Abstract
MDA-7 /IL-24 foi envolvido na apoptose câncer específica através da supressão de expressão de Bcl-2, que é uma proteína de regulação de apoptose chave da via de morte mitocondrial. No entanto, os mecanismos subjacentes do presente regulamento não são claras. Relatamos aqui que o tumor-seletiva replicante adenovírus ZD55-IL-24 leva a Bcl-2 S-denitrosylation e ubiquitination concomitante, que participam na degradação do proteassoma 26S. IL-24 siRNA blocos completamente Bcl-2 de ubiquitinação via de reversão de Bcl-2 S-denitrosylation e protege-o de degradação proteossómica que confirmou o papel significativo de MDA-7 /IL-24 na regulação da modificação pós-tradução da proteína Bcl-2 em células cancerosas . O óxido nítrico (NO) é um regulador chave da proteína S-nitrosilação e denitrosylation. O dador de NO, nitroprussiato de sódio (SNP), sub-regula a Bcl-2 S-denitrosylation, atenua a Bcl-2 e, subsequentemente, ubiquitinação neutraliza MDA-7 /IL-24 induziu a apoptose de células de cancro, ao passo que nenhum inibidor de 2- (4-carboxifenil) –4,4,5,5-tetramethylimidazoline 1-oxi-3-óxido (PTIO) mostra o efeito oposto. Ao mesmo tempo, estes moduladores NO deixar de afectar a fosforilação de Bcl-2, sugerindo que o NO regula a estabilidade de Bcl-2 de um modo independente de fosforilação. Além disso, a Bcl-2 S-redução nitrosilação induzida por ZD55-IL-24 foi atribuída tanto de iNOS diminuição e aumento TrxR1. iNOS siRNA facilita a Bcl-2 S-denitrosylation e ubiquitina-degradação, ao passo que o inibidor da auranofina TrxR1 impede Bcl-2 a partir de denitrosylation ubiquitinação e, assim, impede a activação da via de sinal de caspase e subsequente apoptose de células de cancro. Tomados em conjunto, os nossos estudos revelam que a MDA-7 /IL-24 induz a Bcl-2 S-denitrosylation através da regulação da iNOS e TrxR1. Além disso, denitrosylation de Bcl-2 resulta na sua ubiquitinação e subsequente activação da caspase família de protease, como uma consequência, susceptibilidade a apoptose. Estes resultados fornecem uma visão nova em MDA-7 /IL-24 induzida a inibição do crescimento e apoptose carcinoma
citação:. Tian H, Wang J, Zhang B, Di J, Chen M, Li H, et al. (2012) MDA-7 /IL-24 induz a Bcl-2 Denitrosylation e ubiquitina-Degradação Envolvidos na Cancer Cell apoptose. PLoS ONE 7 (5): e37200. doi: 10.1371 /journal.pone.0037200
editor: Demetrios Vavvas, Massachusetts Eye Ear Infirmary-Harvard Medical School, Estados Unidos da América
Recebido: 06 de dezembro de 2011; Aceito: 16 de abril de 2012; Publicado em: 21 de maio de 2012
Direitos de autor: © 2012 Tian et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este projecto foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (Nos. 81071854) e do Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Jiangsu (BK2010177, BK2010179). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a interleucina 24 (IL-24), também chamado de diferenciação gene associado a melanoma-7 (MDA-7), é um membro único da família de genes IL-10, que apresenta uma indução selectiva de apoptose específica sem cancro efeitos deletérios sobre as células normais [1] – [3]. MDA-7 /IL-24 induz a supressão do crescimento e apoptose em um amplo espectro de células de cancro humanas, incluindo o melanoma, glioma maligno, e carcinomas da mama [4] – [8]. O envolvimento de células MDA-7 apoptose /IL-24 induzida em tecidos de tumor foi associado com retículo endoplasmático o stress (ER) e disfunção mitocondrial e produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS) [7], [9], [10]. Além disso, MDA-7 /IL-24 induzida uma potente actividade “espectador antitumoral”, a capacidade de bloquear a angiogénese tumoral, a sinergia com radioterapia, quimioterapia, terapias de anticorpos monoclonais e actividade moduladora imunitária [11], [12], o que o torna um ideal ferramenta para a terapia genética do cancro.
Embora as vias pelas quais MDA-7 /IL-24 intensifica a apoptose em células tumorais não são ainda completamente elucidado, provas de vários estudos sugerem que a MDA-7 /IL-24 medeia muitas proteínas importante para o aparecimento de inibição do crescimento e o envolvimento da via de morte celular por apoptose mitocondrial [7]. gene de linfoma de células B 2 (BCL-2), um dos membros da Bcl-2 family anti-apoptóticos, está localizada na membrana mitocondrial externa. Alguns mecanismos de anti-apoptóticos Bcl-2 incluem a regulação da homeostase do cálcio e neutralização de proteínas pró-apoptóticas Bax por formação de heterodímeros. Além disso, a Bcl-2 promoveu o bloqueio da libertação de citocromo C e a associação com o factor de apoptose mitocondrial Apaf1, finalmente impediu a activação de caspase família protease e preservada a integridade mitocondrial [13], [14]. MDA-7 /IL-24, Bcl-2 reprimiu a expressão da proteína, que, assim, aumentou a proporção de pro- específica e das proteínas anti-apoptóticas inclinar o balanço de sobrevivência para morte em células de carcinoma. Em contraste, a sobre-expressão de Bcl-2 de células de cancro da próstata protegido de MDA-7 apoptose /IL-mediada 24, sugerindo que a Bcl-2 desempenha um papel importante na apoptose de células de cancro em resposta a MDA-7 /IL-24 [8]. No entanto, o mecanismo exato pelo qual a MDA-7 /IL-24 regulada de Bcl-2 a fim de facilitar a disfunção mitocondrial não foi identificado. No presente estudo, utilizou-se adenovírus de replicação do tumor selectivo que expressam a IL-24 (ZD55-IL-24) que suprimiu o gene essencial viral E1B de 55 kDa e exerceu uma forte efeito citopático e apoptose significativa em células tumorais sem células normais [15] para explorar ainda mais o mecanismo de MDA-7 /IL-24 indução de Bcl-2 para baixo-regulação e subsequente apoptose de células de carcinoma.
(a) Tempo análise de curso da expressão da proteína IL-24 em Hela, A375 e 7860 células tratadas com ZD55-IL-24 (MOI 20). (B) o tempo de análise curso da expressão da proteína E1A em HeLa, A375 e 7860 células tratadas com ZD55-IL-24 (MOI 20). análise de curso (C) Tempo de expressão de Bcl-2 em proteína HeLa, A375 e 7860 células tratadas com ZD55-IL-24 (MOI 20). β-actina foi utilizado como um controlo de carga. (D) ZD55-EGFP (5 MOI) transportando genes relatório EGFP foi utilizado para detectar a eficiência de infecção do adenovírus replicativo em diferentes pontos de tempo (ampliação de × 200). (E) HeLa, A375 e 7860 a viabilidade das células tratadas com ZD55-IL-24 (MOI 20) aos diferentes pontos de tempo foram determinadas por ensaio MTT. Os dados são médias ± desvio padrão (S.D.) de três experiências independentes (n = 3); *
p
. 0,05 em relação grupo controle
(A) Efeitos dos diferentes títulos de ZD55-IL-24 (0,1 MOI, 1 MOI, 5 MOI, 10 MOI , 20 MOI) em Bcl-2 expressão induzida por transferência de Western 48 h após a infecção de ZD22-IL24. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. (B) ZD55-EGFP com os diferentes títulos foi utilizado para detectar a eficiência da infecção de adenovírus replicativa (ampliação x 200). a viabilidade das células (C) Hela tratadas com os diferentes títulos de ZD55-IL-24 foi determinada pelo ensaio de MTT. Os dados são médias ± desvio padrão (S.D.) de três experiências independentes (n = 3); *
p Art 0,05 em relação grupo controle
(A) Hela, A375 e 7860 células em resposta a ZD55-IL-24 (20 MOI) foram preparados para imunoprecipitação usando. anticorpo anti-Bcl-2. Os complexos imunes resultantes foram analisados para anticorpos anti-S-nitrosocysteine por Western blotting e ficou por Bcl-2 nível S-nitrosilação no momento em diferentes pontos 12 h, 24 h, 36 h e 48 h, respectivamente. (B) Tempo de curso de Bcl-2 em células HeLa ubiquitinação foi detectada por imunoprecipitação usando anticorpo anti-Bcl-2 e, em seguida, seguido de imunotransf erência com anticorpos anti-ubiquitina. (C) Efeito de IL-24-siARN (100 nM) sobre a IL-24, Bcl-2, Bcl-2 S-nitrosilação e ubiquitinação em células HeLa foi detectada por transferência Western e de co-imunoprecipitação. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. As bandas correspondentes foram digitalizadas e a densidade óptica (D.O.) foi determinada como a mudança de dobragem contra grupo de controlo. Os dados são médias ± desvio padrão (S.D.) de três experiências independentes (n = 3); *
p Art 0,05 em relação grupo controle;
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p Art 0,05 em relação grupo siRNA mexidos
(A) Tempo análise de curso de caspase-9, caspase-3 e PARP em células HeLa tratadas com ZD55. -IL-24 (MOI 20). As bandas correspondentes foram digitalizadas e a densidade óptica (D.O.) foi determinada como a mudança de dobragem contra grupo de controlo. (B) a apoptose precoce e tardia de apoptose em células HeLa foram detectados por coloração das células com Anexina V-FITC (cor verde) e iodeto de propídio (cor vermelha) em diferentes pontos de tempo. células (C) Hela tratadas com ZD55-IL-24 para o tempo diferentes foram coradas com anexina V-FITC /iodeto de propídio (PI) e imediatamente analisadas por citometria de fluxo. Os dados são apresentados como a percentagem de células positivas para anexina V a partir de três experiências independentes. *
P
. 0,05 contra grupo de controlo
(A), HeLa, células A375 e 7860 foram pré-tratados com ZD55-IL-24 (MOI 20) durante 24 h e, em seguida tratada com NÃO SNP dador (2 mM), sem inibidor PTIO (300 uM) e SNP co-administração de agente redutor DTT (10 mM), durante 6 h, respectivamente. Bcl-2 S-nitrosilação foi detectada por imunoprecipitação usando anticorpo anti-Bcl-2 e, em seguida, seguido de imunotransf erência com anticorpo anti-S-nitrosocysteine. (B) Efeito de NO moduladores em Bcl-2 em células HeLa ubiquitinação foram detectados por imunoprecipitação usando anticorpo anti-Bcl-2 e, em seguida, seguido de imunotransf erência com anticorpos anti-ubiquitina. (C) Efeito de NO moduladores de expressão de Bcl-2 em HeLa, A375 e 7860 células foi detectada por transferência Western usando anticorpo anti-Bcl-2. (D) HeLa, A375 e 7860 células foram pré-tratadas com ZD55-IL24 durante 24 h e, em seguida, tratada com MG132 inibidor de proteossoma (10 | iM) durante 6 h. Expressão de Bcl-2 foi analisada por transferência Western usando anticorpo anti-Bcl-2. (E) de Bcl-2 em células HeLa fosforilação foi detectada por transferência Western com anticorpo anti-P-Bcl-2 (Ser87). β-actina foi utilizado como um controlo de carga. As bandas correspondentes foram digitalizados e as intensidades foram determinados por medições de densidade óptica (O.D). Os dados são médias ± desvio padrão (S.D.) de três experiências independentes (n = 3).
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p Art 0,05 em relação ZD55-EGFP; *
p Art 0,05 em relação ZD55-IL-24 grupo;
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. 0,05 em relação grupo DMSO
células Hela (A) foram pré-tratados com ZD55-IL24 (20 MOI) durante 24 horas e depois acrescentou com NO SNP dador (2 mM), sem inibidor PTIO (300 uM), a co-administração de SNP do agente redutor DTT (10 mM) e inibidor de proteossoma MG132 (10 | iM) durante 6 h, respectivamente. Procaspase-9 clivada, caspase-9, pro-caspase-3 clivada, caspase-3 foi detectada por transferência Western. (B) efeito do NO moduladores SNP, Ptio, SNP + TDT e MG132 inibidor do proteassoma em apoptose precoce e apoptose tardia em células HeLa tratadas com ZD55-IL-24 foram detectados por coloração com anexina V-FITC (cor verde) e iodeto de propídio (cor vermelha), respectivamente. células (C) HeLa foram coradas com anexina V-FITC e iodeto de propídio e imediatamente analisadas por citometria de fluxo. (D) efeitos do NO moduladores e MG132 em Hela viabilidade celular foram determinadas por ensaio MTT. As bandas correspondentes foram digitalizadas e a densidade óptica (D.O.) foi determinada como a mudança de dobragem contra grupo de controlo. Os dados são médias ± desvio padrão (S.D.) de três experiências independentes (n = 3).
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p Art 0,05 em relação grupo ZD55-EGFP; *
p Art 0,05 em relação ZD55-IL-24 grupo;
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p Art 0,05 em relação grupo DMSO
(A) Análise de curso Tempo de expressão iNOS em Hela, A375 e 7860 células tratadas com ZD55-IL-24. (MOI 20). (B) HeLa, A375 e 7860 células foram transfectadas com ARNsi de iNOS (100 nM) durante 12 h, em seguida, tratados com ZD55-IL-24 durante 12 h. Efeito da iNOS siRNA na expressão de iNOS foi analisada por Western blotting. (C) Efeito de iNOS siRNA na expressão da proteína Bcl-2 foi analisada por transferência Western. (D) Efeito de iNOS siRNA em Bcl-2, S-nitrosilação foram detectados por imunoprecipitação usando anticorpo anti-Bcl-2 e, em seguida, seguidos por imunotransferidas com anticorpo anti-S-nitrosocysteine. (E) Efeito da iNOS siRNA na ubiquitina-Bcl-2 foi detectada por imunoprecipitação usando anticorpo anti-Bcl-2 e, em seguida, seguido de imunotransf erência com anticorpos anti-ubiquitina. (F) Efeito de iNOS siRNA em caspase-9, caspase-3 e PARP em células HeLa foi detectada por transferência Western. As bandas correspondentes foram digitalizadas e a densidade óptica (D.O.) foi determinada como a mudança de dobragem contra grupo de controlo. Os dados são médias ± desvio padrão (S.D.) de três experiências independentes (n = 3). *
p Art 0,05 em relação grupo controle;
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. 0,05 em relação grupo siRNA mexidos
(A) Tempo análise de curso de expressão TrxR1 em Hela, A375 e 7860 células tratadas com ZD55-IL 24 (20 MOI). (B) HeLa, A375 e 7860 células foram tratadas com ZD55-IL-24 durante 24 h e, em seguida, adicionado com TrxR1 inibidor auranofina (5 ^ M) durante 6 h. Efeito de inibidor de auranofina TrxR1 na expressão da proteína TrxR1 foi detectada por transferência Western. (C) Efeito de inibidor TrxR1 auranofina na expressão da proteína Bcl-2 em HeLa, A375 e 7860 células foi detectada pelo ensaio Western Blot. (D) Efeito do inibidor TrxR1 auranofina em Bcl-2, S-nitrosilação foi detectada por imunoprecipitação usando anticorpo anti-Bcl-2 e, em seguida, seguido de imunotransf erência com anticorpo anti-S-nitrosocysteine. (E) Efeito do inibidor de auranofina TrxR1 em Bcl-2 em células HeLa ubiquitinação foi detectada por imunoprecipitação usando anticorpo anti-Bcl-2 e, em seguida, seguido de imunotransf erência com anticorpos anti-ubiquitina. (F) Efeito do inibidor TrxR1 auranofina em caspase-9, 3 e PARP foi detectada por transferência Western. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. As bandas correspondentes foram digitalizadas e a densidade óptica (D.O.) foi determinada como a mudança de dobragem contra grupo de controlo. Os dados são médias ± desvio padrão (S.D.) de três experiências independentes (n = 3). *
p Art 0,05 em relação ZD55-EGFP;
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p Art 0,05 em relação grupo DMSO
(I) IL-24 inibe a expressão iNOS levando a redução de NO volume de negócios e atenuação da Bcl-2 S-. nitrosylation. (II) Trx denitrosylates S-nitrosilado Bcl-2 através da sua porção de ditiol, formando desse modo uma reduzida Bcl-2 e oxidado Trx; Trx oxidado é reduzido (e portanto reactivada) pelo FLAVOPROTEÍNA-seleno Trx redutase (TrxR) e NADPH, sugerindo que TrxR através da redução oxidado Trx pode facilitar a Bcl-2 denitrosylation. (III) Sob condição basal, Bcl-2 S-nitrosylation estabiliza a estrutura da proteína e resiste à degradação ubiquitina-proteassoma. A formação de heterodímeros com proteínas pró-apoptóticas, tais como Bax, a inibição da libertação de citocromo c e activação de caspases de proteases da família, e regulação do potencial transmembranar mitocondrial são alguns dos mecanismos pelo qual a Bcl-2 exerce o seu efeito anti-apoptótico. (IV) em resposta a IL-24, Bcl-2 S-denitrosylation através tanto de iNOS redução (a) e aumento TrxR1 (b) facilita a Bcl-2 de ubiquitinação, que, finalmente, é degradado pelo proteassoma 26S. Bax desencadeia libertação de citocromo C e a activação de caspase família das proteases, que a proteólise mediada intracelular que é característico da apoptose celular.
Embora a expressão de Bcl-2 é regulada por vários mecanismos, tais como a transcrição , modificação pós-tradução, a dimerização e a degradação [16], [17], cada vez mais provas demonstra que a modificação pós-tradução desempenha um papel crítico num potencial de Bcl-2 rotatividade sob condições de stress [18], [19], [20]. Alguns estudos indicam proteína S-nitrosilação é um processo de regulação em vias de transdução de sinal que ajusta a função de Bcl-2 por meio da ligação covalente de um grupo de óxido nítrico (NO) para uma cadeia lateral tiol de cisteína. Demonstrou-se que os dois resíduos de cisteína da proteína Bcl-2, Cys
158 e Cys
229 são responsáveis por S-nitrosilação de Bcl-2, e mutação destes dois resíduos de inibir completamente a proteína Bcl-2 S-nitrosilação [16]. S-nitrosylation foi regulamentada pela NO sintases (NOSs), incluindo NOS neuronal (nNOS), NOS endotelial (eNOS) e NOS induzível (iNOS) [21], [22]. Entre três sintases NO, iNOS, um Ca
2 + enzima independente de, é definida como a ‘high-output’ NOS, gerando grandes quantidades de NO. Alguns trabalhos anteriores também mostram iNOS foi encontrada para ser aumentada em fases avançadas de melanoma e expressão de expressão de iNOS regulada negativamente MDA-7 /IL-24 em linhas celulares de melanoma maligno [23], [24], [25], o que sugere que a iNOS pode contribuir para melhorar a progressão do tumor. No entanto, o papel exacto da iNOS na tumorigénese não é clara. induzida por ZD55-IL-24 se diminuição iNOS influenciaria mais a Bcl-2 nível S-nitrosylation é o primeiro objectivo do nosso estudo. Dado que a proteína nível S-nitrosylation não depende apenas mediado pelo S-nitrosylation via NOS mas também denitrosylating enzima tais como sistemas tiorredoxina (Trx /TrxR) [26], nós também investigar se a redução S-nitrosylation-2 Bcl em resposta a ZD55-IL-24 é determinada por ambos os sistemas /TrxR Trx iNOS e.
Alguns relatórios atuais mostram que a geração induzida pela cisplatina de espécies reativas de oxigênio faz com Bcl-2 S-nitrosylation que inibe a degradação 26S do proteassoma, indicando que a S-nitrosilação pode exercer a função biológica através da alteração da estabilidade da proteína. Da mesma forma, mediado pelo NO S-nitrosilação de Bcl-2 está relacionado com a sua degradação ubiquitina pode ser importante na resistência à apoptose e para o desenvolvimento de cancro do pulmão induzida por Cr (VI) e outros agentes cancerígenos [16], [27]. Por conseguinte, existe um interesse crescente no sentido de compreender o mecanismo celular se alteração de Bcl-2 S-nitrosilação além de ZD55-IL-24 está envolvida na sua degradação e ubiquitinação proteossómica.
Uma vez que os mecanismos pelos quais MDA-7 /IL-24 suprime a expressão de Bcl-2 e facilita a apoptose de células de cancro não foram clarificados. O nosso estudo determinou o papel significativo da Bcl-2 denitrosylation na sua degradação do proteassoma ubiquitina, que, finalmente, medeia a activação da via de sinal de caspase e a apoptose de células de cancro em resposta a ZD55-IL-24. Além disso, a diminuição de Bcl-2 S-nitrosilação em resposta a ZD55-IL-24 inclui tanto de iNOS mediada por S-nitrosilação Trx e /TrxR1 envolvido com denitrosylation, o que facilita ulteriormente a degradação mediada por ubiquitina proteossoma. Essa relação estreita entre o Bcl-2 denitrosylation e ubiquitination lança nova luz sobre induzida por IL-24 Bcl-2 degradação e apoptose tumor específico.
Materiais e Métodos
Células e Reagentes
o Henrietta Lacks linha celular humana (HeLa), a linha de humano maligno de células de cancro de melanoma (A375) e a linha celular de carcinoma renal humano (7860) foram obtidos a partir de Xangai de colheita de células (Xangai, China). células HeLa e A375 foram cultivadas em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) (GIBCO BRL, Grand Island, NY) contendo 5% de soro fetal bovino (FBS, Gibco-BRL), 2 mM de L-glutamina, e 100 unidades /ml de penicilina /estreptomicina e um meio ambiente de CO2 a 5% a 37 ° C. As células renais cancro 7860 foram cultivadas em meio RPMI 1640, suplementado com 5% de FBS e antibióticos. O nitroprussiato de sódio (SNP), 2- (4-carboxifenil) -4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxi-3-óxido (PTIO), ditiotreitol (DTT), dimetilsulfóxido (DMSO) e Z-Leu- Leu-Leu-al (MG132) foram adquiridos da Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO), anticorpos para a proteína Bcl-2, Bcl-fosfo-2 (Ser87), NOS2 (iNOS), proteína a-agarose, e IL -24-siRNA, iNOS e mexidos-siRNA controlo ARNsi foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Anticorpos para ubiquitina e S-nitrosocysteine eram da Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO). Anticorpos para β-actina, pro-caspase-3, caspase-3 clivada, pro-caspase-9 clivada, caspase-9, anticorpos anti-polimerase poli ADP-ribose (PARP) e PARP clivada foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA):
construção vírus e produção
pZD55, o E1B de 55 kDa-excluído adenovírus oncolytic plasmídeo construção.; pCA13, o plasmídeo vaivém adenovírus com deleção de E1; e ZD55-enhanced green fluorescent protein (EGFP) com o gene repórter EGFP foram gentilmente cedidas pelo Professor Liu (Xin-Yuan Liu, do Instituto de Bioquímica e Biologia Celular, Xangai Institutos de Ciências Biológicas, da Academia Chinesa de Ciências, Xangai, China). IL-24 foi primeiro clonado pCA13 para formar pCA13-IL-24. Em seguida, a IL-24 excisado de pCA13 foi subclonado pZD55 para construir pZD55-IL-24. adenovírus oncolytic, ZD55-IL-24 foi gerado em células HEK293 (Shanghai Colecção celular, Xangai, China) por recombinação homóloga entre pZD55-IL-24 e o plasmídeo embalagem adenovírus pBHGE3 (Microbix Biosystems), respectivamente. purificação em grande escala de todas as partículas de adenovírus foi realizada por ultracentrifugação com cloreto de césio de acordo com técnicas padrão. Os títulos foram determinados utilizando um ensaio de placas em células HEK293.
pequeno ARN interferente ensaio
Para as experiências envolvendo IL-24, células específicas siRNAs (3 × 10
5 por poço) foram plaqueadas em placas de 6 poços. Ao fim de 24 h após a incubação, as células Hela foram lavadas, reabastecidas com meio fresco e tratou-se com ZD55-IL-24 (20 MOI) durante 12 h, as células foram subsequentemente lavadas e colocadas em meio de cultura fresco e adicionou-se IL-24 siRNA específico ( 100 nM) usando um reagente de transfecção siRNA. Após 24 h de siRNA a transfecção, os lisados celulares foram preparados e submetidos a análise de Western blot, conforme descrito abaixo.
Para as experiências envolvendo iNOS-siRNAs, as células foram transfectadas com 100 nM de ARNsi iNOS específicos do durante 12 h, as células foram subsequentemente lavadas e colocadas em meio de cultura fresco e, em seguida, tratada com ZD-55-IL-24 (MOI 20) durante 12 h. Após 24 h de siRNA a transfecção, foram preparados lisados celulares e submetidos a análise de Western blot, conforme descrito abaixo.
Western Blotting
Depois de tratamentos específicos, as células foram incubadas em tampão de lise contendo 20 mmol /L de Tris-HCl (pH 7,5), 1% de Triton X-100, 150 mmol /L de NaCl, 10% glicerol, 1 mmol /L de Na
3VO
4, 50 mmol /L, NaF, 100 mmol /L fluoreto de fenilmetilsulfonilo, e uma mistura de inibidor de protease comercial (Roche Molecular Biochemicals) durante 20 minutos em gelo. Após os detritos insolúveis foram sedimentados por centrifugação a 14000 g durante 15 minutos a 4 ° C, os sobrenadantes foram recolhidos e determinado para o conteúdo de proteína utilizando o método de Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Proteínas (80 ug) foram resolvidas sob condições de desnaturação por EGPA-DSS (10%) e transferidos para membranas de nitrocelulose. Após bloqueamento durante 2 h em solução salina tamponada com fosfato com 0,1% de Tween 20 (PBST) e albumina de soro bovino 3% (BSA), as membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com o anticorpo primário apropriado em PBST contendo BSA a 3%. As membranas foram então lavadas e incubadas com conjugado de fosfatase alcalina de cabra anti-IgG de coelho ou anti-IgG de rato (Sigma, 1:10 000) em PBST durante 2 h e desenvolvido utilizando NBT /BCIP cor substrato (Promega, Madison, EUA).
a imunoprecipitação
Para a imunoprecipitação, fracções citosólicas (cada um contendo 400 ug de proteínas) foram diluídas quatro vezes com tampão HEPES contendo 50 mM de HEPES (pH 7,4), NaCl 150 mM, glicerol a 10%, 1% de Triton X-100, e 1 mM de cada um de EGTA, EDTA, PMSF e Na
3VO
4. As amostras foram então pré-incubados durante 1 h com 20 ul de proteína A agarose e centrifugada para remover quaisquer proteínas não-especificamente aderentes a partir da proteína A agarose. O sobrenadante foi, em seguida, incubadas com anticorpos específicos 2 ug durante a noite a 4 ° C. Após a adição de proteína A agarose, a mistura foi incubada a 4 ° C durante um adicional de 2 h. As amostras foram lavadas tripla com tampão HEPES e eluída por sódio dodecil sulfato de tampão de carga de poliacrilamida de electroforese em gel (SDS-PAGE), em seguida fervida a 100 ° C durante 5 minutos. Os imunocomplexos foram separados por 10% SDS-PAGE e analisados por transferência de Western como descrito acima.
Medição da apoptose por análise de Anexina V
Um ensaio de Anexina-V de ligação foi usada de acordo com o fabricante do instruções. Resumidamente, as células (3 x 10
5 por poço) em placas de 6 poços foram tratadas com ZD55-IL24 (MOI 20) durante o tempo diferente de 12 h, 24 h, 36 h, 48 h e 72 h. As células foram recolhidas e o ensaio de dupla coloração de anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI) foi realizada de acordo com as instruções do fabricante ((Nanjing Keygen Biotech, China). As células recolhidas foram brevemente lavadas com solução salina tamponada com fosfato gelada (PBS ) duas vezes e ressuspensas em 200 ul de 1 × tampão de ligação contendo 5 ul de anexina V-FITC durante 15 minutos e, em seguida, em 300 ul de 1 × tampão contendo 5 ul de iodeto de propídio (PI) durante 5 minutos à temperatura ambiente no escuro de ligação. Após incubação , as células foram analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACStar.
a viabilidade celular ensaio
as células de carcinoma (1,0 × 10
4 por poço) foram incubadas em triplicado numa placa de 96 poços e tratou-se com ZD55-iL-24 e moduladores NO. Cell taxa de sobrevivência foi avaliada por um grupo 3- (4, 5-dimethylthazol-2-il) ensaio padrão -2,5-(MTT) (Sigma, St. Louis , MO) na presença ou ausência das amostras de teste indicados em um volume final de 0,2 ml durante vários períodos de tempo a 37 ° C. em seguida, 20 de solução de MTT ul (5 mg /ml em PBS) foi em seguida adicionado a cada poço . Após 4 h de incubação a 37 ° C, foram adicionados 150 ul de DMSO. Finalmente, as placas foram agitadas e a densidade óptica a 570 nm foi medida no leitor ELX-800 espectrómetro (Bio-Tek Instruments Inc., EUA). Quatro cavidades replicadas foram testados por ensaio e cada experiência foi repetida três vezes. a viabilidade celular em percentagem foi calculada como a razão entre as amostras experimentais para as amostras de controlo x 100.
A análise estatística
Os valores são expressos como média ± DP. A análise estatística dos resultados foi realizada utilizando o teste t de Student ou a análise unidireccional da variância (ANOVA) seguido pelo novo método de gama múltipla de Duncan ou teste de Newman-Keuls.
P
-Valores. 0,05 foram considerados significativos
Resultados
Efeito da ZD55-IL-24 na Bcl-2 expressão e de células de câncer viabilidade
expressões proteína de IL-24 e acompanhada com E1A de adenovírus ZD55-IL-24 de replicação e tradução em HeLa, A375 e 7860 células foram detectadas por Western blot nos diferentes pontos de tempo. Os nossos dados mostraram um aumento distinto de IL-24 a partir de 24 h a 72 h, em comparação com controlos, como se mostra na fig. 1A. Ao mesmo tempo, as proteínas E1A de pé para a capacidade de replicação de ZD55-IL-24 apresentaram o aumento óbvio a partir de 12 h a 72 h na Fig. 1B, que é semelhante ao curso do tempo da expressão aumentada da proteína de fluorescência verde (EGFP) tratada com ZD55-EGFP na Fig. 1D. Além disso, a expressão de Bcl-2 tem a diminuição inversa de 24 h até 72 h (Fig. 1C). Além disso, a queda de Bcl-2 em resposta a ZD55-IL-24 foi mostrada de um modo dependente da dose. Os títulos eficientes de ZD55-IL-24 para inibir a expressão de Bcl-2 são 10 e 20 MOI, como mostrado na Fig. 2A. Para investigar se os ZD55-IL24 afecta a sobrevivência três células de carcinoma, a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT (Fig. 1E). Os nossos resultados mostraram que os ZD55-IL-24 diminuiu eficazmente a sobrevivência de células e esta inibição foi também mostrada de uma forma dependente da dose (Fig. 1E e 2C). Tomados em conjunto, estes resultados indicam a ZD55-IL24 poderia mediar um alto nível e estável IL-24 expressão a partir de 24 h até 72 h e reduzir o nível de proteína Bcl-2 em tempo e dose-dependente maneira.
efeito da ZD55-IL-24 na Bcl-2 S-nitrosylation e ubiquitination
para investigar se ZD55-IL-24 contribuirá para alteração de Bcl-2 S-nitrosylation e ubiquitinação, detectamos Bcl-2 S -nitrosylation eo nível ubiquitination em Hela, A375 e 7860 células. Os resultados mostraram que os ZD55-IL-24 em células HeLa diminuiu a Bcl-2 S-nitrosilação de 79% às 24 h, para 38% às 48 h comparado com o grupo de controlo (Fig. 3A). Em contraste, a Bcl-2 ubiquitinação aumentou de 1,4 vezes superior às 24 h para 2,3 vezes em 48 horas, como mostrado na Fig. 3B. Os resultados a partir de A375 e 7860 células foram consistentes com a tendência acima. Para confirmar ainda mais o potencial papel de IL-24 na regulação de Bcl-2 S-nitrosilação e ubiquitinação, específica de IL-24 siARN foi usada para knockdown de IL-24 de expressão. Os nossos dados indicam a IL-24 siRNA obviamente restaurado Bcl-2 S-nitrosilação e então suprimidas Bcl-2 ubiquitinação comparado com o controlo scrambled siRNA (Fig. 3C). Consequentemente, ZD55-IL-24 induzida diminuição da Bcl-2 S-nitrosylation e aumento da Bcl-2 ubiquitination.
Efeito da ZD55-IL-24 na ativação da caspase e apoptose de células cancerígenas
Para mais determinar se a proteína Bcl-2 diminuição aberrante em resposta a ZD55-IL-24 resultaria na activação da via de sinal da caspase em células HeLa, caspase-9, caspase-3 e PARP foram detectadas no tempo diferentes pontos 12 h, 24 h , 36 h e 48 h, respectivamente, como mostrado na FIG. 4A. Os resultados demonstraram que a pro-caspase-9 diminuiu gradualmente a partir de 76% às 24 h, para 36% às 48 h. Em contraste, a caspase-9 clivada, correspondentemente, aumentado a partir de 1,5 às 24 h para 2,5 vezes em 48 horas em comparação com o grupo de controlo. A caspase-3 e PARP realizada a alteração semelhante como caspase-9. Os nossos resultados mostram que os ZD55-IL-24 induziu a clivagem de caspase-9, caspase-3 e PARP para activar a via de sinal de caspase. Além disso, as células Hela apoptose foi detectada por anexina V /PI e, em seguida, analisadas utilizando citometria de fluxo (Fig. 4B e C). Os resultados indicaram que os ZD55-IL-24 aumentada dramaticamente a apoptose em células HeLa a partir de 2.3- às 24 h para 7,4 vezes em 72 horas em comparação com o grupo de controlo. Tomados em conjunto, ZD55-IL-24 iniciou a ativação da via sinal de caspase e apoptose de células cancerígenas.
Efeito da Bcl-2 alteração S-nitrosylation sobre a regulamentação do seu ubiquitination em resposta a ZD55-IL-24
Para investigar se ZD55-IL-24 poderia regular Bcl-2 S-nitrosylation via NO, o que afeta posteriormente o seu ubiquitination, nós tratados Hela, A375 e 7860 células com NO SNP doador, NO inibidor co-administração PTIO e SNP do agente redutor DTT após a administração de ZD55-IL24, respectivamente. Como mostrado na Fig. 5A, doador de NO exógeno SNP aumentado eficazmente a Bcl-2 S-nitrosilação que este efeito de salvamento foi negada por co-administração com DTT. Ao mesmo tempo, sem inibidor PTIO reduziu significativamente a Bcl-2 S-nitrosilação. Por outro lado, o NO SNP dador inibiu a ubiquitinação de Bcl-2, mas o co-tratamento de DTT neutralizou os efeitos do SNP. Além disso, sem inibidor PTIO facilitou a ubiquitinação de Bcl-2 na Fig. 5B. FIG. 5C mostra ZD55-IL-24 durante 24 h tratamento causou uma diminuição significativa da expressão de Bcl-2, o qual foi ainda mais reduzida, após a adição de NO PTIO inibidor. Em contraste, o tratamento com NÃO SNP doador resistiu significativamente-IL-24 induzida ZD55 Bcl-2 sub-regulação. 6A. 7A. FIG.