Abstract
Este estudo examina o papel da s-nitrosylation no crescimento do cancro do ovário usando base de cultura de células e
In vivo
abordagens. Usando o agente nitrosylating, S-nitrosoglutationa (GSNO), uma molécula de óxido nítrico fisiológico, que mostram que o tratamento GSNO inibiu a proliferação de linhas de células de cancro do ovário chemoresponsive e quimiorresistentes (A2780, C200, SKVO3, ID8, OVCAR3, OVCAR4, OVCAR5, OVCAR7, OVCAR8, OVCAR10, PE01 PE04 e) de um modo dependente da dose. GSNO tratamento do factor de crescimento revogada (HB-EGF), a transdução de sinal induzida incluindo fosforilação da Akt, p42 /44 e STAT3, que são conhecidos por desempenhar papéis críticos no crescimento do cancro do ovário e progressão. Para examinar o potencial terapêutico da GSNO
In vivo
, ratinhos nus portadores de xenotransplantes de intra-peritoneais de linha celular de carcinoma do ovário humano A2780 (2 × 10
6) foram administrados oralmente GSNO na dose de 1 mg /kg de peso corporal. a administração oral diária de GSNO atenuou significativamente a massa tumoral (p 0,001) na cavidade peritoneal em comparação com veículo (solução salina tamponada com fosfato) no grupo tratado com 4 semanas. GSNO também potenciado cisplatina mediada toxicidade tumor em um modelo de rato nu carcinoma do ovário A2780. capacidade nitrosylating de GSNO foi refletido no nitrosylation induzida de várias proteínas conhecidas, incluindo a p65 NFkB, Akt e EGFR. Como um novo achado, observou-se que GSNO também induziu nitrosylation com relação inversa à tirosina 705 fosforilação de STAT3, um jogador estabelecido em chemoresistance e proliferação celular em câncer de ovário e de câncer em geral. Em geral, o nosso estudo sublinha a importância de S-nitrosilação de cancro essencial para promover proteínas na modulação do cancro do ovário e propõe o potencial terapêutico de agentes nitrosylating (GSNO) como para o tratamento do cancro do ovário por si só ou em combinação com medicamentos quimioterapêuticos.
Citation: Giri S, Rattan R, Deshpande M, Maguire JL, Johnson Z, Graham RP, et al. (2014) potencial terapêutico pré-clínica de um agente Nitrosylating no tratamento do cancro do ovário. PLoS ONE 9 (6): e97897. doi: 10.1371 /journal.pone.0097897
editor: Chih-Pin Chuu, Institutos Nacionais de Pesquisa em Saúde, Taiwan
Recebido: 07 de janeiro de 2014; Aceito: 24 de abril de 2014; Publicação: 02 de junho de 2014
Direitos de autor: © 2014 Giri et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho é apoiado por subsídio Marsha Rivkin Scholar eo Departamento de Defesa OCRP prêmio W81XWH-12-1-0270 a SG. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de ovário (OVCA) é a quinta causa mais comum de morte por todos os cânceres entre as mulheres nos Estados Unidos e a principal causa de morte por doenças malignas ginecológicas [1]. As elevadas taxas de mortalidade associadas a OVCA é devido à maioria dos pacientes (75%) apresentando generalizada (fase III ou superior) doença no momento do diagnóstico [2]. A fraca sobrevivência de 5 anos (30%) é devido ao facto de a maioria do OVCA são inoperáveis no momento do diagnóstico. Se detectado precocemente, mais de 90% dos pacientes têm um prognóstico melhor e responder à terapia em comparação com pacientes com um estado avançado da doença. Por conseguinte, uma melhor compreensão dos eventos moleculares chave que desempenham papéis importantes em OVCA pode conduzir a um melhor diagnóstico e tratamento.
S-nitrosoglutationa (GSNO) é um agente que medeia nitrosylating o processo pós-translacional de S-nitrosilação em proteínas resultantes na modulação da sua actividade. S-nitrosilação é uma reacção biológica importante de óxido nítrico (NO) e refere-se à conversão de grupos tiol, incluindo os resíduos de cisteína nas proteínas, para formar S-nitrosotióis. É um mecanismo para a regulação pós-tradução dinâmica da maioria ou de todas as classes principais de proteína e é independente de catálise enzimática, a modificação lábil, para ligar /desligar-fotofosforilação como [3]; No entanto, denitrosylation pode ser enzimática ou não enzimática. Um número crescente de proteínas têm sido encontrados se submeter a S-nitrosilação
In vivo,
chamado S-nitrosotióis, e que desempenham um papel importante em diversos processos que variam de transdução de sinal, a reparação do ADN, defesa do hospedeiro, e a pressão arterial controle para regulação canal iônico e neurotransmissão [3]. No entanto, o papel do S-nitrosylation no crescimento OVCA e progressão não foi estudado.
Este estudo foi planejado para examinar o efeito terapêutico de um agente nitrosylating (GSNO) em OVCA usando
in vitro
e
in vivo
modelos e para examinar o papel de nitrosylation em OVCA.
Métodos
Reagentes e anticorpos
GSNO foi comprado a partir Instruments World Precision (Sarasota, FL) e a sua pureza é 98%. Os seguintes anticorpos fosfo-STAT3 (Y705) (Cat # 9145, utilizados na 1:1000), PAKT (Ser473) (Cat # 4060, utilizados na 1:1000), p-p42 /44 (Thr202 /Tyr204) (Cat # 4370, usada na 1:1000), STAT3 (Cat # 9139, usada na 1:1000), Akt (Cat # 4685, usada na 1:1000), P42 /44 (Cat # 9107, usada na 1:1000) eram de sinalização celular (Danvers, MA). Beta-actina (b-actina) foi adquirido da Sigma (St. Louis, MO). soro fetal de bovino foi comprado de BioAbChem (Ladson, SC). STAT3 recombinante foi adquirida a SignalChem (Richmond, Canadá).
Cultura celular
linha celular OVCA humano SKOV3 e OVCARs foram da American Type Culture Collection (Manassas, VA). A2780, C200 e OVCAR4 linhas celulares foram um presente amável do Dr. Tom Hamilton (Fox Chase Cancer Center) [4]. PE01 e PE04 foram um presente amável do Dr. Taniguchi (University of Washington, Seattle) [4]. Todas as linhas de células OVCA foram mantidas e cultivadas em completa Roswell Park Memorial Institute (RPMI)
meios contendo soro e antibióticos fetal bovino a 10%.
Animais
Declaração de Ética.
Six – a oito semanas ratos nus femininos de idade foram adquiridos a partir do Cancer Institute-Frederick Cancer Research e Desenvolvimento Centro Nacional (Frederick, MD). Todos os ratos foram alojados e mantidos em condições específicas em instalações da Clínica Mayo, em Rochester, MN. As instalações são aprovados e inspecionados pela Associação Americana de Acreditação de Cuidados de Animais de Laboratório (AAALAC acreditação # 000717) e de acordo com os regulamentos e as normas do Departamento de Agricultura, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos atuais, e os Institutos Nacionais de Saúde. Todos os estudos foram aprovados e supervisionados pela Institutional Animal Care e Use Committee da Mayo Clinic (IACUC), sob o número de protocolo A13909.
Os ratos foram mantidos de acordo com Institucional IACUC protocolo aprovado. As células A2780 foram lavadas duas vezes e ressuspensas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 2 x 10
6/100 ul e injectado na cavidade intraperitoneal dos ratinhos nus (dia 0). O tratamento com GSNO (1 mg /kg de peso corporal) foi iniciada 3 dias depois da inoculação das células. GSNO foi administrado por sonda oral em 0,1 mL de volume utilizando uma agulha de alimentação de calibre 20 com diâmetro da esfera de 2,25 mm (Braintree Scientific, MA). O grupo de controlo recebeu PBS como um veículo. Os ratinhos foram monitorizados diariamente para qualquer desconforto e pesados a cada terceiro dia para verificar o crescimento do tumor. Para os estudos de combinação, o tratamento com cisplatina (4 mg /kg de peso corporal) por injecções intraperitoneais foram administradas nos dias 7, 14 e 21 juntamente com o tratamento tal como descrito acima GSNO (dia 0 foi considerado como o dia da inoculação de células). Após a indução do tumor, os ratinhos foram monitorizados diariamente para sinais de qualquer sofrimento. Os ratos foram humanamente morto com overdose de CO2 em 4 semanas, quando a carga tumoral atingiram o peso mandato em camundongos não tratados [4], [5] e os tumores foram retirados e fixados em formol para seccionamento.
análise Immunoblot
Após o tempo estipulado de incubação na presença ou ausência de quantidades indicadas de GSNO, análise de imunotransf erência com anticorpos específicos foi efectuado tal como anteriormente descrito [6] – [9]. Em resumo, tratou-se células A2780 e não tratada ou SKOV3 foram tratadas com HB-EGF (50 ng /ml) e /ou GSNO (2 h pré-tratamento antes da adição de HB-EGF em células) em vários períodos de tempo (5-20 min ) foram lisadas em tampão de lise [Tris-HCl 50 (pH 7,5), NaCl 250 mM, EDTA 5 mM, NaF 50 mM, DTT 1 mM, Na3VO4 50 mM e 0,5% de Nonidet P-40] contendo um cocktail inibidor de protease ( Sigma, St. Louis, MO). Quarenta ug de proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi então bloqueada durante 1 hora em 5% de TTBS leite em pó desnatado (Tris 20 mM, NaCl 500 mM e 0,1% de Tween 20, pH 7,5) e incubadas durante a noite em anti-soros primários contra fósforo-STAT3 (Y705), STAT3, p -p42 /44 (Thr202 /Y204), p42 /44, de pAkt (Ser473), Akt ou β-actina contendo 5% de leite em pó desnatado ou BSA a 5% no caso de fosfo-anticorpos. Após a incubação com Ab conjugado com HRP secundário, blots foram desenvolvidos com um sistema de detecção de ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ).
Os ensaios de proliferação
As células (2,5-5,0 x 10
4) foram plaqueadas em placas de 24 poços em triplicado e foi tratada com concentrações indicadas de GSNO durante 48 horas. GSNO oxidado inactivo foi utilizada como um controlo. GSNO oxidado inactivo foi preparado expondo solução GSNO (0,2 mM em DMSO) à luz durante 7 dias. GSNO oxidado é incolor e não produz NO quando adicionado ao meio celular, sozinho ou com células não expostas ao contrário GSNO (Figura S1A C). ensaio de MTT foi realizado como anteriormente descrito [8] para determinar o número de células vivas.
Ensaio de Formação de Colónias
As células (2 x 10
3) foram plaqueadas em triplicado em 6- bem prato e depois de 24 horas, as células foram tratadas com as concentrações indicadas de GSNO uma vez. As células foram deixadas para formar colônias por até 2 semanas e mídia completo foi substituída a cada quarto dia. As colónias foram coradas com MTT e contadas tal como previamente descrito [8].
dose-efeito análises
A concentração para inibição de 50% (IC50) foi determinada com base em curvas de dose-resposta do ensaio de MTT e foi calculado usando o software CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, UK).
migração e invasão ensaio
células SKOV3 foram cultivadas em meio isento de soro durante a noite. Os ensaios de migração zero e invasão foram medidos como descrito anteriormente [5]. Para o ensaio de encerramento de feridas, as células SKOV3 foram cultivadas até à confluência em placas de 24 poços e mantidas em condições de soro baixo (0,2%) durante a noite. Um zero foi criado no meio do poço com uma ponta de 200 ul estéril, e meios substituídos com os respectivos tratamentos. Micrografias foram coletadas em 0 e 24 horas. A distância de pixel entre as lacunas foi medida a um ponto pré-determinado em cada ponto de tempo. A distância percorrida foi subtraído do ponto de tempo de início para estimar a distância percorrida pelas células que migram [10]. Para o ensaio de invasão, células SKOV3 em suspensões (500 ul, 2,5 × 10
4) foram semeadas sobre o topo de placas Transwell revestidas com Matrigel (8- um de diâmetro de poro; BD Biosciences). As câmaras inferiores continha meio isento de soro contendo vários tipos de factor de crescimento incluindo HB-EGF e SDF1 na concentração de 25 ng /ml. Células invasoras a superfície inferior do filtro revestido com uma fina camada de Matrigel foram coradas com 0,5% de violeta de cristal (60% de PBS, 40% de EtOH) e contados com um microscópio invertido. Os resultados a partir de pelo menos duas experiências independentes em triplicado são apresentados.
A imuno-histoquímica (IHC)
Os tumores excisados de ratinhos foram fixados em 10% de paraformaldeído durante 48 horas e embebido em parafina. Quatro mícrons de espessura secções consecutivas foram cortadas e processadas para imunohistoquímica para CD31 (Cat # sc31045, usado em 1:100) e Ki-67 (Cat # M7240, usado em 1:100). Soluções obtidos a partir de Dako Cytomation (Glostrup, Dinamarca) foram utilizados para a realização de imunocoloração. Em resumo, as secções de tecido foram desparafinadas, sem máscara, bloquearam-se com avidina-biotina e incubou-se com anticorpo primário durante a noite. No dia seguinte a reacção foi detectada usando o cromogénio de acordo com as instruções do fabricante (Dako, Glostrup, Dinamarca). As células positivas manchado marrom. As lâminas foram examinadas em microscópio de luz e pictogramas representativos foram tomadas a partir de um mínimo de 5 ou 6 slides diferentes de cada grupo. Para a coloração CD31, foi utilizado anticorpo secundário marcado com FITC e visualizados usando microscópio de fluorescência em 6 seções por grupo.
contar mitótico e medições do tumor ao vivo
A contagem mitótico foi gravado em hematoxilina e eosina seções usando o microscópio de luz Olympus BX-41 no campo de alta potência (HPF; × 400). Células que sofrem mitose foram contadas nos tumores, na área mais ativa ( “hot spots”) em um mínimo de 5 HPF consecutivos. O número médio de células que sofrem mitose por HPF foi enumerada. diâmetro máximo de tumor viável foi calculada pela soma o maior diâmetro unidimensional de cada fragmento de tumor usando a Olympus BX-41 microscópio e um micrômetro. Do mesmo modo, as áreas necróticas foram medidos e o tamanho do tumor ao vivo composto foi calculada a partir de cada lâmina, tal como publicado antes [4], [5].
Análise estatística
Os dados são expressos como o meio + SD e foram analisados estatisticamente pelo teste t de Student (Prism). P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
GSNO inibe a proliferação de linhas de células OVCA
Para avaliar o efeito do tratamento GSNO no crescimento OVCA, várias células OVCA. linhas (A2780, C200, PE01, PE04, OV202 e SKOV3) foram tratados com várias concentrações de GSNO (0,1-1 mM). A proliferação foi determinada por ensaio de MTT depois de 24 horas. O tratamento com GSNO inibiu a proliferação destas linhas celulares OVCA significativamente de um modo dependente da dose (Fig. 1), incluindo a cisplatina resistente C200 (Fig. 1B), PE04 resistente taxol (Fig. 1D) e linhas de células SKOV3 agressivas (Fig. 1E ). A adição de GSNO nos meios de comunicação NÃO Autorização de forma dependente da dose; No entanto, não oxidado GSNO produzir NO (Fig. S1B-C). Nós também medidos de IC50 de GSNO sobre a proliferação celular de diferentes linhas celulares OVCA utilizando o programa CalcuSyn. IC50 para GSNO foram 0,162, 0,385, 0,337, 0,427, 0,196 e 0,235 mmol /L em A2780, C200, PE01, PE04, OV2O2 e SKOV3, respectivamente (Tabela S1). tratamento GSNO também atenuou a proliferação de células de outras linhas celulares, incluindo OVCA OVCAR-3, -4, 5, -7, -8 e -10 de um modo dependente da dose (Fig. S2). A IC50 para a GSNO nestas linhas celulares foram encontrados diferencialmente e listada na tabela S1. A forma oxidada inactivo do GSNO não teve nenhum efeito sobre a proliferação de linhas de células OVCA
Percentagem de viabilidade A2780, C200, PE01, PE04, SKOV3 e OV202 tratados com doses indicadas de S-nitrosoglutationa (GSNO;. 0.1- 1 mM) foi determinada pelo ensaio de MTT. Inactiva GSNO (oxidado, última barra) foi utilizada como um controlo. Os dados representam 3 experiências individuais feitos em triplicado. *** P 0,001; ** P 0,01; * P 0,05 e NS; não é significativo em comparação com células não tratadas, utilizando o teste t de Student (Prism).
Para determinar se esta inibição foi refletido na sobrevivência clonogênica, a colônia capacidade de formação de A2780, células C200, PE01 e PE04 foram realizados . Como mostrado na Figura 2, um único tratamento da GSNO atenuou significativamente a sobrevivência clonogénica destas linhas celulares OVCA de uma forma dependente da dose, em comparação com células não tratadas (Fig. 2). IC50 para GSNO verificou-se ser 0,122, 0,161, 0,356 e 0,352 mmol /L em em A2780, C200, PE01 PE04 e, respectivamente (Tabela S2). Inactiva forma oxidada da GSNO não teve efeito sobre a formação de colónias das linhas celulares OVCA. Estes resultados sugerem que o tratamento GSNO pode resultar numa inibição sustentada da proliferação de várias linhas de células OVCA, incluindo linhas celulares quimiorresistentes (C200 e PE04) (figura 2B, C . F).
As células (2 × 10
3) /poço (A2780, C200, e PEO1 PEO4) foram plaqueadas em placas de 6 poços e tratadas com as concentrações indicadas de S-nitrosoglutationa (GSNO) uma vez. GSNO oxidada foi utilizada como um controlo negativo (última barra). Após 2 semanas, as colónias foram coradas com MTT e contadas. Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão de triplicados. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 e NS; não é significativo em comparação com células não tratadas, utilizando o teste t de Student (Prism).
GSNO atenua fatores de crescimento induzido migração e invasão celular
in vitro
A seguir, examinou o efeito da GSNO em factor de crescimento mediado migração celular e invasão. células SKOV3 cultivadas durante a noite em baixa de soro (0,2%) contendo meio foram riscado usando um estéril 200 mL ponta da pipeta, uma vez que tinha atingido 90% de confluência. Vários factores de crescimento incluindo HB-EGF e SDF1 (50 ng e 25 ng /ml, respectivamente) foram adicionados individualmente ao meio na presença ou ausência de GSNO (200 uM). Vinte e quatro horas mais tarde, foi calculada a taxa de encerramento de feridas. Como mostrado na Figura 3A, GSNO inibiram todos a migração celular mediada HB-EGF e SDF1 na linha celular SKOV3. Resultados semelhantes foram obtidos para as linhas celulares A2780 e C200 (dados não mostrados). Em seguida avaliou-se o efeito da GSNO na modulação do factor de crescimento invasão mediada por células SKOV3 usando ensaio de migração câmara de Boyden (BD Bioscience, San Jose, CA) como descrito anteriormente [11]. A Figura 3B demonstra claramente que o tratamento GSNO inibiu significativamente o factor de crescimento induzido invasão de células SKOV3 em comparação com células não tratadas. Estes resultados indicam que a GSNO tem a capacidade para inibir a migração e a invasão de células OVCA.
. As células cultivadas com HB-EGF e SDF1 na ausência ou presença de S-nitrosoglutationa (GSNO) e a migração de células foram medidos por ensaio de encerramento de feridas, tal como descrito em materiais e métodos. Os resultados são apresentados como média ± DP de n = 7. B. Para examinar o efeito da GSNO de invasão, 1 × 10
5 SKOV3 células foram semeadas em poços superiores com GSNO 0,2 mM na câmara superior do Transwell em 500 ul de meio de cultura. Vários factores de crescimento (HB-EGF e SDF1) (25 ng /ml) foi adicionado aos meios subjacentes. Vinte e quatro horas mais tarde, a invasão foi determinada seguintes instruções do fabricante. Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão de triplicados. $$$ P 0,001 factor de crescimento tratados em comparação com o controlo. * P 0,05; *** P . 0.001 GSNO tratados em comparação com o factor de crescimento utilizando o teste t de Student (Prism)
GSNO anula a sinalização induzida do fator de crescimento em células OVCA
Para examinar o efeito do GSNO em factor de crescimento de sinalização induzida, soro A2780 fome e células SKOV3 foram tratados com GSNO seguido por tratamento HB-EGF durante vários períodos de tempo. As células foram colhidas e coradas imunologicamente para várias moléculas de sinalização. Como mostrado na Figura 4, o tratamento com GSNO inibida HB-EGF activação da STAT3 induzida, Akt e p42 /44, como é evidente a partir das amostras diminuição ou falta de fosforilação detectadas e HB-EGF tratada. tratamento GSNO também reduziu os níveis basais de forma fosforilada da Akt, STAT3 e P42 /44 em A2780 e SKOV3 linhas de células (Fig. 4). controlo inactivo (oxidado GSNO) não teve efeito sobre a sinalização induzida por factor de crescimento, o que sugere a especificidade da GSNO na atenuação HB-EGF sinalização induzida e um possível mecanismo através do qual GSNO medeia a atenuação do crescimento celular, migração e invasão de células OVCA
in vitro
A2780 células SKOV3 (B) (a) e foram plaqueadas, privadas de soro durante a noite e tratados com S-nitrosoglutationa (GSNO; 0,5 mM). ou controlo inactivo (GSNO oxidada; 0,5 mM) na presença ou ausência de HB-EGF (50 ng /ml) durante vários períodos de tempo (5-20 min). As células foram colhidas nos pontos de tempo indicados e processados para a detecção de várias moléculas de sinalização, incluindo pSTAT3 (Tyr705), pAkt (Ser473) e p-p42 /44 (Thr202 /Tyr204) utilizando os seus anticorpos específicos a partir de Cell Signaling (Danvers, MA). foi utilizado total STAT3, Akt, p42 /44 e β-actina de carga igual. Borrões são representativos de duas experiências são executados de forma independente.
A administração oral de GSNO atenua o crescimento do tumor e melhora a cisplatina induziu citotoxicidade
in vivo
A fim de determinar se GSNO poderia atenuar o crescimento do tumor
in vivo
, células A2780 (2 × 10
6) em PBS foram inoculados por via intraperitoneal em 6 semanas ratinhos nus, sexo feminino, para o estabelecimento de tumores. Os ratinhos foram divididos em dois grupos de tratamento. O primeiro grupo (não tratada) recebeu 100 ul de PBS como veículo por sonda esofágica. O segundo grupo foi administrado por via oral GSNO em PBS (100 ul) na dose de 1 mg /kg de peso corporal por dia, tal como descrito no Material e Métodos (Fig. 5A). No final de 4 semanas, os ratos foram sacrificados, e o peso do tumor grosseiramente foi examinada, excisados e pesados. A administração diária de GSNO reduziu significativamente a circunferência abdominal (p 0,01) (Fig 5B.), uma indicação da carga de tumor a ser realizado no peritoneu. GSNO crescimento tumoral também reduzida (p 0,001) na cavidade peritoneal de ratinhos nus portadores de A2780 em comparação com o veículo (PBS) grupo tratado. Os pesos médios dos tumores excisados foram de aproximadamente 68% em menos de GSNO (3,35 ± 0,52 g) em comparação com ratinhos tratados com ratos não tratados (7,91 ± 0,412 g) (Fig. 5C). Como relatado anteriormente por Shaw et al [12] e nos [4], injectado por via intraperitoneal células A2780 formado principalmente tumores sólidos e metástases apresentou com específicos de ovário (Fig 5D, painel inferior). As massas tumorais associadas ao ovário em ratinhos tratados GSNO foram muito menores do que nos ratinhos não tratados (Fig. 5D). Para avaliar ainda mais a viabilidade do tumor, o tamanho do tumor viáveis e necróticas foi determinada a partir de hematoxilina e eosina secções coradas. A razão entre o tamanho do tumor ao vivo para o tamanho total do tumor foi calculado com base no diâmetro maior unidimensional tal como descrito nos métodos. Como mostrado na Figura 5E, derivados de xenoenxertos de ratinhos tratados GSNO tinham tamanhos significativamente menos viáveis de tumor (p 0,001), e aumento regiões necróticas em comparação com xenotransplantes derivados de ratinhos não tratados. Embora tenha havido uma tendência decrescente observada em mitose e vasos contagens dos tumores ratos tratados GSNO, não pudemos detectar uma mudança significativa (Fig. 5F-G). No geral, nosso estudo sugere fortemente o potencial do agente nitrosylating para atenuar o crescimento de OVCA
in vivo
(Fig. 5).
A. Diagrama esquemático do projeto experimental. Em resumo, a linha celular de cancro do ovário A2780 foi injectado intraperitoneal em ratinhos nus e S-nitrosoglutationa (GSNO) foi administrada por via oral diariamente a partir do dia 3 na dose de 1 mg /kg de peso do corpo até ao final do estudo. Salina tamponada com fosfato (PBS) foi determinado como veículo. B. A diminuição da circunferência abdominal de ratinhos tratados GSNO em comparação com os grupos tratados com veículo medidos na semana 4 (** p 0,01 tratados em comparação com o veículo). C. Diminuição pesos dos tumores excisados de ratinhos tratados GSNO comparação com o veículo tratado na semana 4 (*** p 0,001 tratado em comparação com o veículo). Os resultados são apresentados como média ± SD de 10-14 animais individuais. D. Representante imagem morfológica bruta da massa tumoral e tumor associado com ovário de veículo e ratos tratados GSNO. E. As medições do tamanho do tumor viável da GSNO vs ratinhos tratados com PBS, como descrito nos métodos (*** p 0,001 tratados em comparação com o veículo). Contagem de células mitóticas F. e G. contagem de vasos positivos para CD31 por HPF (X400) em GSNO vs ratinhos tratados com PBS, como descrito nos métodos), as contagens foram realizadas a partir de 5 campos de 3 tumores diferentes de cada grupo. NS; não significativa tratado em comparação ao veículo.
Nós examinado novamente se uma combinação de GSNO com cisplatina pode aumentar o efeito citotóxico em tumores. Por conseguinte, a seguir à injecção de células A2780, 2 conjuntos de ratos foram tratados diariamente com a administração oral de GSNO (1 mg /kg de peso corporal) e cisplatina (injecção intraperitoneal de cisplatina por semana nos dias 7, 14 e 21) como monoterapia. Para a terapia de combinação, um conjunto de ratinhos foi tratado com cisplatina GSNO e, conforme ilustrado na Figura 6A. Ambos GSNO e cisplatina foram significativamente eficaz na redução do crescimento tumoral e de massa como monoterapia em ratinhos portadores de A2780 (Fig. 6B). No entanto, a terapia de combinação foi mais eficaz na inibição do crescimento tumoral em comparação com a monoterapia de qualquer um dos fármacos. Combinação da cisplatina (4 mg /kg de peso corporal) com GSNO (1 mg /kg de peso corporal) (2,08 ± 0,18 g) (Fig. 6B) o crescimento de tumores significativamente reduzido quando comparado com qualquer GSNO (3,54 ± 0,35 g) ou cisplatina tratamento por si só (3,15 ± 0,34 g) ou ratinhos não tratados (6,9 ± 0,66 gm). O volume tumoral foi reduzido em -90% na maioria dos ratinhos tratados com a combinação. Colectivamente, estes resultados sugerem que a combinação com o tratamento com cisplatina GSNO é significativamente eficaz na redução do crescimento do tumor em um modelo de rato OVCA.
. Diagrama esquemático do projeto experimental. B. peso do tumor excisado cumulativa a partir de ratinhos individuais em 4 semanas com S-nitrosoglutationa (GSNO; 1 mg /kg de peso corporal) (painel 2), cisplatina (4 mg /kg de peso corporal) (painel 3) e GSNO (1 mg /kg de peso corporal) e cisplatina (4 mg /kg de peso corporal) combinação (painel 4). A cisplatina foi administrada 3 vezes por via intraperitoneal no dia 7, 14 e 21 injeções pós-tumorais. Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão de 7 animais individuais. *** P 0,001 combinação do grupo tratado com cisplatina GSNO + comparado com o grupo não tratado ou tratado sozinho cisplatina; ** P 0,01 GSNO grupo tratado em relação ao grupo não tratado; * P 0,05 cisplatina grupo tratado em relação ao grupo não tratado; # P . 0,05 combinação de grupo GSNO + cisplatina em comparação com GSNO só grupo
nitrosylation induzida tratamento GSNO de STAT3
Uma vez que, GSNO é um agente nitrosylating e conhecido para mediar a pós-tradução processo de S-nitrosilação em proteínas, o que resulta na modulação da sua actividade [13]. Foi examinado o efeito da GSNO em nitrosilação em várias proteínas endógenas que são conhecidos por ser nitrosilado e principais intervenientes no OVCA incluindo Akt, p65 e EGFR [14] – [17].
Para examinar a nitrosilação de várias proteínas , utilizamos um ensaio de biotina-switch sofisticado. nível basal de proteínas nitrosilado poderia ser detectada entre 250 e 35 kD de peso molecular em células OVCA (Fig. 7A, pista 1). tratamento GSNO potenciou o nitrosilação de proteínas endógenas em células tratadas com GSNO (0,5 mM) durante 2 horas (Fig. 7A, pista 2). A especificidade de nitrosilação poderia ser conseguido omitindo a adição de HPDP-biotina durante ensaio de biotina-interruptor. Como mostrado na Figura 7A, pista 3, a omissão do passo de HPDP-biotina bloqueou completamente a detecção de nitrosilação de proteínas endógenas, o que sublinha a especificidade do método nitrosilação no nosso laboratório. Nós validado ainda mais a indução de nitrosylation por GSNO observando para nitrosylation de proteínas já relatado de sinalização associados com a progressão do câncer, incluindo ovário. GSNO tratamento induziu a nitrosilação de p65, Akt e EGFR como esperado (Fig. 7B). Detectamos ainda mais a observação única de STAT3 submetidos nitrosilação mediante tratamento GSNO (Fig. 7B, C). Para confirmar que STAT3 é nitrosilado, STAT3 foi imunoprecipitado após ensaio de biotina-switch usando seu anticorpo específico e imunologicamente com anti-biotina-HRP. Uma observação semelhante de STAT3 passando por nitrosylation após tratamento GSNO foi visto. Estes conjuntos de experimentos indicam claramente um regulamento novela de STAT3 por s-nitrosylation. Para examinar melhor se esse fenômeno não se limita a um tipo de célula, nós tratamos várias linhas de células OVCA incluindo A2780, C200 e SKOV3 com GSNO e oxidado GSNO como controle. Após 2 horas de incubação, lisado de celular total foi processada para a detecção do estado de fosforilação da STAT3. Como mostrado na Figura 7D, o tratamento GSNO suprimidos ou reduzidos a fosforilação de tirosina em todas as linhas celulares OVCA sem afectar os níveis de STAT3. Oxidado GSNO não afetou os níveis pSTAT3 em todas as linhas celulares. Em condições experimentais semelhantes, examinamos a nitrosylation da STAT3 usando o método de alternar biotina. GSNO tratamento aumentou a nitrosilação total de múltiplas proteínas com baixo para pesos moleculares elevados comparados com amostras não tratadas GSNO tratada e oxidados, como é evidente a partir da Figura 7E. Um padrão similar foi observado em nitrosylation da STAT3 sugerindo que o aumento mediado GSNO em nitrosylation da STAT3 é um fenômeno geral em todas as linhas celulares OVCA.
A. Detecção de proteínas biotiniladas após método de biotina-interruptor na presença ou na ausência de S-nitrosoglutationa (GSNO; 0,5 mM). Omissão de biotina-HPRT indica a especificidade da S-nitrosylation pelo método de biotina-switch. B. Detecção de nitrosylation de várias proteínas incluindo EGFR, p65, Akt e STAT3 em células de câncer de ovário após tratamento GSNO. C. STAT3 foi imunoprecipitado a partir de lisados de proteína nitrosilado após ensaio de interruptor de biotina e a sua biotinilação foi detectado pelo anti-biotina-HRP utilizando análise de Western blot. D. A2780, C200 e SKOV3 linhas celulares foram tratadas com GSNO (0,5 mM) ou GSNO oxidado (0,5 mM) como controlo, durante 2 horas, seguido por análise de imunotransferência para detecção da fosforilação da tirosina de STAT3 no resíduo 705 e STAT3 total. E. Sob condições experimentais similares como “D”, A2780, células C200 e SKOV3 foram processados para o método de interruptor de biotina para a detecção da STAT3. Amostra na pista 4 foi tratado com GSNO como pista 2, excepto durante o processamento para o ensaio de interruptor de biotina; a adição de HPDP foi omitido. painel superior mostra as proteínas biotiniladas após ensaio de biotina-switch. Nitrosilado STAT3 foi detectado, puxando para baixo as proteínas biotiniladas por estreptavidina-agarose seguido por análise de imunotransf erência utilizando anticorpos anti-STAT3. bandas inferiores mostram os níveis totais de STAT3 entrada processados para o ensaio de interruptor de biotina.
GSNO nitrosylates STAT3 e afeta sua capacidade de ligar DNA
Uma vez que estabeleceu que STAT3 sofre nitrosylation em células em cultura , nós examinado novamente se STAT3 poderia ser nitrosilado
in vitro
e se ele pode afetar sua capacidade de ligação ao ADN. Para isso, tomou duas abordagens, primeiro, isolado extracto nuclear de SKOV3, que apresenta níveis basais mais elevados de forma fosforilada da STAT3 e tem a capacidade de se ligar DNA STAT3 motivo de ligação sem estimulação. Nós incubadas 20 ug de extracto nuclear (NE) ou com GSNO GSNO oxidado na presença ou ausência de DTT durante 4 horas. Após a incubação, a capacidade de ligação ao ADN da STAT3 foi examinada por incubação de NE nitrosilado com oligonucleótidos de desvio em gel de agarose conjugadas com STAT3. Como mostrado na Figura 8A, a amostra tratada GSNO mostrou nitrosilação de STAT3, como é evidente pelo ensaio de interruptor de biotina e não pode ser puxado para baixo por oligonucleótidos de desvio em gel de agarose conjugadas com STAT3. Inclusão de TDT em amostras abolida GSNO nitrosilação da STAT3 mediada, resultando na ligação da STAT3 no seu motivo de ligação ao ADN. STAT3 também foi mostrado para recrutar incluindo coactivador p300.