERK pode influenciar a expressão em células benignas DNMT [14]. Por conseguinte, procuraram determinar se o nível de ERK activada (ERK fosforilada; p-ERK) está relacionada com a expressão de TGF-induzida por β de DNMTs. Para testar esta hipótese, determinou-se pela primeira vez o nível de p-ERK nas células benignas da próstata e comparou-o com os níveis em diferentes linhas celulares PAC. células BPH-1 e RPWE-1 expressa níveis basais significativamente mais elevados de p-ERK do que as células PC-3 (Fig. 3a). Curiosamente, o curso do tempo da expressão de p-ERK após exposição a TGF-β foi diferente entre as linhas de células benignas e malignas. Especificamente, houve uma correlação positiva entre dependente do tempo de tratamento com TGF-β1 e a expressão de p-ERK em todas as linhas celulares de PC-3. Na verdade, este rápido aumento da expressão de p-ERK (4 vezes) começou dentro de 5 minutos após o tratamento de TGF-β1. Os níveis de p-ERK continuou a aumentar durante aponta todos os tempos subsequentes até 30 minutos após a adição de TGF-β1. Em contraste, a expressão de p-ERK foi inibida rapidamente ( 5 minutos) após a adição de TGF-β1 aos meios de comunicação de células benignas, de uma forma que era independente da expressão de proteínas ERK total (Fig. 3A). os estudos de imunofluorescência foram subsequentemente usadas para ajudar a determinar se p-ERK e DNMTs foram co-localizada com as mesmas regiões celulares. Para este fim, uma análise microscópica confocal de formaldeído fixo imunocoradas células PC-3, na ausência ou na presença de TGF-β1, demonstraram co-loczalization entre sinais de p-ERK e DNMTs. Apenas as células com imunofluorescência p-ERK exibiu DNMT expressão. Em contraste, quando as células de PC-3 foram tornados insensíveis ao TGF-β1 por transfecção com o TβRIIDN, ambos os níveis de p-ERK e DNMTs foram drasticamente reduzida, conforme determinado por coloração com immunofluorsence (Fig. 3B). Para melhor quantificar essa relação entre TGF-β1, p-ERK e DNMTs, nós próxima utilizado PCR em tempo real. Estes resultados demonstraram que a exposição a TGF-β1 durante 24 horas aumentou significativamente a expressão de todas as três DNMTs (~16.7% -14%) em todas as células PC-3 linhas estudadas. O tratamento com um anticorpo específico para o TGF-β1 (1D11; 5 mg /ml) ou o inibidor de ERK específica, UO126, conduziu a uma significativa diminuição da regulação da expressão de ARNm DNMTs (~33.9% -52,3%, -57,6% e ~41.5% respectivamente, a Fig. 3C). Estes resultados sugerem que o TGF-β expressão mediada de DNMTs está associada com um aumento da p-ERK em células cancerosas. Especificamente, derivada do tumor de TGF-β parece ser responsável por esta activação de ERK, como bloqueio do original TGF-β secretada resultou numa grande alteração na expressão de DNMTs (Fig. 3C). Estes resultados também sugerem que o derivado de tumor TGF-β activação de ERK mediada por, pelo menos, é um dos principais mediadores para o TGF-β expressão de DNMTs que conduzem a TβRs induzidas a sub-regulação por metilação do promotor no tampão [4], [14]. Após o tratamento com TGF-β, houve um aumento significativo na capacidade invasiva de células de PAC. A invasão de células de PAC foi inibida por qualquer inibidor de TGF-β 1D11, ou inibidor de p-U0126 ou Erk DNMT inhibor 5-Aza. A inibição da invasão pelo U0126 não poderia ser invertida por tratamento com TGF-β1. Importante, DNMTs inibidor da 5-Aza pode inibiu drasticamente a invasão células PAC, ainda mais do que o bloqueio de TGF-β ou p-ERK (Fig. 3D). Esta observação sugeriu que a p-ERK foi fator jusante do TGF-β, e sinergicamente medeia TGF-β DNMTs que estava intimamente associados com a capacidade invasiva de células CaP regulado.

A. As células benignas HBP-1 e 1-RPWE expressar níveis basais significativamente mais elevados de p-ERK do que as células PC-3. Existe uma correlação positiva entre dependente do tempo de tratamento com TGF-β1 e a expressão de p-ERK em células PC-3. Os níveis de p-ERK continuar a aumentar durante aponta todos os tempos subsequentes até 30 minutos após a adição de TGF-β1. Em contraste, a expressão de p-ERK é rapidamente ( 5 minutos) inibida após a exposição a TGF-β1 em células benignas numa forma que é independente da expressão de proteína total de ERK. B. imunofluorescência revela que apenas as células (isto é PC3, por exemplo) que expressam p-ERK expressão exposição DNMT. Em contraste, quando as células PC-3 são tornados insensíveis ao TGF-SS1 por TβRIIDN, os níveis de p-ERK e DNMT são significativamente reduzidos (ampliação: 10 × 20). C. Foi realizada PCR em tempo real para melhor quantificar a relação entre TGF-β1, p-ERK e DNMTs. A exposição a TGF-β1 aumentou significativamente a expressão de todas as três DNMTs em células PC-3. O tratamento com 1D11, ou inibidor da MEK, UO126 está associada com a infra-regulação da expressão de ARNm todos DNMT. D. (Aqui nós mostramos mais agressivo PC-3M como um exemplo). Houve um aumento significativo na motilidade celular através de uma membrana de policarbonato de Matrigel-revestido sob o tratamento de TGF-β1 (10 ng /mL). A invasão de células de todos os PAC pode ser inibida através do bloqueio do sinal de TGF-β por 1D11 ou usando um UO126 inibidor de p-ERK, ou DNMT inibidor da 5-Aza separadamente. A inibição da invasão de UO126 não pode ser revertido por tratamento TGF-β. Superior painel direito: números correspondentes de células invasoras. Painel inferior direita: os valores de absorção. Este resultado indica p-ERK induzida por TGF DNMT-β mediada potencia a capacidade invasiva de linhas de células de cancro da próstata. (Ampliação de 10 × 10).

3. Na validação in vivo dos efeitos do TGF-β sobre a activação de ERK, DNMT expressão, e o crescimento do cancro da próstata

para validar se o TGF-β é responsável pela activação da ERK e a sobre-regulação de DNMTs que podem estar envolvidos na progressão do tumor in vivo, realizaram experiências utilizando um modelo de tampa rato xenoenxerto que envolveu a injecção de células de tumor (células CaP TRAMP-C2 estavelmente transfectadas com um HSV1-TK-GFP-luciferase repórter, 5 × 10

6 /cada rato). O crescimento do tumor foi seguido utilizando imagiologia de luciferase. Foram utilizados três grupos de ratos para compreender melhor os efeitos do TGF-β na ativação ERK e expressão DNMT: Grupo 1: ratos (n = 10) recebeu injeções regulares do anticorpo TGF-β neutralizar, 1D11. Grupo 2: ratinhos (n = 10) receberam o anticorpo de controlo de isotipo, 13C4, nos mesmos intervalos regulares, tal como o Grupo 1. Grupo 3: recebeu nenhum tratamento após a injecção de xenoenxerto como um controlo. Verificou-se que o crescimento do tumor foi significativamente inibida com anticorpo anti-TGF-β 1D11, tratamento (Grupo 1) comparada com os outros dois grupos (Fig. 4A, 4B). Na verdade, no fim do período de tratamento de 45 dias, um dos dez ratinhos (10%) neste grupo era livre de tumor. Nos restantes 9 ratinhos, o peso médio do tumor e o volume foi de 5,3 g e 6,85 cm

3, respectivamente. Em comparação, os tumores foram encontrados em todos os ratinhos nos grupos 2 e 3. O peso médio e o volume dos tumores nos 10 animais tratados com o anticorpo de controlo (grupo 2) ou nenhum tratamento (Grupo 3) foi significativamente maior (Fig. 4C) . Não houve metástases em todos os grupos, como avaliadas por imagem de bioluminescência. As análises de imuno-histoquímica dos tumores primários revelou que a expressão de p-ERK e DNMTs em animais do Grupo 1 foram significativamente inferiores aos dos outros dois grupos (Fig. 4D).

a. IVIS sistema 100 de imagem foi usada para controlar o crescimento do tumor em tempo real. Verificou-se que o crescimento do tumor é inibido drasticamente com o tratamento de 1D11 comparado com o Grupo (tratamento 13C4) 2 e 3 (sem controle de tratamento). B. tratamento 1D11 inibe o crescimento do tumor de um modo dependente do tempo. C, No final do período de tratamento de 45 dias, os ratinhos foram sacrificados e os tumores foram isolados. O peso médio do tumor e do volume foi de 5,3 g e 6,85 cm

3, respectivamente, em 1D11 grupo de tratamento. Em comparação, o peso médio e o volume dos tumores nos 10 animais tratados com o controle de 13C4 foi significativamente maior em 15,8 g e 12,85 cm

3, respectivamente. Os valores correspondentes no ratos que não receberam tratamento foram 31,4 g e 23,39 cm

3, respectivamente (

P Art 0,01 entre os três grupos). D. Análise imunoistoquímica dos tumores primários revelou que a expressão de p-ERK, DNMTs em animais com tratamento 1D11 é significativamente menor do que os dos outros dois grupos.

4. DNMTs se correlaciona com características clínicas

Para avaliar a associação entre TGF-β ea indução de DNMTs em amostras PAC, foram comparados os níveis de TGF-β1 de expressão, ERK, p-ERK, TβRI, TβRII, p- Smad2 e DNMTs em amostras de tissue microarray arquivados obtidos no momento da prostatectomia radical e correlacionados-los com características clínicas e patológicas dos pacientes correspondentes (Tabela S2 Cada marcador foi atribuído um valor de 0 ( . imunomarcação de células 20%), 1 ( 20-49% imunocoloração de células), 2 (50-74% imunocoloração de células) e 3 (a imunocoloração de células de 75-100%), dependendo da percentagem de células cancerosas que mostra a imunocoloração positiva. a coloração de controlo positivo e negativo se mostrou na “Figura S2 “. Verificou-se que um nível elevado de expressão de TGF-β1, p-ERK e DNMTs acoplados com um baixo nível de expressão de TβRI, TβRII, e p-Smad2 foi associada com características patológicas adversos, tais como uma maior grau de Gleason ( a Fig. 5A, Fig. 5B, Tabela S3). Estes resultados correspondem a nossa constatação de PC-3M-LN4 e células PC-3M que o TGF-p DNMTs induzidas estão associados a fenótipos clinicamente mais agressivos.

a . A análise imuno-histoquímica de secções de TMA em série a partir de um paciente com pontuação de 8 de Gleason, revelou maior expressão de TGF-β, p-ERK, DNMTs, mas menor expressão de TβRI e TβRII e p-Smad2, em comparação com secções em série, retirados de uma paciente com um menor grau de 6. de Gleason Estes resultados são representativos do padrão de coloração predominante visto em todas as amostras de pacientes /arranjos de tecido (aumento de 10 × 20). A frequência correspondente (ou percentagem) de coloração e da intensidade da coloração pode ser encontrado em níveis BB elevados de TGF-β1 expressão (Pontuação = 3) foram identificados em 42,3%, 8,9% e 7,0%, expressão de p-Erk em 36,4%, 6,7% e 13,5%, expressão DNMT1 em 27,9%, 1,8% e 1,3%, expressão DNMT3A em 40,6%, 11,9% e 6,7%, e expressão DNMT3B em 58,7%, 18,3% e 22,8% de alta (≥8), intermediário