Abstract
Fundo
A mutação de antagonistas de sinalização Wnt APC ou Axin activa a sinalização β-catenina em muitos cancros, incluindo a maioria dos adenocarcinomas colorretais humanos. O fenótipo da
apc
ou
axina
mutação na mosca da fruta
Drosophila melanogaster
é muito semelhante à causada por mutação no gene segmento de polaridade,
nua cutícula (NKD)
. NKD inibe a sinalização de Wnt por ligação à família Dishevelled (Dsh /Dvl) de proteínas de andaime que apontam para a activação do receptor de Wnt p-catenina e a transcrição acumulação TCF-dependente, mas humano
NKD
genes ainda têm de ser directamente implicada no câncer
Metodologia /Principais achados
Nós identificamos para as mutações primeira vez em
NKD1.
– um dos dois humana
NKD
homólogos – em um subconjunto de tumores colorretais reparação deficiente de incompatibilidade de DNA que não são conhecidos por abrigar mutações em outros genes Wnt-via. As proteínas Nkd1 mutantes são defectivos na inibição da sinalização de Wnt; Além disso, as proteínas mutantes Nkd1 estabilizar β-catenina e promover a proliferação das células, em parte devido a uma capacidade reduzida de cada proteína Nkd1 mutante para se ligar e desestabilizar proteínas DVL.
Conclusões /Significado
nossos dados levantam a hipótese de que
NKD1
mutações específicas promover tumorigênese Wnt-dependente em um subconjunto de adenocarcinomas colorretais DNA incompatibilidade de reparação de deficientes e cancros humanos, possivelmente, outro sinal de Wnt-impulsionado
Citation.: Guo J, Cagatay t, Zhou L, Chan CC, Blythe S, Suyama K, et al. (2009) Mutações no Human
cutícula nua
homólogo
NKD1, achou em Colorectal Cancer Alter Wnt /Dvl /β-catenina Sinalização. PLoS ONE 4 (11): e7982. doi: 10.1371 /journal.pone.0007982
editor: Neil A. Hotchin, da Universidade de Birmingham, Reino Unido
Recebido: 5 de Agosto de 2009; Aceito: 19 de outubro de 2009; Publicação: 24 de novembro de 2009
Direitos de autor: © 2009 Guo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma Institutional Research Grant American Cancer Society (para KW); os Institutos Nacionais de Saúde (R01-GM65404 para K.W .; R01-CA60117 para S.N.T.); ea Mayo Clinic /Foundation (de W. L.). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a ativação do “canonical” Wnt /β-catenina sinalização em quase todos os adenocarcinomas colorretais humanos (CRC) faz com que a via Wnt um alvo terapêutico ainda inexplorado promissor [1]. O paradigma dominante para a sinalização Wnt canônica foi deduzida em parte através de estudos de desenvolvimento elegantes da mosca da fruta
Drosophila melanogaster
eo anfíbio
Xenopus laevis
: Na ausência do sinal de Wnt, um “complexo de destruição”, composto das proteínas Apc, Axin, GSK3β, e CK1 fosforila β-catenina, conduzindo a p-catenina ubiquitinação e degradação proteossómica [2]. A ligação de ligandos Wnt para co-receptores Frizzled /LRP activa a proteína andaime Dishevelled (Dsh; DVL1, Dvl2, Dvl3 em mamíferos), que conduz ao sequestro e degradação de Axin, que permite β-catenina a acumular-se, entrar no núcleo, e ligam-se a transcrição TCF fatores que regulam os genes-alvo [2].
a maioria (60-85%) de exposição CRC humano activados sinalização Wnt canônico devido ao truncar mutações em
APC
que estabilizar β-catenina [3 ]. Alternativamente, as mutações em β-catenina
(CTNNB1)
que a fosforilação bloco e degradação são encontrados em alguns CRC que carecem de
APC
mutação [4]. CRCs visor, pelo menos, dois tipos de instabilidade genômica: instabilidade cromossômica (CIN) associado com mutante Apc e p53 e dando origem a aneuploidia, e microsatélite instabilidade (MSI), causada por DNA defeituoso reparação de incompatibilidade (MMR) e resultando em mutações na sequência simples repetições (SSR) em todo o genoma [5], [6]. A mutação de SSRs em regiões codificadoras ou junção de processamento de genes reguladores fundamentais pode criar mutante ponto ou proteínas truncadas que promovam a progressão do cancro; na verdade, a deficiência de MMR e MSI são característicos de tumores em pacientes com síndrome do câncer colorretal hereditário sem polipose {HNPCC; Síndrome a.k.a. Lynch (OMIM 120435)} e de 13-17% do CRC esporádica [7].
APC
mutações são predominantes em [3] CIN-CRC, mas o espectro de mutação genética via Wnt no MSI-CRC é menos bem caracterizada, com mutações no homólogo Axin
AXIN2
eo TCF fator de transcrição -family
TCF7L2
identificado em ~ 25% e ~ 35% do MSI-CRC, respectivamente [8], [9].
APC
mutação é menos frequente no MSI-CRC do que em CIN-CRC [10], [11], enquanto que mutações ativadoras em
CTNNB1
, embora muito difundida em todo o espectro de câncer humano, são raro na MSI-CRC [11]. Estes dados sugerem que mecanismos adicionais ativar sinalização de Wnt /β-catenina em MSI-CRC
A cutícula Nu (NKD) família de proteínas atenua a sinalização de Wnt canônico pela ligação e proteínas possivelmente desestabilizadores Dsh /DVL [12] -. [ ,,,0],17].
Drosophila NKD
mutantes desenvolver defeitos de segmentação letais muito semelhantes aos observados em
apc
ou
axina
mutantes [12], [18], [19] (Fig. 1A ). Nós, portanto, a hipótese de que a alteração da
NKD
atividade do gene em mamíferos pode ativar Wnt sinalização e causam câncer. Aqui nós identificar novas mutações no ser humano
gene NKD1
no MSI-CRC que alteram a sinalização Wnt e reduzir NKD /interações Dsh. Nossos dados sugerem que específica
NKD1
mutações alteram a sinalização Wnt /β-catenina em uma minoria de MSI-CRC, bem como, possivelmente, em outros tumores dependentes de sinal β-catenina em que mutações nos reguladores Wnt conhecidos são pouco frequentes .
(A) do tipo selvagem,
axina, apc
, e
Drosophila NKD
cutículas. tipo selvagem tem faixas alternadas denticle (seta) e cutícula nua (ponta de seta), com cada mutante sem bandas denticle. (B)
NKD1
lócus tem 10 exons. Nkd1 esquemático (laranja) inclui miristoila�o N-terminal, EFX, 30aa (azul), e motivos carboxi-terminal His-ricos. Exon 10 sequências em torno de poli (C) tratos (vermelho) acima nativa (preto) e resíduos (azul) mutantes são mostradas. (C)
NKD1
eletroferogramas mostrando o tipo selvagem (WT) poli (C)
7, linha de células TC7 com C-exclusão (C6), linha de células RKO com C-inserção (C8), e linha de células HCT15 com G Uma mutação (seta) 3 ‘poli (C)
7. (D, E) blots α-Nkd1 de extractos de células inteiras (D) e Triton X-100 fracções solúveis e insolúveis (E) a partir de linhas celulares com indicada
NKD1
mutação. Setas designar proteínas Nkd1. β-actina está a carregar o controle em D. CCD841 tem comprimento total Nkd1, com um produto de degradação menor em ~ 35 kDa, também visto com transfectadas
NKD1
(por exemplo, Fig. 1E, 5C), enquanto SW480 com mais abundante, mas do tipo selvagem Nkd1 tem vários produtos de degradação.
Resultados
NKD1
mutações no adenocarcinoma colorretal
Foram identificados três diferentes
NKD1
exão 10 de codificação mutações região em 5/11 linhas celulares CRC e 2/40 tumores CRC esporádicos com MSI (Tabela 1), mas nenhum
NKD1
região codificadora ou junção de processamento mutações em 5/5 células CRC linhas e 50/50 tumores sem MSI. Duas mutações, quer uma desoxicitidina (C), deleção ou inserção devido à derrapagem polimerase dentro de um exão-10 poli- (C)
7 trato, resultar na síntese de proteínas truncadas de 345 ou 298 aminoácidos (aa) (fig . 1B, C). A (C)
7 adjacente mutação missense (G A) converte Arg-288, conservado em Nkd2, a Sua (Fig 1B, C.).
NKD1
mutações não foram detectados em 32/40 tumores MSI-CRC que abrigam mutações em outros genes Wnt-pathway incluindo
APC
,
CTNNB1
,
AXIN2
e
TCF7L2
, mas foram encontrados em dois dos restantes 8/40 tumores sem lesões nesses genes conhecidos Wnt-via (p = 0,036, uma cauda de teste exato de Fisher) (Tabela 1; veja Materiais e métodos). Estes dados indicam a exclusividade mútua entre mutações no
NKD1
e outros genes Wnt-via em nossa coorte de amostras de tumores MSI-CRC, sugerindo que o
NKD1
mutações são de significado patológico.
Tanto o cólon epitelial CCD841 linha celular e a linha de células CRC SW480, este último com um C mutação T em
APC
códon # 1338 [20], codificar um tipo selvagem Nkd1 (470 aa) de 53,2 kDa que migra a ~ 50 kDa em western blot (Fig. 1D, E). As linhas celulares e TC7 Co115, cada um com o (C)
6 mutação, tem uma banda ~39 kDa que corresponde a 38,1 kDa Nkd1
C6, enquanto que a linha de células RKO, com a (C)
8 mutação, tem uma banda ~33 kDa que corresponde a 33,4 kDa Nkd1
C8; todas as três linhas celulares com Nkd1 truncado também têm menos abundante de comprimento completo Nkd1, sugerindo que o de tipo selvagem
NKD1
lócus não sofre de perda de heterozigosidade (Fig. 1D). Por western blot com anticorpos Nkd1 somos incapazes de distinguir o tipo selvagem de Nkd1 mutante na linhagem de células HCT15, que abriga
NKD1
R288H
(Fig. 1D).
proteínas NKD são associada a membrana, os Nkds mamíferos por virtude de miristoilação de terminal-N [14], [21], [22]. As proteínas Nkd1 truncado tem uma afinidade reduzida para membranas comparado com o comprimento total Nkd1 como inferido por Triton X-100 a solubilidade: 95% de NKD
C6 ou NKD
C8 a partir de linhas de células mutantes é TX-100 solúvel, enquanto 0-26% de full-length Nkd1 de todas as linhas de células é TX-100 solúvel (Fig. 1E).
proteínas mutantes Nkd1 estão com defeito na inibição Wnt /Dvl sinalização
mouse Nkd1 pode inibem eixo duplicação induzida pela sinalização Wnt ectópica em
Xenopus
embriões [16]. Como mostrado na Fig. 2A, 90% da
Xenopus
embriões injectados com
XWnt8
mRNA desenvolvidos parcial-se completa a duplicação eixo; consistente com a atividade de Nkd1 como um antagonista de Wnt, do tipo selvagem humana
NKD1
mRNA co-injeção reduzida frequência duplicação eixo a 42%, com apenas 3% duplicações completos. Em contraste, a co-injecção de cada mutante humana
NKD1
resultou na duplicação dos eixos frequências semelhantes à observada com
XWnt8
injecção sozinho (Fig. 2A). Tal como em linhas celulares, misexpressed Nkd1
C6 e Nkd1
C8 foram mais abundantes do que de tipo selvagem ou Nkd1 Nkd1
R288H por Western blot (não mostrado). De acordo com o
Xenopus
resultados, de tipo selvagem Nkd1, mas nenhum dos três mutantes, suprimiu a activação induzida por Dvl do TOPflash TCF-repórter em células HEK-293 (Fig. 2B). Expressão do mutante por si só ligeiramente Nkd1 aumento da actividade basal TOPflash e não teve efeito sobre endógena
Xenopus
formação do eixo (não mostrado), indicando que o efeito de Nkd1, como a de
NKD
na mosca , depende de Wnt sinalização [23].
(A)%
Xenopus
embriões com fenótipo eixo indicado após a injecção de
XWnt8
+/- do tipo selvagem ou mutante
NKD1
. (N) = # embriões injectados. Painéis à direita mostram lateral do representante (L) e dorsal (D) vistas de embriões marcados como único eixo (branco), eixo curto A /P (cinza claro), a duplicação do eixo parcial (cinza escuro), e duplicação do eixo completo (preto) de acordo com os Materiais e Métodos. Em embriões com eixo simples nos painéis da esquerda, observe tronco (seta branca) e da glândula de cimento (seta preta). Pontas de seta designar cada eixo em embriões com duplicações eixos (painéis da direita). Embriões com a duplicação do eixo parcial ter duplicado tecido tronco, mas uma única glândula de cimento, enquanto embriões com a duplicação do eixo completo ter duplicado tecidos tronco e glândulas de cimento. (B) a actividade da luciferase Normalizada TOPflash (RLU) em células HEK-293 transfectadas com o repórter +/- Dvl2 +/- indicado Nkd1 construir.
NKD1
mutações estabilizar β-catenina e promover a proliferação de células
de acordo com o
NKD1
mutações de activação de sinalização de Wnt na CRC, os níveis citoplasmáticos e nucleares de β-catenina em células são mais elevados do que em células Co115 CCD841 (Fig. 3a). Por conseguinte, β-catenina nuclear foi proeminente em células de Co115, mas não em células CCD841 (Fig. 3B e C). As células HEK-293T transfectadas com Nkd1
C6, Nkd1
C8, ou Nkd1
R288H tinham níveis mais elevados de citosólica β-catenina de células transfectadas com o tipo selvagem Nkd1 ou um controlo (Fig. 3D), indicando que cada proteína mutante pode estabilizar Nkd1 β-catenina.
(A) transferência de Western de extractos citosólicos e nucleares de células com o tipo selvagem (CCD841) ou mutante (Co115)
NKD1
. GAPDH e HDAC2 foram sondadas como controlos de carga. células (B-B “, C-C”) β-catenina (vermelho) e de ADN de distribuição (azul) em células CCD841 (B-B “) e Co115 (C-C”). Setas designar núcleos. imagens fundidas em B “e C”. (D) mancha de Western de extractos citossólicos de células HEK-293 transfectadas com
lacZ de controlo (-), do tipo selvagem Nkd1 (WT), ou mutante indicado Nkd1 construir, e sondadas para β-catenina, Nkd1, e carregar GAPDH controle. Note-se que cada mutante Nkd1 mas não do tipo selvagem Nkd1 aumenta os níveis de β-catenina. (E) o número de células relativo como uma função dos dias após a infecção retroviral de células CCD841 com controlo de vector vazio, do tipo selvagem Nkd1, ou indicado Nkd1 mutante (p = 0,016, 0,012, e 0,0091 para C6, C8, e mutantes R288H, em comparação com controlo) () número relativo de células F como uma função dos dias após a infecção retroviral de células de Co115 com controlo ou do tipo selvagem Nkd1 (p = 0,022). α-Nkd1 Western blot de extratos de células, com GAPDH ou controlo de carga β-actina, são mostrados abaixo de cada parcela em E e F.
Desde canônica Wnt sinalização promove a proliferação celular [2], nós ensaiada a acumulação de células que expressam uniformemente níveis comparáveis de quer de tipo selvagem ou mutante Nkd1. expressão retroviral de cada proteína Nkd1 mutante em células CCD841 aumentou o número de células em comparação com tipo selvagem Nkd1 ou controlo de vector vazio (Fig. 3E). Por outro lado os números de células, expressão de tipo selvagem em células Nkd1 Co115 reduzidas (Fig. 3F). Estes dados indicam que o
NKD1
mutações podem promover a estabilização β-catenina e a proliferação de células do cólon.
localização subcelular alterada e Dvl co-localização de truncado Nkd1
Não foi possível detectar endógena Nkd1 em linhas celulares por imunocitoquímica, de modo a investigar a relação entre Nkd1 localização e actividade foi examinada a localização das proteínas marcadas em células HEK-293. Nkd1 localiza em uma punctate, distribuição predominantemente citoplasmática semelhante ao
Drosophila
NKD
GFP quando expressos em glândula salivar mosca (Fig. 4A, F). Em contraste, Nkd1
C6 e Nkd1
C8 distribuir difusamente no citoplasma (Fig. 4B e não mostrado), coerente com o seu detergente maior solubilidade em relação ao Nkd1 (Fig. 1E), enquanto Nkd1
agregados R288H como de tipo selvagem Nkd1 (não mostrado).
(A, B) As células HEK-293 que expressam HA /Flag-tagged Nkd1 (A) ou Nkd1
C8 (B) corado com α-HA (verde ). Nkd1 se acumula no ponto lacrimal (setas), enquanto Nkd1
C8 é difusamente distribuídos no citoplasma. Nkd1
C6 distribuídos segundo um padrão semelhante ao Nkd1
C8 (não mostrado). (C, D) As células que co-expressam Dvl3 e de tipo selvagem (C) ou C8 (D) Nkd1
construções de GFP. Nkd1-GFP (verde, C) mostra uma co-localização perto completa (setas) com Dvl3 (vermelho, C ‘), enquanto Nkd1
C8-GFP (D) acumula-se em agregados citoplasmáticos rodeado por Dvl3 (setas). imagens fundidas estão em C “, D”, o DNA é azul na A-D. Resultados semelhantes foram observados em células que co-expressam Nkd1
C8-GFP e DVL1 ou Dvl2, e em células que expressam Nkd1
C6-GFP e DVL1, Dvl2, ou Dvl3 (não mostrado). (E) da glândula salivar do tipo selvagem terceiro instar
Drosophila
larva corados com α-Dsh (vermelho) mostrando coloração difusa e pontuada. (F-F “)
A8-Gal4 /UAS-NKD
GFP
glândula salivar corados com α-Dsh e fotografada para GFP (F) e Dsh (F ‘; fundiram em F”). Fly NKD
GFP relocalizes Dsh para perinuclear agregados (setas) semelhantes aos observados com Nkd1
GFP /Dvl3 em C.
proteínas DVL localizar a dinâmica, citoplasmática e plasma membrana-associado os agregados que têm sido propostos para amplificar Wnt /β-catenina sinalização [24]. Consistente com
in vitro
associação NKD /Dsh, expressão de Nkd1
GFP em células HEK-293 ou voar NKD
GFP na glândula salivar deu origem a agregados intracelulares com colocalized NKD e Dsh /Dvl ( A Fig. 4C-C “, F-F”, e não mostrado). Em contraste, cada Dvl co-sintetizados com cada truncado Nkd1
GFP (C6 ou C8) agregados formados, mas colocalização em vez disso foi observada nas interfaces agregados, com agregados DVL tipicamente vizinhas truncadas agregados Nkd1 (Fig. 4D-D “e não mostrando). Embora o significado dessas localizações vis-à-vis a sinalização de Wnt é claro, as proteínas Nkd1 truncadas identificados na CRC exibiu uma capacidade reduzida de colocalize com proteínas DVL, em comparação com full-length Nkd1.
proteínas mutantes Nkd1 são defeituoso na ligação de proteínas DVL
em seguida, investigaram o mecanismo bioquímico da inibição do sinal Wnt defeituosa por proteínas Nkd1 mutantes. O motivo NKD EFX se liga a região básica /PDZ de proteínas DVL Dsh /[14]. Surpreendentemente, cada mutante Nkd1, apesar de ter um motivo EFX intacto, ligado cada proteína Dvl menos do que de tipo selvagem Nkd1 por levedura de dois híbridos de ensaio (Y2H) (Fig. 5A). Nkd1 truncamento no (C)
7-vias (Nkd1
1-286) também reduziu Dvl de ligação (Fig. 5A), indicando que a ligação reduzida de Dvl não foi devido a C-terminais induzida frameshift-única no dois mutantes truncados. Cada proteína truncada Nkd1 mantém perto da sua extremidade C-terminal um 30aa anfipático motivo α-helicoidal que é altamente conservada (28/30 AA) em Nkd2 [14]. Na mosca NKD, um motivo semelhante posicionado 30aa é crítico para a função e localização nuclear [25], mas o papel do motivo 30aa em proteínas NKD vertebrados permanece desconhecida. Supressão do motivo 30aa em Nkd1
1-286 restaurado Dvl de ligação, enquanto ainda a eliminação do motivo EFX eliminado Dvl de ligação (Fig. 5A). Estes dados sugerem que uma função do motivo NKD 30aa vertebrados é se opor Nkd1-EFX /interações DVL, o que em si é aparentemente oposto por outra sequência C-terminal que é eliminado em nossos tumores MSI-CRC.
( a) Y2H entre Nkd1-iscas e DVL-presa ensaiadas para o crescimento sobre abandono triplo (3D + 3AT) ou desistência de mídia duplos (2D). Os gráficos de barras em unidades de show de ONPG direito de ensaio Y2H quantitativa. Western blot indica que as proteínas mutantes são Nkd1 de abundância comparáveis (não mostrado). (B) ensaio de GST-suspenso de
in vitro
traduzido,
35 [S] marcado com Dvl1-3 com cada proteína GST-Nkd1. gráfico de barras é intensidade da banda quantitativa. gel corado com Coomassie mostra cada proteína de fusão-GST, com pontas de setas indicam as proteínas de comprimento completo. (C) Western blot de Flag-IPs de extratos de células HEK-293 com quantidades iguais de cada Nkd1 HA /Flag-marcado, e depois sondadas com α-HA (superior) e α-Dvl3 (meio). β-actina está a carregar o controlo (mais baixo). Note-se que menos Dvl3 é IP’d por Nkd1
C6 ou Nkd1
C8, em comparação com full-length Nkd1. No co-IP foi observada entre o tipo selvagem ou mutante Nkd1s e DVL1 ou Dvl2, que lembra a falta de estabilidade co-IP entre
Drosophila
NKD e Dsh [13].
Nós confirmaram os resultados y2h por GST-suspenso e experiências coimmunoprecipitation. Como mostrado na Fig. 5B, cada proteína Dvl apresentou diminuição da ligação a GST-Nkd1
C6 e GST-Nkd1
C8, em comparação com o tipo selvagem GST-Nkd1, enquanto GST-Nkd1
R288H mostraram redução associações com DVL1 e Dvl2, mas um pouco menos Dvl3, semelhante ao observado por Y2H. Quando expresso em células HEK-293, Nkd1
C6 e Nkd1
C8 acumulada a níveis mais elevados do que Nkd1 e Nkd1
R288H (não mostrado); normalizando lisados de entrada para que quantidades iguais de tipo selvagem Nkd1 e cada proteína Nkd1 mutante foram imunoprecipitadas, observou-se uma redução de duas vezes na quantidade de Dvl3 co-imunoprecipitada por Nkd1
C6 ou Nkd1
C8, em comparação para Nkd1 ou Nkd1
R288H (Fig. 5C). Assim, o
NKD1
mutações reduzir Nkd1 /associações DVL
in vitro
e
in vivo
.
Mutant Nkd1s são defeituosos em alterar os níveis DVL
Dvls pode ser ubiquitinadas e degradadas pelo proteassoma, e a ligação de outras proteínas ou NKD DVL-ligação leva a rotatividade Dvl [17], [26] – [28]. O
NKD1
mutações podem, portanto, comprometer a capacidade de Nkd1 para desestabilizar Dvls. Ao expressar
Drosophila
NKD
GFP em diferentes níveis em células adjacentes da terceira instar
Drosophila
glândula salivar, observou-se de forma consistente uma relação inversa entre os níveis de NKD
GFP e DSH (Fig. 6A-A “). Desde
dsh
transcrição não é conhecido por ser regulado em
Drosophila
, NKD
GFP é provável desestabilizar Dsh, como observado quando Nkd1 foi sobre-expressos em células de mamíferos em cultura [17]. A seguir, co-transf ectadas com o tipo selvagem ou mutante com cada Nkd1 DVL1, Dvl2, ou Dvl3 em células HEK-293 e examinaram os níveis de cada proteína de Dvl por western blot. Como mostrado na Fig. 6B, DVL1 e Dvl2, e em menor grau Dvl3, eram menos abundantes, quando co-expressa com o tipo selvagem Nkd1 do que quando expresso por si só. Nem vazio-vector nem co-expressaram a GFP afectado os níveis de cada Dvl (não mostrado). Em contraste, a quantidade de DVL1 detectável com a co-expressão de cada Nkd1 mutante era semelhante ao do controlo DVL1 somente transfectadas (Fig. 6B). níveis Dvl2 foram parcialmente reduzidas por cada Nkd1 mutante, enquanto os níveis de Dvl3 foram reduzidas a menos de co-expressão de ambos os truncada Nkd1 do que pelo tipo selvagem Nkd1. Semelhante à relação inversa entre NKD
GFP e os níveis de Dsh em
Drosophila
glândula salivar (Fig. 6A-A “), bem pontuada DVL1 imunorreatividade em células com altos níveis de Nkd1
GFP apareceu reduzida em comparação com as células adjacentes, com os níveis mais baixos de Nkd1
GFP (Fig. 6C, C ‘). Tomados em conjunto, os nossos dados suportam a hipótese de que a alteração específica da capacidade da Nkd1 para promover a rotação de Dvl pode activar a sinalização de Wnt /β-catenina durante a progressão tumoral CRC.
(A-A “)
71B-Gal4 /UAS-NKD
GFP
terceiro-instar
Drosophila
glândula salivar corados com α-Dsh e fotografada para GFP (a) e Dsh distribuições (a ‘) (imagem resultante da fusão a “). Quantificação Dsh intensidade pixel (caixa branca em A ‘) de coloração revela reduzida na célula expressando mais (à direita, asterisco verde) NKD
GFP do que na célula adjacente expressar menos NKD
GFP. (B) Western blot de células HEK-293 transfectadas com Flag indicado /marcada com HA e Nkd1 DVL1, Dvl2, ou Dvl3 construções sondados com α-HA, α-Dvl1-3, e α-βtubulin como um controlo de carga. Cada um dos borrões Dvl1-3 foi carregado com quantidades iguais de extrato, como confirmado pela sondagem cada blot com α-βtubulin. (C) HEK-293 células co-expressando Nkd1
GFP e DVL1, corados com α-DVL1, e fotografada para GFP (verde), DVL1 (vermelho) e DNA (azul), mostrando bem pontuada distribuição DVL1 em células que expressam baixo a ausentar Nkd1
GFP (seta branca). Em células adjacentes que expressam Nkd1
GFP, DVL1 é relocalizada para Nkd1
GFP /agregados DVL1 (seta amarela), com perda de bem pontuada DVL1 coloração (setas). (D, E) Todos os modelos de função NKD em
Drosophila
(D) e
NKD1
-mutant CRC (E). linhas duplas: superior = membrana plasmática; inferior = membrana nuclear. (D) Mosca Wg (Wnt) se liga Fz /Seta receptores (LRP5 /6), que inibe o complexo Apc /Axin /CK1 /GSK3β que promove a degradação do braço (β-catenina). complexos de braço com Pan (TCF) para ativar genes-alvo, incluindo
NKD
. NKD promove a rotatividade Dsh para inibir parcialmente sinalização, e emprega o factor de importação nuclear Imp-α3 para entrar no núcleo e mais em inibir a sinalização através de mecanismos desconhecidos [31]. (E) em
NKD1
-mutant CRC, a proteína mutante Nkd1 não se liga mais e promove a rotatividade Dvl, estabilizando β-catenina e ativação da transcrição dependente de TCF de genes alvo.
discussão
a mutação do supressor tumoral
APC
eleva a sinalização de Wnt /β-catenina na maioria dos 1 milhão de novos casos de CRC diagnosticados anualmente em todo o mundo [3], [29 ]. Nossa hipótese é que mutações em outros antagonistas Wnt pode elevar a sinalização no subgrupo de CRC, particularmente MSI-CRC, sem mutações nos reguladores Wnt conhecidos. Relatamos três humano associado a um cancro
NKD1
mutações que alteram a sinalização Wnt /β-catenina e perturbar a ligação Nkd1 /Dvl. Com base na frequência de
NKD1
mutação (5%) identificados em nossa coorte de MSI-CRCs, estimamos que
NKD1
mutações ocorrem em até ~ 1% do CRC recém-diagnosticados, ou ~10,000 casos por ano.
Desde tumores MSI são propensas a mutação ao longo do genoma, surge a questão de saber se o
NKD1
mutações conduzir a progressão do tumor ou são meramente mutações “espectador”. Um workshop National Cancer Institute [30] propôs cinco critérios para distinguir genes alvo de boa-fé de mutações espectador, incluindo a) alta frequência de mutação, b) inativação bialélico, c) um papel em uma via de crescimento supressor, d) inativação do mesmo via de supressão de crescimento de tumores sem MSI através de mutação no mesmo gene ou em outro gene no mesmo percurso, e e) estudos funcionais supressores, embora a validade destes critérios para avaliar mutações condutoras raros ou novos tem sido questionada {eg [6]}. Nosso trabalho sugere que o
NKD1
mutações cumprir quatro dos cinco critérios – a, c, d, e e. Embora a frequência de
NKD1
mutação foi relativamente baixa comparada com a de genes via Wnt conhecidos, a exclusividade mútua entre mutações no
NKD1
e outros genes via Wnt foi estatisticamente significativa em amostras de tumor. A ausência de
NKD1
mutações em nossa amostra de tumores sem MSI poderia ser devido à natureza rara de truncagem Nkd1 específicos em tumores com MMR intacto, ou devido ao nosso pequeno tamanho da amostra. No entanto, outros genes na via de sinalização Wnt, tais como
APC Quais são frequentemente mutado, excluído ou metilados em tumores com MMR intacta. inactivação bialélico de
NKD1
não foi observada, mas a presença do tipo selvagem Nkd1 em linhas de células de tumor, bem como a capacidade de Nkd1 mutante para estabilizar β-catenina, sugere que o
NKD1
mutações pode agir dominante (ver abaixo). Finalmente, a família NKD de proteínas inibe a sinalização Wnt canônica, e esta atividade é defeituoso em todas as três proteínas Nkd1 mutantes, sugerindo que as mutações Nkd1 alterar sinalização de Wnt /β-catenina
in vivo
.
Demonstramos ainda que NKD pode limitar Dsh /abundância Dvl tanto na cultura de células de mamíferos e sistemas de mosca, com mosca NKD tendo adicionalmente funções nucleares desconhecidos mas essenciais, [25], [31] (Fig. 6D). Propomos que as proteínas Nkd1 humanos mutantes, cada um com uma capacidade reduzida de se ligar e limitar a abundância de Dvls, aumentar a actividade de Dvl Wnt-dependente, atenuando assim a degradação β-catenina e aumentando a transcrição dependente de TCF de genes alvo que promovem a proliferação (Fig . 6E). No entanto, a prevenção Nkd1 /associação Dvl directa é aparentemente insuficiente para promover a neoplasia, como a eliminação da DVL-vinculativo
Nkd1
motivo EFX nem ratos mutantes prestados suscetíveis ao câncer nem potenciado a frequência de
Apc
adenomas intestinais orientada por mutação [32]. Da mesma forma, ratos portadores truncando N-terminal
Nkd1
/ou
Nkd2
mutações não desenvolveram tumores e espontâneas [33]. Desde NKD é parte integrante de loops de feedback em moscas e vertebrados [12], [34], que anteriormente a hipótese de que em mamíferos falta de atividade NKD pode ser compensada por mecanismos de feedback redundantes, enquanto que em moscas sem essa compensação é possível, dada a ausência de os genes que codificam os antagonistas de sinalização Wnt extracelulares [33].
o emparelhamento não-aleatória de diferente
APC
mutações em tumores {por exemplo, da proteína truncada perto da região do cluster mutação (MCR), com exclusão alélica ou metilação}, acoplados com estudos funcionais de proteínas Apc mutantes [35], [36], foi sugerido que a célula tem de conservar uma certa capacidade para regular a sinalização de Wnt /β-catenina durante a progressão do tumor – a assim chamada “apenas para a direita” hipótese [ ,,,0],37]. Uma consideração dos papéis conhecidos para a sinalização de Wnt /β-catenina durante a progressão do carcinoma colorrectal proporciona alguma razão para esta hipótese: em fases iniciais, o aumento da sinalização promove tronco renovação celular e altera a migração de células epiteliais de cripta [38], enquanto que mais tarde age como um interruptor para regular epitelial mesenquimais transições durante a invasão e metástase [39]. Assim, a progressão do tumor transiente pode exigir para cima ou para baixo-regulação da expressão do gene alvo, dependendo da carga mutacional e condições ambientais locais. Dado que a proteína Nkd1 do tipo selvagem persiste em
NKD1
linhas celulares -mutant testados, Nossa hipótese é que as proteínas mutantes Nkd1 – cada um dos quais mantém vários motivos funcionais (miristoila�o N-terminal, EFX, e motivos 30 aa ) – ativar sinalização Wnt
in vivo
, talvez análoga à maneira pela qual as proteínas Apc truncado perto do MCR ativar sinalização Wnt [36]
Apesar da esmagadora evidência de que anormal Wnt /β-. sinalização catenin causa câncer, o papel das proteínas Dsh /DVL em neoplasia permanece obscura. sinalização Wnt pode promover Dsh acumulação /Dvl [40], e Dvl sobreexpressão pode imitar a activação do eixo de sinalização /β-catenina Wnt [41], sugerindo que Dvl hiperactividade, como estabilização β-catenina devido a mutação, poderia ser uma causa primária da sinalização Wnt elevada no câncer. Com efeito, a amplificação e a sobre-expressão de Dvl foi identificado na neoplasia {e.g. câncer de pulmão [42]}, mas a acumulação Dvl no câncer também poderia ser uma consequência secundária de sem oposição Wnt autoactiva�o impulsionado pelo ligando de sinalização [43]. Dados os papéis cruciais para Dsh /Dvls em vias de Wnt “não-canônicos” que governam planar de células-polaridade e migração celular em vertebrados [44], a
NKD1
mutações também pode alterar a atividade Dvl em não-canônica vias de Wnt que controlam a polaridade celular ou migração durante a progressão do cancro. experiências futuras incidirão na compreensão de como as proteínas mutantes Nkd1 alterar a sinalização de Wnt durante a progressão do cancro
in vivo
.
declaração Materiais e Métodos
Ética
Este estudo foi realizado de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. O estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board dos hospitais da Mayo Clinic. Todos os pacientes fornecidos consentimento informado por escrito para a recolha de amostras e análise posterior. criação de rã, a fertilização in vitro, e cultura de embriões e estadiamento foram realizados de acordo com protocolos padrão e todos os animais foram tratados em estrita conformidade com as boas práticas de animais, tal como definido pela Associação Americana de Ciência Animal Laboratory, e
Xenopus
Na Fig.