Abstract

estudos epidemiológicos recentes que implicam diferenças na recorrência do câncer com base em regimes anestésicos levantam a possibilidade de que o receptor opióide mu (MOR) pode influenciar a progressão do câncer. Com base nas nossas observações anteriores de que a sobre-expressão de MOR em células humanas do cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) aumentaram o crescimento do tumor e metástases, este estudo examinou se MOR regula a sinalização do receptor do factor de crescimento epitelial e mesenquimal (EMT) em células NSCLC humanas. Utilizamos siRNA específico, shRNA, inibidores químicos e vectores superexpressão em células NSCLC H358 humanos que foram ou não tratados ou tratados com várias concentrações de DAMGO, morfina, fentanil, EGF ou IGF. Os ensaios de imunotransferência, a função das células e ensaios de imunoprecipitação foram então realizadas. Os nossos resultados indicam MOR regula opióide e a sinalização do receptor EGF induzido pelo factor de crescimento (Src, Gab-1, PI3K, AKT e STAT3 activação), que é essencial para a proliferação de células NSCLC humanas e consequente migração. Além disso, as células NSCLC humanas tratadas com opioides, factores de crescimento ou a sobre-expressão MOR exibiu um aumento no caracol, lesma e vimentina e diminuir ZO-1 e os níveis de proteína claudina-1, resulta consistente com um fenótipo de EMT. Além disso, estes efeitos foram invertidos com o silenciamento (shRNA) ou inibição química de MOR, Src, Gab-1, PI3K, AKT e STAT3 (p 0,05). Nossos dados sugerem um possível efeito direto do MOR em opióides e fator de crescimento de sinalização e consequente proliferação, migração e transição EMT durante a progressão do câncer de pulmão. Tal efeito fornece uma explicação plausível para os resultados epidemiológicos

Citation:. Lennon FE, Mirzapoiazova T, Mambetsariev B, Poroyko VA, Salgia R, Moss J, et al. (2014) O Mu receptor opióide Promove opiáceos e Fator de Crescimento Induzida proliferação, migração e epitelial mesenquimal Transição (EMT) em Câncer de Pulmão Humano. PLoS ONE 9 (3): e91577. doi: 10.1371 /journal.pone.0091577

editor: Olivier de Wever, Universidade de Ghent, Bélgica

Recebido: 16 de setembro de 2013; Aceito: 13 de fevereiro de 2014; Publicação: 24 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Lennon et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O apoio foi fornecida a partir de fontes institucionais e /ou departamentais e Institutos Nacionais de Saúde concedem CTSA UL1 TR000430. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Metilnaltrexona foi desenvolvido na Universidade de Chicago e licenciada para Progenics Pharmaceuticals, posteriormente sub -licensed para Salix Pharmaceuticals. Dr. Moss foi um consultor pago para Progenics Pharmaceuticals e atualmente é um consultor pago para Salix Pharmaceuticals. Ele recebe royalties pela Universidade de Chicago. Não há patente (s) ou pedidos de patentes relativos a pertinente material a este artigo. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O papel da anestesia e analgesia na recorrência ea taxa metastático de malignidades recebeu recentemente considerável atenção [1], [2], [3], [4]. estudos retrospectivos demonstraram uma incidência reduzida de recorrência do câncer após anestesia regional, com doses menores de opióides após cirurgia de mama, próstata, câncer de cólon e melanoma, embora outros estudos não conseguiram detectar diferenças significativas [5], [6], [7] , [8]. Algumas hipóteses para explicar estas diferenças nas taxas de recorrência incluem efeitos de supressão do sistema imunológico e efeitos diretos sobre o crescimento de células tumorais [9], [10], [11]. Nossa pesquisa centrou-se sobre o receptor opióide mu (MOR) e seu papel na regulação diretamente alterações celulares que levam ao crescimento de tumores e metástases [4], [12], [13].

estratégias terapêuticas eficazes para o cancro do pulmão , a principal causa de mortalidade associada ao câncer em todo o mundo, são extremamente limitados exemplificando a necessidade de diagnóstico precoce e de novas intervenções terapêuticas [14], [15]. Descrevemos previamente que a MOR é regulada positivamente em vários tipos de cancro humano não-pequenas células do pulmão (NSCLC) [12]. Além disso, mostrámos que a sobre-expressão de MOR em NSCLC humanas aumenta crescimento do tumor primário e de metástases em modelos de xenoenxerto [13]. No entanto, as exatas mudanças celulares reguladas por MOR em NSCLC não estão completamente definidos [4]. Para que as células cancerosas crescem e metástase, é necessário que haja uma perda de adesão célula-célula (caracterizada por uma redução de proteínas de adesão de células epiteliais, incluindo as proteínas de junções apertadas, ZO-1 e claudina-1), seguido por incorporação de características mesenquimais incluindo uma perda de polarização baso-apical, a remodelação do citoesqueleto e aumento da motilidade celular (caracterizado por aumentos no proteínas do citoesqueleto específicos (isto é, vimentina) e factores de transcrição (ou seja, Slug e caracol) [16], [17], [18], [19] . Este processo oncogénico orquestrada é referido como epitélio mesenquimal (EMT) [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22].

Crescimento receptores de factores, incluindo o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), são frequentemente sobre-expresso e /ou mutado em NSCLC e regular os processos oncogénicos, incluindo a proliferação de células de tumor, a migração e EMT transição [23], [24], [25], [26] , [27]. Várias terapias orientadas para o EGFR em NSCLC existem incluindo inibidores de tirosina-quinase (gefitinib, erlotinib) e anticorpos monoclonais (cetuximab) [28], [29], [30], [31]. No entanto, a taxa de sobrevida global em NSCLC permanece baixa [32], [33], [34]. Recentemente, Fujioka et ai., Demonstraram que a morfina pode estimular as vias de sinalização de EGFR, incluindo a serina /treonina quinases quinase Akt e MAP em NSCLC sugerindo um papel para a inibição MOR como uma potencial estratégia terapêutica para NSCLC [35].

com base no interesse recente dos efeitos da anestesia e analgesia regimes sobre a recorrência e o potencial metastático de vários cancros [1], [2], [3], [4], os nossos dados anteriormente publicados que indicam o MOR é regulada positivamente em pulmão tecido de doentes com NSCLC [12], a sobre-expressão de MOR promove o crescimento de tumores e metástases em modelos humanos com NSCLC de xenoenxerto de [13], bem como os dados de Fujioka et ai., demonstrando regulação MOR de eventos de sinalização induzida por EGF em NSCLC [35], este estudo investigou os efeitos funcionais de MOR nos processos oncogénicos fundamentais de opióide e o factor de crescimento induzida pela migração de células de pulmão humano, a proliferação e mesenquimais transição epitelial (EMT) [16], [17], [18], [19], [ ,,,0],20]. Desde então, há muito pouca informação sobre opióide e /ou regulamento MOR da EMT e os mecanismos moleculares que integram proliferação de células cancerosas, migração e EMT, este estudo investigou os mecanismos moleculares detalhados para esses eventos que podem ter utilidade clínica potencial.

Métodos

Cultura de células e Reagentes

A célula NSCLC humana H358 foi obtida a partir de ATCC (Walkersville, MD) e cultivadas em Roswell Park Memorial Institute meio completo (Cambrex, East Rutherford, NJ) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO2, 95% ar, com passagens 6-10 utilizados para a experimentação. A menos que especificado em contrário, os reagentes foram obtidos a partir de Sigma (St. Louis, MO). Os reagentes para electroforese em SDS-PAGE foram adquiridos de Bio-Rad (Richmond, CA) e da membrana de transferência Immobilon-P foi adquirido a partir da Millipore (Millipore Corp., Bedford, MA). anticorpo anti-coelho de MOR foi comprado de GeneTex (San Antonio, TX). Rabbit anti-EGFR, coelho anti-fosfotirosina-EGFR (PY

845, pi

992, pi

1045, pi

1068), de coelho anti-Grb-2, coelho anti-Gab-1 , de coelho anti-fosfotirosina-Gab-1 (pY

307, pi

627), de coelho anti-Src, coelho anti-fosfotirosina-Src (pY

416), de coelho anti-p85 PI3 quinase, coelho anti-p55 PI3 quinase, coelho anti-fosfotirosina-p85 /p55 PI3 quinase (pY

458, pi

199), de coelho anti-STAT3, coelho anti-fosfotirosina-STAT3 (pY

705), coelho Os anticorpos anti-anti-vimentina Slug, de coelho anti-ZO-1, anticorpo de coelho anti-claudina-1, anticorpo de coelho anti-Snail e de coelho foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technologies (Danvers, MA). anticorpo anti-β-actina de ratinho foi adquirido à Sigma (St. Louis, MO). anticorpos marcados com peroxidase de rábano secundário foram adquiridos a Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). brometo de N-metilnaltrexona ou metilnaltrexona foi adquirido a partir de Mallinckrodt Specialty Chemicals (Phillipsburg, NJ). O inibidor de PI3-quinase LY294002, Akt Inibidor X, o inibidor PP2 família cinase Src e o inibidor de STAT3 Stattic foram adquiridos a partir de EMD Biosciences (Billerica, MA).

imunotransferência

imunotransferência foi realizada como nós descreveram anteriormente. materiais celulares a partir de células NSCLC humanas tratadas ou não tratadas foram incubadas com tampão de lise (HEPES 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, MgCl 20 mM

2, 1% de Triton X-100, 0,1% de SDS, de Na 0,4 mM

3VO

4, NaF 40 mM, 50 uM de ácido ocadaico, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 0,2 mM, 1:250 diluição da mistura de inibidor de protease Calbiochem 3). As amostras foram, em seguida, executar em SDS-PAGE em géis de poliacrilamida a 4-15%, transferidos para membranas Immobilon ™, e desenvolvido com anticorpos primários e secundários específicos. A visualização das bandas imunorreactivas foi conseguida usando quimioluminescência aumentada (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Em alguns casos, as bandas imunorreactivas foram quantificadas por densitometria assistida por computador.

pequeno ARN interferente Transfecção em células NSCLC humanas

e de controlo estáveis ​​quer MOR, Gab-1, ou Src siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) foram transfectados em células H358 como já descrito anteriormente [12]. As células (~ 40% confluentes) foram-privadas de soro durante 1 hora, seguido por incubadas com ARNsi durante 6 horas em meio isento de soro. meio contendo soro foi então adicionada (10% de concentração final de soro) durante 42 horas. A inibição da expressão da proteína foi confirmada por análise de imunotransf erência com anticorpos específicos.

controle estável e MOR pequeno gancho de cabelo de ARN de transfecção em células NSCLC humano

de controlo estáveis ​​e MOR shRNA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), foram estavelmente transfectadas para células H358 como já anteriormente descrito [12]. As células (~ 40% confluentes) foram-privadas de soro durante 1 hora, seguido por incubadas com shRNA durante 6 horas em meio isento de soro. meio contendo soro foi então adicionada (10% de concentração final de soro) durante 42 horas e adicionou-se reagente de selecção de puromicina. A inibição da expressão da proteína foi confirmada por análise de imunotransf erência com anticorpos anti-MOR (GeneTex, San Antonio, TX).

Estável controlo do vector e MOR1 A sobre-expressão em células NSCLC humanas

Myc-DDK-tagged ORF de clone de Homo receptor opióide sapiens, mu 1 (OPRM1), variante de transcrito Mor-1 (OriGene Technologies Inc., MD) foi amplificada utilizando a enzima polimerase Platinum Taq DNA de alta fidelidade (Invitrogen, CA) e subsequentemente clonada num pCR8 /GW /Topo vector de entrada (Invitrogen, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA de plasmídeo foi extraído a partir de clones seleccionados por QIAquick plasmídeo Mini Kit (Qiagen, CA). ORF integridade e fragmento de orientação foram confirmadas por sequenciação. O produto de fusão MOR1-Myc foi então transferida para vector pcDNA3.2 /V5 DEST (Invitrogen, CA) por reacção LR. A construção resultante (pcDNA3.2-MOR1-Myc) foi transfectado em células H358 utilizando FuGENE HD ™ como o reagente de transfecção (Roche Applied Sciences) de acordo com o protocolo fornecido pela Roche, como já descrito anteriormente. As células (~ 40% confluentes) foram privadas de soro durante 1 hora seguida por incubação com pcDNA3.2-Myc-MOR1 durante 6 horas em meio isento de soro. meio contendo soro foi então adicionada (10% de concentração final de soro) durante 42 horas e adicionou-se reagente de selecção de neomicina. Superexpressão foi confirmada por análise de imunotransferência com MOR anti-anticorpo (GeneTex, San Antonio, TX).

NSCLC humano Proliferação Celular Ensaio

Medição da

in vitro

crescimento de células NSCLC foi realizado como já descrito anteriormente. De controlo ou ARNsi pré-tratados H358 células (5 × 10

3 células /poço) foram incubadas com 0,2 ml de meio isento de soro, contendo quer veículo (controle), metilnaltrexona (MNTX, 100 nM), o inibidor de PI3-quinase LY294002 (10 uM), Akt inibidor X (5 uM), a PP2 Src família inibidor de quinase (100 nM) ou o inibidor de STAT3 Stattic (10 uM) durante 72 h a 37 ° C em 5% de ar, CO2 /95% de cultura de 96 poços pratos. O

In vitro

ensaio de proliferação celular foi analisada medindo aumentos no número de células utilizando o ensaio de MTS CellTiter96 ™ (Promega, Madison, WI) e lida a 492 nm. Cada ensaio foi criada em triplicado e repetidos pelo menos cinco vezes.

NSCLC Human Cell Migration Assay

Medição da

in vitro

migração de células NSCLC foi realizada como temos anteriormente descrito. Vinte e quatro unidades Transwell com tamanho de poro de 8 um (Millipore, Billerica, MA) foram usados ​​para monitorizar

in vitro de migração de células

como já anteriormente descrito [12]. De controlo ou ARNsi pré-tratados H358 células (5 × 10

3 células /poço) foram incubadas com 0,2 ml de meio isento de soro, contendo quer veículo (controle), metilnaltrexona (MNTX, 100 nM), o inibidor de PI3-quinase LY294002 (10 uM), Akt inibidor X (5 uM), a PP2 família Src inibidor de quinase (100 nM) ou o inibidor de STAT3 Stattic (10 uM) foram plaqueadas na câmara superior e meios com soro foi adicionada à câmara inferior. As células foram deixadas migrar através dos poros durante 18 horas. As células a partir da câmara superior e inferior foram quantificadas utilizando o ensaio de MTS ™ CellTiter96 (Promega, San Luis Obispo, CA) e lida a 492 nm. % Migração foi definida como o # de células na câmara inferior, dividido pelo número de células, tanto na câmara superior e inferior. Cada ensaio foi realizado em triplicado e repetidos pelo menos cinco vezes.

Análise estatística

Os resultados são expressos como média ± desvio padrão de três experiências independentes. Para análise dos dados, as amostras experimentais foram comparados com controles por teste t de Student não pareado. Para comparações de múltiplos grupos, foram utilizados uma análise de uma via de variância (ANOVA) e post hoc de comparações múltiplas. As diferenças entre os grupos foram consideradas estatisticamente significativas quando

P

valor foi menor que 0,05. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., EUA).

Resultados

Os nossos resultados na Figura 1 indicam que a inibição MOR com o antagonista MOR periférica MNTX atenua EGF proliferação induzida (Figura 1-a) e migração (Figura 1-B) de células NSCLC H358 humanos de um modo dependente da dose. Estes dados sugerem uma ligação entre MOR e do EGFR nas células H358. Avaliar mecanicamente o papel de MOR sobre a dinâmica de EGFR induzida por EGF, nós tratados H358 células com EGF em vários momentos e imunoprecipitadas o EGFR para determinar potencial associação MOR. A Figura 2-A demonstra que o EGF induz a formação de complexos entre o EGFR e MOR que os picos em 5 a 15 minutos após o desafio EFG. Com base em nossos resultados que um complexo MOR /EGFR podem ocorrer com a estimulação EGF de células H358, nós próxima examinou se MOR pode regular a fosforilação de EGFR. Utilizando um painel de anticorpos anti-fosfo-EGFR, Figura 2-B demonstra que o tratamento prévio de células NSCLC H358 humano com o antagonista MOR periférica MNTX não conseguiu atenuar a fosforilação da tirosina do EGFR induzida pelo EGF

Painel A:. Humano H358 células do cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) foram analisados ​​para a metilnaltrexona (MNTX) inibição de proliferação mediada por EGF utilizando um ensaio de proliferação de MTS. As células foram de crescimento na presença de 100 ng /ml de EGF e /ou 0-250 nM MNTX durante 72 horas. MNTX Há uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05, indicado por um asterisco) entre controle e MNTX (10, 50, 100, 250 nM) tratamento com n = 3 por condição e erro bares = desvio padrão. Veja a seção Métodos para obter detalhes experimentais. Painel B: células H358 humano não-pequenas células do cancro do pulmão (NSCLC) foram analisados ​​para a metilnaltrexona (MNTX) inibição da migração mediada por EGF utilizando um ensaio Transwell (8 uM de tamanho de poro). As células foram deixadas a migrar na presença de 100 ng /ml de EGF e /ou 0-250 nM MNTX durante 18 horas. Há uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05, indicado por um asterisco) entre controle e MNTX (50, 100, 250 nM) tratamento com n = 3 por condição e erro bares = desvio padrão. Veja a seção Métodos para obter detalhes experimentais

Painel A:. Câncer de pulmão de células H358 humano não-pequenas células (NSCLC) foram tratadas sem (controle) ou 100 ng /ml de EGF para 5, 15, ou 30 minutos. Os lisados ​​celulares foram obtidos e imunoprecipitadas com anticorpo anti-EGFR. As imunotransferências foram realizadas em lisados ​​de células totais (esquerda) e o material imunoprecipitado (à direita), utilizando anti-MOR (a) e anti-EGFR (b) anticorpos. O receptor opióide mu é recrutado para o EGFR com estimulação EGF. Painel B: não pequenas do cancro do pulmão de células H358 humano células (NSCLC) ou foram não tratados (controlo) ou tratadas com 100 nM MNTX sozinho, 10 ng /ml de EGF durante 5, 15 ou 30 minutos, ou 100 nM MNTX e 10 ng /ml EGF durante 5, 15 ou 30 minutos. Os lisados ​​celulares foram obtidos e imunomarcados com anti-Py

845 EGFR (a), anti-Py

992 EGFR (b), anti-Py

1045 EGFR (c), anti-Py

1068 EGFR (d), anti-EGFR (e), e anticorpos anti-actina (e). O MNTX não inibe a fosforilação de EGFR tirosina induzida por EGF.

A seguir, analisou se MOR pode regular EGFR jusante moléculas de sinalização. Em primeiro lugar, examinou a proteína adaptadora, proteína ligada ao receptor do factor de crescimento 2 (GRB-2), que contém um domínio SH2 e SH3 e dois domínios podem ligar-se directamente a EGFR [36]. Os resultados da Figura 3-A demonstrar, utilizando a imunoprecipitação de EGFR e imunotransf erência com anticorpos anti-Grb-2, que o EGF induz a EGFR Grb-2 /formação de complexo, que é atenuada por pré-tratamento de células H358 com MNTX. Recrutamento de GRB-2 ao EGFR é importante para o recrutamento de membrana de plasma e consequente a fosforilação da tirosina da proteína andaime, Grb2-associado de ligação de proteína 1 (Gab-1) [37]. Figura 3-B indica que a estimulação EGF de células H358 induz a fosforilação da tirosina do Gab-1 (Tyr307 e Tyr627), que atinge seu pico em ~ 5 minutos e é atenuado pela inibição MOR com MNTX

Painel A:. H358 humano não cancro do pulmão de células -Pequena células (NSCLC) ou foram não tratados (controlo) ou tratadas com 100 nM MNTX (1 hora de pré-incubação), 10 ng /ml de EGF durante 15 minutos, ou 100 nM MNTX e 10 ng /ml de EGF. Os lisados ​​celulares foram obtidos e imunoprecipitadas com anticorpo anti-EGFR. As imunotransferências foram realizadas em lisados ​​de células totais e de material imunoprecipitado usando anti-Grb-2 (a, c) anti-EGFR (b, d) e anticorpo. MNTX inibe o recrutamento induzido por EGF de GRB-2 para o EGFR. Painel B: não pequenas do cancro do pulmão de células H358 humano células (NSCLC) ou foram não tratados (controlo) ou tratadas com 100 nM MNTX sozinho, 10 ng /ml de EGF durante 5, 15 ou 30 minutos, ou 100 nM MNTX e 10 ng /ml EGF durante 5, 15 ou 30 minutos. Os lisados ​​celulares foram obtidos utilizando imunotransferidas e anti-Py

627 Gab-1 (a), anti-Py

307 Gab-1 (b) e (c) anticorpos anti-actina. MNTX atenua a fosforilação de tirosina Gab-1 induzida por EGF.

Uma vez que a fosforilação da tirosina de Gab-1 por vários tirosina quinases Src incluindo promove a ligação de moléculas de sinalização, incluindo fosfatidilinositol 3-quinases (PI3K), que geram PIP3 e ativar efectores a jusante, incluindo Akt e STAT3 [37], [38], [39], [40], [41], [42], o próximo examinou se a inibição MOR também pode influenciar Gab-1 vinculativo /moléculas efetoras. A Figura 4 A mostra que, como Gab-1, EGF desafio de células H358 induz a fosforilação da tirosina de Src (Tyr416), o regulador de PI3K alfa P85 subunidades e p55 (Tyr458 /Tyr199), e o factor de transcrio STAT3 (Tyr705) que pico a ~ 5 minutos e são atenuados por inibição MOR com MNTX de um modo estatisticamente significativo (Figura 4-B)

Painel a:. células não pequenas do cancro do pulmão de células H358 humano (NSCLC) ou foram não tratadas (de controle ) ou tratadas com 100 nM MNTX sozinho, 10 ng /ml de EGF durante 5, 15 ou 30 minutos, ou 100 nM MNTX e 10 ng /mL de EGF para 5, 15, ou 30 minutos. Os lisados ​​celulares foram obtidos e imunomarcados com anti-fosfo-Src (PY

416) (a), anti-fosfo-p85 /p55 de PI3-quinase (PY

458 /pY

199) (b, c) , anti-fosfo-STAT3 (pY

705) (d) e anticorpos anti-actina (e). Painel B: a quantificação da imunorreactividade gráfica de experiências realizadas descrita na Figura 3-B e um painel com a normalização para o total de proteína específica e n = 3 experiências independentes por condição. Um asterisco (*) indica uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05) do controle. As barras de erro = desvio padrão.

A seguir, examinaram o mecanismo pelo qual a EGF e DAMGO ([D-Ala2, N-MePhe4, Gli-ol] -encefalina), um peptídeo opiáceo sintético com especificidade para MOR) induzir a proliferação e migração. A Figura 5 ilustra que ARNsi e /ou inibição química de MOR, Gab-1, Src, PI3K, AKT e STAT3 diminuir acentuadamente EGF e a proliferação induzida por DAMGO (Figura 5-A) e migração (Figura 5-B).

Painel a: células H358 do cancro do pulmão de células não pequenas humano (NSCLC) foram analisados ​​por EGF e a proliferação mediada por DAMGO utilizando um ensaio de proliferação de MTS. H358 células NSCLC humano ou foram não tratados (controlo) ou tratados com 100 fator ng /mL de crescimento epidérmico (EGF) ou 100 nM DAMGO durante 72 horas com ou sem pré-tratamento das células com o antagonista MOR periférica, metilnaltrexona (MNTX, 100 nM), MOR siRNA, Gab-1 siRNA, Src siRNA, o inibidor de PI3-quinase LY294002 (10 uM), Akt inibidor X (5 uM), a PP2 família Src inibidor de quinase (100 nM) ou o inibidor de STAT3 Stattic (10 uM). Há uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05, indicado por um asterisco) entre os grupos de controle e tratamento com n = 3 ensaios independentes por condição de erro e barras = desvio padrão. Veja a seção Métodos para obter detalhes experimentais. Painel B: células H358 humano não-pequenas células do cancro do pulmão (NSCLC) foram analisados ​​para EGF e migração mediada por DAMGO utilizando um ensaio Transwell (8 uM de tamanho de poro). H358 células NSCLC humano ou foram não tratados (controlo) ou tratados com 100 fator ng /mL de crescimento epidérmico (EGF) ou 100 nM DAMGO durante 18 horas com ou sem pré-tratamento das células com o antagonista MOR periférica, metilnaltrexona (MNTX, 100 nM), MOR siRNA, Gab-1 siRNA, Src siRNA, o inibidor de PI3-quinase LY294002 (10 uM), Akt inibidor X (5 uM), a PP2 família Src inibidor de quinase (100 nM) ou o inibidor de STAT3 Stattic (10 uM). Há uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05, indicado por um asterisco) entre os grupos de controle e tratamento com n = 3 ensaios independentes por condição de erro e barras = desvio padrão. Veja a seção Métodos para obter detalhes experimentais.

Uma vez que muito pouco se sabe sobre a regulação MOR da transformação epitelial mesenquimal (EMT) e os mecanismos moleculares que integram proliferação de células cancerosas, migração e EMT, o próximo examinou se MOR1 superexpressão regula EMT câncer de pulmão. Na Figura 6-A, B, observou-se que a sobre-expressão em células MOR H358 NSCLC humanas induzida por uma mudança na expressão do marcador de EMT o que é consistente com uma transição epitelial mesenquimal [19]. Uma vez que a MOR é o principal receptor para certos opióides [4], [43], que se avaliou próxima opióides pode induzir em células de EMT H358 NSCLC humanas. A Figura 6-C indica que DAMGO, morfina e fentanil todos induzir EMT em NSCLC de uma forma dependente da dose

Painel A:. Controle (não transfectadas) (C), controlo de vector estável (VC) e MOR1 superexpressando (O /e) linhas de células H358 foram gerados, os lisados ​​de células obtidos e imunotransferidas com marcadores EMT anti-vimentina (a), anti-Snail (b), anti-Slug (c), anti-claudina-1 (d), anti-ZO-1 (e), anti-MOR (f) e anticorpos anti-actina (g). Um aumento na vimentina, Snail e expressão Slug e uma diminuição da claudina-1 e ZO-1 sugere uma expressão epitelial mesenquimal. Painel B: a quantificação da imunorreactividade gráfica de experiências realizadas descrito no Painel A com n = 3 experiências independentes por condição. Um asterisco (*) indica uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05) do controle com barras de erro = desvio padrão. Painel C: H358 células NSCLC humana foram ou não tratados, tratados com 100 fator ng /mL de crescimento epidérmico (EGF), 100 nM de DAMGO, a morfina ou fentanil ou 100 fator ng /mL de crescimento tipo insulina (IGF), durante 96 horas, os lisados ​​de células obtidos e imunotransferidas com marcadores EMT anti-vimentina (a), anti-Snail (b), anti-Slug (c), anti-claudina-1 (d), anti-ZO-1 (e), anti-MOR (f) e anti-actina (g) anticorpos. Uma diminuição na vimentina, Snail e expressão Slug e um aumento da claudina-1 e ZO-1 expressão sugerem inibição da transição epitelial mesenquimal. Painel D: Controlo shRNA ou MOR shRNA H358 linhas celulares foram geradas, lisados ​​de células obtidos e imunotransferidas com marcadores EMT anti-vimentina (a), anti-Snail (b), anti-Slug (c), anti-claudina-1 (D ), anti-ZO-1 (e), anti-MOR (f) e anticorpos anti-actina (g). Um aumento na vimentina, expressão de Snail e espaçador e uma diminuição da claudina-1 e ZO-1 sugere uma expressão epitelial mesenquimal.

Considerando estes H358 células NSCLC humanas expressam níveis basais de MOR e responder aos tratamento opióide, nós examinamos se silenciamento (shRNA) de MOR afectaria EMT induzida pelo factor de crescimento e de opióide. Figura 6-D indica MOR silenciamento inibe opióides e EGF /alterações induzidas pelo IGF na expressão do marcador EMT. Figura 7-A indica que H358 células crescem em colônias com bordas bem delimitadas e adesões célula-célula fortes. Em contraste, a morfina ou células H358 tratadas com IGF mostram uma perda de adesões célula-célula e uma mudança de cuboidal a um fenótipo alongado com várias projecções celulares visíveis. Estas alterações são consistentes com uma transição epitelial mesenquimal (EMT)

Painel A:. Células NSCLC humanas H358 ou foram não tratados (controlo), tratado com morfina 100 nm ou 100 do factor de crescimento insulina ng /ml (IGF) para 96 horas e as imagens de campo claro foram obtidos (20 ×). células H358 crescer em colônias com bordas bem delimitadas e adesões célula-célula fortes. Em contraste, a morfina ou células H358 tratadas com IGF mostram uma perda de adesões célula-célula e uma mudança de cuboidal a um fenótipo alongado com várias projecções celulares visíveis. Estas alterações são consistentes com uma transição epitelial mesenquimal (EMT). Painel B: H358 células NSCLC humana foram ou não tratados, tratados com 100 fator ng /mL de crescimento epidérmico (EGF), 100 nM de DAMGO, a morfina ou fentanil ou 100 fator ng /mL de crescimento tipo insulina (IGF) durante 96 horas com ou sem pré-tratamento com o antagonista periférico MOR, metilnaltrexona (MNTX, 100 nM), o PP2 família Src inibidor de quinase (100 nM) ou o inibidor de STAT3 Stattic (10 uM). Os lisados ​​celulares foram então obtidos e imunotransferidas com marcadores EMT anti-vimentina (A, C, E) ou anti-claudina-1 (b, d, f) anticorpos. Um aumento na expressão de vimentina e uma diminuição na claudin-1 expressão sugerem uma transição mesenquimal epitelial.

A seguir, examinou proteínas de transdução de sinal potenciais que poderiam potencialmente regulam opióide e crescimento EMT induzida por fator. A Figura 7-B indica o pré-tratamento com o antagonista periférico MOR, metilnaltrexona (MNTX), PP2 o inibidor de cinase da família de Src ou o inibidor de STAT3 Stattic reverter os opióides e crescimento alterações induzidas pelo factor de vimentina e expressão claudina-1. Além disso, a Figura 8 indica ARNsi e /ou inibição química de MOR, Gab-1, Src, PI3K, AKT e STAT3 inibe dramaticamente EMT (tal como determinado por inibição do aumento de opióide e do crescimento induzida pelo factor na expressão de vimentina e diminuição da claudin- 1 expressão). Ambos MNTX ea naloxona inibidor MOR atenuada opióide e crescimento indicação EMT induzida pelo fator de um efeito geral de MOR antagonistas sobre este processo (Figuras 7 e 8 e dados de suporte, figura S1). Tomados em conjunto, os nossos dados sugerem MOR desempenha um papel central nos processos de proliferação, migração e mesenquimais transição epitelial sozinho e em conjunto com opióides e factores de crescimento

Painel A:. A representação gráfica da expressão de vimentina% de controlo. H358 células NSCLC humana foram ou não tratados, tratados com 100 fator ng /mL de crescimento epidérmico (EGF), 100 nM de DAMGO, a morfina ou fentanil ou 100 fator ng /mL de crescimento tipo insulina (IGF) durante 96 horas com ou sem pré-tratamento de células com o antagonista MOR periférica, metilnaltrexona (MNTX, 100 nM), MOR siRNA, Gab-1 siRNA, Src siRNA, o inibidor de PI3-quinase LY294002 (10 uM), Akt inibidor X (5 uM), a família de cinases PP2 inibidor de Src (100 nM ) ou o inibidor de Stattic STAT3 (10 uM). Os lisados ​​celulares foram então obtidos e Immunoblot com o anticorpo anti-marcador EMT vimentina. As experiências foram repetidas em triplicado e as bandas imunorreactivas foram analisados ​​por densitometria assistida por computador. Há uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05 indicadas por asteriscos (*)) entre os grupos de controle e tratamento com barras de erro = desvio padrão. Um aumento da expressão de vimentina é sugestivo de uma transição epitelial mesenquimal. Painel B: Representação gráfica da% de controlo claudina-1 de expressão. H358 células NSCLC humana foram ou não tratados, tratados com 100 fator ng /mL de crescimento epidérmico (EGF), 100 nM de DAMGO, a morfina ou fentanil ou 100 fator ng /mL de crescimento tipo insulina (IGF) durante 96 horas com ou sem pré-tratamento de células com o antagonista MOR periférica, metilnaltrexona (MNTX, 100 nM), MOR siRNA, Gab-1 siRNA, Src siRNA, o inibidor de PI3-quinase LY294002 (10 uM), Akt inibidor X (5 uM), a família de cinases PP2 inibidor de Src (100 nM ) ou o inibidor de Stattic STAT3 (10 uM). Os lisados ​​celulares foram então obtidos e Immunoblot com o anticorpo anti-marcador EMT claudina-1. Três experiências independentes em cada condição foram realizados e as bandas imunorreactivas foram analisados ​​por densitometria assistida por computador. Há uma diferença estatisticamente significativa (p 0,05 indicadas por asteriscos (*)) entre os grupos de controle e tratamento com barras de erro = desvio padrão. A diminuição da claudina-1 expressão é sugestivo de uma transição mesenquimal epitelial.

Discussão

NSCLC, que representa ~ 80% de todos os cânceres de pulmão, é uma doença com alta mortalidade e poucas opções de tratamento [44], [45]. Descrevemos previamente que a MOR é regulada positivamente no tecido pulmonar de doentes com NSCLC [12], e que a sobre-expressão de MOR promove o crescimento de tumores e metástases em modelos de xenoenxerto humanos com NSCLC [13].