Abstract
tumor vasculatura age como um cabo de segurança essenciais para a progressão do tumor e facilita a propagação metastática. vascular Novel segmentação estratégias destinadas a sustentar o desligamento vascular poderiam induzir danos substanciais, resultando em um atraso do crescimento tumoral significativa. Investigou-se a combinação de dois novos agentes vasculares segmentação complementares com a terapia de radiação em uma estratégia com o objectivo de sustentar ruptura vascular. As experiências foram realizadas com o ligando 4 semelhante a delta (DLL4) bloqueio (deregulator angiogénese) tratamento administrado em combinação com um tratamento de destruição vascular à base de radiação numa linha de tumor altamente agressivo bem perfundida cancro do cólon implantadas em ratinhos nus atímicos fêmeas. Os tumores foram tratados com permutações de radiação, microbolhas estimulada por ultra-som (USMB) e anticorpo monoclonal Dll4 (mAb). resposta vascular do tumor foi avaliada com três dimensões ultra-som de potência Doppler para medir o fluxo ativo e imuno-histoquímica. A resposta tumoral foi avaliada com ensaios histoquímicos e medições longitudinais de volume de tumor. Os nossos resultados sugerem uma resposta significativa do tumor em animais tratados com USMB combinada com radiação, e Dll4 mAb, que conduz a um atraso do crescimento do tumor sinérgica de até 24 dias. Isto está provavelmente ligado à morte celular rápida dentro do tumor e um desligamento vascular tumoral sustentada. Conclui-se que os tratamentos de combinação tripla causar um desligamento vascular seguido de uma inibição da angiogénese sustentada e a morte de células tumorais, conduzindo a uma rápida do tumor com base em vascular “colapso” e um retardamento do crescimento tumoral significativa
citação: El. Kaffas a, Nofiele J, Giles a, Cho S, Liu SK, Czarnota GJ (2014) DLL4-Notch Sinalização Blockade synergizes Combinada Ultrasound-Stimulated microbolhas e radioterapia em Colon Cancer Humano xenoenxertos. PLoS ONE 9 (4): e93888. doi: 10.1371 /journal.pone.0093888
editor: Ramani Ramchandran, Medical College of Wisconsin, Estados Unidos da América
Recebido: 07 de agosto de 2013; Aceito: 10 de março de 2014; Publicação: 15 de abril de 2014
Direitos de autor: © 2014 El Kaffas et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Fox Foundation Terry através de uma subvenção programa projeto “o ultra-som para Cancer Therapy”. Dr. Gregory Czarnota é um clínico-cientista e é apoiado por uma cadeira da pesquisa CCO em Experimental Therapeutics and Imaging. Dr. Stanley Liu é um clínico-cientista e é apoiado por uma OICR (Ontario Institute of Cancer Research) Investigator Award fase inicial e reconhece o apoio do PCC (Prostate Cancer Canadá). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Canção Cho é empregado por MedImmune. Isto não altera a adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.
Introdução
Os tumores requer ativação de um ‘switch’ angiogênico para crescer além de 1-2 mm
3 em volume. o desenvolvimento vascular em tumores ocorre através da libertação de vários factores de crescimento e reguladores da angiogénese endotelial (isto é vasculares factor de crescimento endotelial (VEGF), derivado de plaquetas do factor de crescimento (PDGF), ligando semelhante a delta 4 (Dll4)), levando ao neo-vascularização predominantemente através de um processo de germinação reminiscente do desenvolvimento embrionário [1] – [3]. vasos recém-formados fornecer uma tábua de salvação de nutrientes e oxigênio para permitir a continuação do crescimento do tumor. Os medicamentos anti-angiogénicos, originalmente concebidos para bloquear o desenvolvimento da vasculatura do tumor, tornaram-se terapias de câncer importantes. Por algum tempo, os agentes anti-VEGF farmacológicos ganhou terreno importante na segmentação angiogênese, mas foram encontrados para ser menos eficaz do que o inicialmente previsto devido a mecanismos de resistência do tumor [4], [5]. No entanto, estes agentes mostraram-se úteis quando estrategicamente combinadas com outras terapias anti-cancerosas [6]. Atualmente, agentes farmacológicos dirigidos a diferentes aspectos da angiogênese do tumor estão sendo desenvolvidos e investigados em conjunto com várias modalidades terapêuticas existentes.
Uma variedade de fatores fisiológicos e biológicos estimular tumor desenvolvimento vascular (isto é, hipóxia). Estes estímulos externos actuar como filas para angiogénico (VEGF ou seja, Dll4) sinalização molecular. A via de Notch foi demonstrada para regular o surgimento de novos vasos em tumores [7], [8]. O ligando Notch Dll4 foi encontrada para fornecer sinalização reguladora a jusante crítico para o início estímulos VEGF [9], [10]. Esta via tem sido identificada como um alvo promissor novo tratamento do cancro [9]. Estudos têm demonstrado que a inibição da sinalização Dll4 resultado em angiogese excessiva, mas não funcional no tecido tumoral [11], [12]. Além disso, o bloqueio Dll4 provoca um atraso significativo do crescimento do tumor em várias linhas celulares de tumores [11], [12]. Os estudos também demonstraram o potencial de bloqueio Dll4 em combinação com outras terapias do cancro [8], [11] – [15]. Um estudo recente aumento sinergético observado de atraso do crescimento do tumor, quando um anticorpo monoclonal neutralizante Dll4 (mAb) foi combinada com a terapia de radiação [15].
A par dos numerosos agentes farmacológicos que têm sido desenvolvidos para alvejar a angiogénese, vascular biofísico emergentes agentes, incluindo microbolhas estimulada por ultra-som e as nanopartículas de ouro segmentação, também foram demonstradas para aumentar a eficácia do tratamento do cancro convencional [16] – [19]. Estes têm sido sugeridos para causar um rápido início de desligamento vascular do tumor e /ou aumento da permeabilidade da parede do vaso, para melhorar a qualidade estrategicamente a eficácia de medicamentos contra o cancro ou terapia de radiação. . Mais recentemente, Czarnota
et al
[19] – [23] demonstraram que microbolhas estimulada por ultra-som (USMB) aumenta a morte de células tumorais na próstata, bexiga e de células do cancro da mama linhas. Eles postulou que o aumento da resposta de radiação foi ligado ao dano da membrana biofísica das células endoteliais de tumores associados com a estimulação da microbolha, subsequentemente levando a sinalização de ceramida e um desligamento vascular endotelial devido à morte de células [22]. As observações são potencialmente ligado ao relatado recentemente,
asmase
dependente, a apoptose endotelial aguda após grandes doses únicas de radiação [2], [24], [25].
Neste trabalho, nós investigamos DLL4-bloqueio seguinte combinado ultra-som de microbolhas e destruição vascular à base de radiação em uma linha do cancro do cólon altamente agressivo e bem perfundido. Os tumores foram crescidos na pata traseira de ratos e tratadas com permutações de radiação, e o anticorpo monoclonal USMB Dll4 (mAb). Os animais foram fotografada usando tridimensional de ultra-som de potência Doppler para investigar alterações de perfusão do tumor (fluxo do sangue) com o tratamento.
tridimensional de ultra-som de potência Doppler de alta frequência é uma modalidade de imagem ideal para a avaliação pré-clínica de vasculatura tumoral em modelos animais [26] – [28]. Ela produz de alta resolução informações estruturais e de detecção de sinal de fluxo Doppler reforçada. Além disso, o seu uso fácil o torna adequado para estudos longitudinais, em que as alterações relativas na vasculatura pode ser avaliado. Doppler foram complementadas com densidades vasculares determinadas a partir de CD31 coloração dos tumores secções transversais. A resposta tumoral para Dll4 mAb, ultra-sons de microbolhas e terapia de combinação de radiação também foi avaliada com as medições de ensaios de imuno-histoquímica e de crescimento do tumor.
Os resultados indicam que o bloqueio Dll4 seguido por radiação USMB e produz um atraso no crescimento do tumor superior a sinérgica quando a radiação é combinado com Dll4 mAc sozinho. Estes resultados também sugerem que USMB e ato de radiação para fechar de forma aguda para baixo a vasculatura do tumor, assim como em outros tipos de tumores, mas que, devido à natureza agressiva da linha celular de cancro do cólon, uma recuperação rápida do tumor segue. O tratamento com Dll4 mAb, em seguida, desregula neo-vascularização, levando a vasculatura do tumor minimamente funcional e um tumor vascular ‘colapso’ sustentada. Assim, a combinação de bloqueio Dll4 com USMB e radiação é um romance, abordagem altamente eficaz para retardar o crescimento do tumor por meio da segmentação biológica e biofísica da vasculatura do tumor.
Materiais e Métodos
Xenoenxerto de Tumor Modelo
Todos os experimentos com animais apresentados neste trabalho foram realizados em conformidade com as diretrizes reconhecidas internacionalmente especificados nos protocolos aprovados pelo comitê de cuidados com os animais institucional e utilização Research Institute Sunnybrook. Todos os procedimentos com animais foram realizadas sob anestesia, como descrito abaixo, e todos os esforços feitos para minimizar o sofrimento. Para este estudo, até 90 animais foram divididos aleatoriamente em 3 grupos. Os animais do grupo 1 foram sacrificados às 24 horas, os animais no grupo 2 foram sacrificados aos 7 dias e os animais no grupo 3 foram mantidos para avaliação do crescimento do tumor até 30 dias. De modo a iniciar o crescimento do tumor, LS174T (3 × 10
6) as células cancerosas do cólon (ATCC, Manassas, VA) foram injectados por via subcutânea na pata traseira direita de ratinhos nus atímicos fêmea de 6 a 7 semanas de idade (Harlan, Indianapolis, IN). Todos os tumores cresceram de 9-14 dias para chegar a um volume médio de 200 mm
3. Uma média de 5 animais foram usados por condição de tratamento para cada um dos métodos de avaliação de tratamento (ou seja, Doppler, atraso de crescimento, imuno-histoquímica).
Administração Tratamento
animais tumor de rolamento foi dada uma das seis tratamentos: (1) nenhum tratamento (CTRL), (2) radiação (XRT), (3) Dll4 mAb, (4) XRT e Dll4 mAb, (5) microbolhas estimulada por ultra-som (USMB) combinado com XRT, ou ( 6) uma combinação tripla de USMB, XRT e Dll4 mAb. Os animais foram anestesiados com isofluorano antes de imagem ou para a inserção do cateter (ao receber tratamento USMB). Todos os animais que receberam radioterapia foram tratados com uma dose única de 5 a radiação ionizante Gy administrados usando um armário irradiador Faxitron (Faxitron bióticas, Lincolnshire, IL), usando raios-X a uma energia de 160 kVp, um SSD de 35 cm, e uma taxa de dose de 200 cGy /min. Para o tratamento de radiação, o corpo de cada animal foi coberto com protecção de chumbo 3 mm de espessura, expondo apenas o tumor. Os animais que receberam o anticorpo monoclonal Dll4 (mAb; MedImmune LLC, MD) foram administradas duas vezes por semana o mAb, começando no dia seguinte o tratamento de imagem, a uma dose de 5 mg /kg de peso corporal. Os animais que receberam radiação em conjunto com o Acm Dll4, recebeu o inicial anti-Dll4 tratamento com mAb 1 hora após a irradiação. tratamento Dll4 mAb foi continuado nos animais até ao sacrifício (em 24 horas ou 7 dias), ou até que um volume do tumor atingiu pelo menos o dobro do volume original. Um esquema do cronograma de entrega de tratamento e de imagem é apresentada na figura S1A.
Para os animais tratados com USMB, microbolhas Definity (shell de gás /lipossoma perf, Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA) foram preparadas usando um dispositivo Vialmix (Lantheus Medical imaging) e administrado através de um catéter na veia da cauda a uma concentração em volume de 3% v /v (1,08 × 10
9 microbolhas em 90 uL), que é aproximadamente 300 vezes a dose de imagiologia de diagnóstico recomendada de 10 UL /kg [19]. Os animais foram depois imersas num banho de água a 37 ° C, a fim de ser exposta a ultra-sons. O sistema de tratamento é concebido de tal maneira que apenas a parte inferior do corpo do animal é imerso no banho de água, expondo apenas o volume do tumor para o campo de ultra-som no foco do transdutor. O sistema de terapia de ultra-som envolveu um sistema de micro-posicionamento, gerador de forma de onda (AWG520, Tektronix, Beaverton, OR), amplificador de potência com pulsador /receptor (RPR4000, Ritec, Rochester, NY), e um sistema de aquisição digital (CC103, Agilent, Monroe , Nova Iorque). Os tumores foram expostos no interior da metade de pico máximo do sinal acústico (-6 largura do feixe dB no ponto focal de 3,1 cm, e focado em 8,5 cm) usando um tom de 16 ciclos de rebentar a frequência central de 500 kHz com um ultra-som elemento diâmetro 2,86 centímetros transdutor (ILO509HP, Valpey Fisher Inc., Hopkinton, MA). A 3 kHz frequência de repetição de impulsos ao longo de 50 ms foi usada para sonificação, juntamente com um pico de pressão negativa definida para 570 kPa, o que corresponde a um índice mecânico (MI) de 0,8. O tempo total de sonificação foi ~ 5 ms dentro de cada janela de 50 ms. Um período de 1950 ms intermitente entre janelas sonificação foi empregada para minimizar o aquecimento biológica no tecido durante exposições de ultra-som. O tempo total insonification do tumor foi de 750 ms com mais de 5 minutos para um ciclo de trabalho global de 0,25% [19]. Esta sequência de impulsos particular, tem sido demonstrado ter efeitos positivos radiosuscetível, enquanto permite que os vasos sanguíneos se encher com bolhas de 150 vezes durante o tratamento. Os tumores foram irradiados com uma dose de 5 Gy de radiação ionizante imediatamente após o tratamento USMB.
de alta frequência do ultrassom de potência Doppler Imaging
Todos os animais foram fotografadas com tridimensional de ultra-som de alta frequência imediatamente antes do tratamento e 24 horas após o tratamento. Os dados foram adquiridos utilizando uma alta freqüência ultra-som dispositivo de geração de imagens Vevo 770 (Visualsonics, Toronto, ON) com um transdutor de 30 MHz frequência central (RMV-707:55 mm resolução axial, 115 mm resolução lateral, distância focal de 12,7 mm). A fase de varredura motorizado (Visualsonics, Toronto, ON) foi usado para adquirir imagens 3D de modo B e dados de fluxo de potência Doppler, em um tamanho de passo de 0,2 mm. Dados Doppler foi coletado com as seguintes configurações: a desordem-filtro de corte de 1-2 mm /s, uma velocidade de digitalização de 1 mm /s, uma frequência de repetição de pulso de 5 KHz, um ganho de potência Doppler de 20 dB e uma taxa de quadros menor do que 10 fps. análise de imagem Doppler foi realizado utilizando software in-house desenvolvido em MATLAB (MathWorks, Natick, MA). O índice de vascularização (VI) foi calculado a partir de imagens poder por Doppler a obtenção do volume de todos os objectos coloridos (pixels coloridos) sobre o volume das ROIs seleccionado. Um índice de vascularização relativa foi usado para avaliar a resposta vascular global à terapêutica, calculado da seguinte forma: ((VI
24 Horas /VI
0 Horas) × 100) -100) ou ((VI
7 Dias /VI
0 horas) × 100) -100).
Análise histológica
Os ratos foram sacrificados 24 horas, e em outra coorte, aos 7 dias após o tratamento para histologia e imuno-histoquímica. secções transversais de xenotransplantes tumorais foram coradas com hematoxilina eosina (H E) para avaliar a necrose após a terapia. Tumor de xenoenxerto de secções transversais também foram coradas para quebras de ADN utilizando
In situ
marcação terminal (ISEL) mancha como um marcador de morte celular, e aglomerado de diferenciação (CD31) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) para avaliar a densidade vascular. A morte celular foi avaliada quantitativamente para cada um dos tumores secções transversais ISEL-coradas. Isto foi realizado utilizando-out costume MATLAB (The MathWorks, Natick, MA), de rotina, que permite ao utilizador calcular o número de pixels castanhos (ISEL-coradas) sobre o número total de pixels por secção transversal tumoral inteira. A densidade vascular, também foi calculado a partir de imagens de CD31 secções transversais de tumor coradas. Para cada secção cruzada, 4 campos de visão (FOV) foram analisadas num ampliação da lente objectiva de 10X para calcular a densidade da vasculatura. Isto foi realizado utilizando MATLAB (The MathWorks, Natick, MA) para distinguir as regiões coradas castanhos (CD31 coloração das células endoteliais no tumor) a partir do mancha de fundo (outras células).
avaliação do crescimento do tumor
o crescimento tumoral foi avaliada em uma média de 5 animais por condição de tratamento. o volume do tumor foi determinado por medições pinça realizada a cada 2-4 dias e calculada usando a fórmula modificada elipsoidal (volume = comprimento x largura
2/2). os volumes de tumor foram normalizados para o seu volume inicial e atraso do crescimento do tumor foi calculada subtraindo o número médio de dias para os grupos de tratamento para atingir duas vezes o seu volume de partida do que a do grupo de controlo.
Análise estatística
quantificados relativos VI, ISEL e CD31 coloração e crescimento do tumor atrasos, foram avaliadas para significância estatística usando um teste de Mann-Whitney (bicaudal, assumindo variâncias desiguais; α = 0,05). Cada condição de tratamento foi comparada directamente com a condição de controle 0 Gy. Além disso, os valores de p de testes estatísticos de diferentes permutações foram resumidos nas Tabelas S1 a S7 nos dados complementares. Os testes estatísticos foram realizados utilizando Prism (GraphPad Software versão 5, La Jolla, CA).
Resultados
Realizamos experimentos para avaliar a eficácia do vascular segmentação estratégias onde USMB, radiação e anti-DLL4 tratamentos foram combinados para interromper a vasculatura do tumor e manter os efeitos vasculares de modo a maximizar a resposta global do tumor (Figura S1B). A resposta tumoral foi avaliada com vasculatura tridimensional de alta frequência do ultra-som Doppler às 24 horas e 7 dias após o tratamento, em relação à linha de base. A Figura 1A mostra imagens representativas de dados tridimensionais poder Doppler às 24 horas após o tratamento para o controlo (1), Dll4 mAb (3), USMB + XRT (5) e USMB + + XRT Dll4 mAb (6) condições de tratamento. A diminuição do sinal de fluxo foi evidente em tumores tratados com a combinação tripla (6). resultados poder Doppler quantificados a 24 horas e 7 dias após o tratamento são apresentados para todas as condições de tratamento na Figura 1B e 1C. As mudanças mínimas na VI foram observadas para os animais de controlo (1) em ambas as vezes. Observou-se um aumento não significativo no sinal de energia de Doppler relacionada com o fluxo de sangue às 24 horas, e 7 dias seguintes XRT (2). Os animais que receberam mAb Dll4 (3) sozinho foram observados para ter uma diminuição do sinal de fluxo (VI) 24 horas após o tratamento (P 0,05). Além disso, o tratamento com mAb Dll4 sozinho (3) causou a VI a cair mais 7 dias após o tratamento (P 0,05). Os tratamentos com USMB + XRT (5) também provocou uma rápida (dentro de 24 horas) e significante (p 0,05) diminuição do sinal de Doppler. No entanto, as diferenças de volume do fluxo sanguíneo por Doppler de energia retornou aos níveis basais por 7 dias, indicando uma ruptura com base em microbolhas temporária, de curta duração vascular. Observou-se uma diminuição VI rápida de quase 60% para os tratamentos com XRT e Dll4 mAb (4), bem como as condições de combinação tripla (6) (p 0,05). No entanto, a queda VI persistiu a 7 dias apenas em animais que receberam a combinação tripla (6) ou aqueles que receberam tratamentos Dll4 sozinho (3) (p 0,05). Em contraste, um aumento de ~ 25% do VI para XRT + Dll4 mAb (4) animais tratados indica um potencial de reperfusão do tumor.
A) Imagens representativas de tridimensional projecção máxima intensidade de Doppler sinal às 24 horas pós-tratamento, e Doppler de energia quantificada em B) 24 horas e C) 7 dias, são mostrados. Os animais que receberam mAb Dll4 sozinho teve uma diminuição do sinal de fluxo (VI) 24 horas após a entrega de tratamento; o VI caiu mais de 7 dias após a terapia. USMB + XRT causou uma rápida diminuição do sinal de potência Doppler. No entanto, o volume de sangue ativa retornaram aos níveis basais por 7 dias. Um VI rápida diminuição de quase 60% foi observado por XRT e Dll4 mAb, bem como condições de combinação tripla. No entanto, a queda VI persistiu a 7 dias apenas em animais que receberam o tratamento de estado triplo. Cada condição experimental representa a média de 5 animais. As barras de erro representam um erro padrão da média. Alterações estatisticamente significantes estão marcados com * (p≤0,05). A barra de escala representa 2 mm
Figuras 2A, S2A e representativo de exibição S2B H . E e ISEL tumorais coradas secções transversais para cada um dos tratamentos. Os dados demonstram a morte celular às 24 horas no XRT combinadas e Dll4 mAb (4) de tratamento, bem como a combinação tripla (6) a condição do tratamento. regiões de morte celular em tumores persistiu em 7 dias após o tratamento em ambas as condições. áreas de morte celular quantificada a partir ISEL tumor coradas secções transversais são apresentadas nas Figuras 2A e 2B. Significativo (p 0,05) a morte celular foi observado em tumores tratados com USMB + XRT + Dll4 mAb (6), enquanto que um aumento não significativo na morte celular foi observada em animais tratados com radiação combinada com Dll4 mAb (3). Aos 7 dias após o tratamento inicial, observou-se significativa (p 0,05) quantidades de morte celular, tanto no XRT + mAb Dll4 (4) e o USMB + + XRT Dll4 mAb (6) condições de tratamento. Além disso, o tumor original H E morfologia, que consiste de múltiplas regiões necróticas e células vermelhas do sangue vazados, foi observada em tumores que receberam a combinação tripla no momento do ponto final (10-30 dias pós-terapia) sacrifício (Figura S3).
A) Representante 24 horas H e tumorais coradas secções transversais em condições de tratamento especificadas a baixa ampliação. A linha inferior é de imagens de alta ampliação do representante H E tumorais coradas secções transversais para os tratamentos especificados. A barra de escala linha superior representa 2 mm e a barra de escala linha de baixo representa 50 um. Quantificada ISEL total de coloração B) 24 horas e C) 7 dias. Morte celular significativa (p £ 0,05) foi observado em tumores tratados com USMB + + XRT Dll4 mAb, enquanto uma quantidade não significativa de morte celular é observada para os animais tratados com XRT e Dll4 mAb. Aos 7 dias após o tratamento inicial, observamos uma quantidade significativa (p≤0,05) de morte celular, tanto no Dll4 mAb e USMB + XRT + Dll4 mAb condições de tratamento XRT combinado +. A significância estatística é indicado com * para p≤0.05.
Power Doppler e morte celular resultados foram complementados com resultados de coloração CD31. Representante imunohistoquímica CD31 está mostrado na figura 3A e S2C. Por 24 horas após a terapia (Figura 3B), observou-se um não-significativa, mas quase duplicação da coloração CD31 nos animais tratados com Dll4 mAb (3) somente. Entretanto, observou-se um decréscimo significativo na coloração de CD31 em animais tratados com USMB + XRT (5), bem como aqueles tratados com as condições de tratamento triplo (p 0,05). Por 7 dias após o tratamento (Figura 3C), observou-se um aumento significativo na coloração de CD31 para todos os animais que receberam tratamento Dll4 mAb, quer sozinho (3) ou em combinação com USMB e /ou XRT (4 e 6). Observamos, também, que os animais tratados apenas com XRT (2), ou em combinação com USMB (5), tinham níveis de coloração CD31 semelhantes aos animais de controlo.
A) Imagens representativas de CD31 coloração de secções transversais de tumores. As imagens são de quatro das condições de tratamento obtidos às 24 horas e 7 dias após a terapia. A barra de escala representa 100 m. B) Normalizado CD31 coloração por ROI às 24 horas e C) a 7 dias após o início do tratamento. Notamos uma duplicação não significativa, mas perto de coloração CD31 nos animais tratados apenas com Dll4 mAb. Houve um decréscimo significativo na coloração de CD31 em animais tratados com USMB + XRT, bem como aqueles tratados com as condições de tratamento triplo. Por 7 dias após o tratamento, houve um aumento significativo em vasos CD31 coradas para todos os animais que receberam tratamento Dll4 mAb, por si só ou em combinação com USMB e /ou XRT. Os animais tratados com XRT sozinho, ou em combinação com USMB, havia quantificado contagens CD31 coradas semelhantes aos animais de controlo. significância estatística é indicado com * indicando uma p £ 0,05.
A Figura 4A mostra a curva de crescimento do tumor normalizada para cada uma das condições de tratamento. Considerando que os animais de controlo (1) dobrado em volume, em menos de 5 dias após o início do tratamento, observou-se um atraso do crescimento do tumor em todas as outras condições de tratamento. As curvas de crescimento apresentaram tendências semelhantes, para o crescimento de tumores tratados apenas com XRT (2), mAb Dll4 sozinho (3), e o tratamento USMB + XRT (5). Os tumores tratados com XRT e continuou a terapia Dll4 mAb (4) demonstrou um atraso significativo do crescimento do tumor e sinérgico (ver Figura 4B) de 14 dias (P 0,05). tratamentos de combinação tripla (6) causaram o maior retardamento do crescimento tumoral, com uma ligeira diminuição no tamanho do tumor evidente aos 5 dias após o início do tratamento, seguido de uma interrupção do crescimento com duração de cerca de 15 dias. Observou-se um atraso médio crescimento do tumor de 24 dias (p 0,05). para o tratamento de combinação tripla
) curvas de crescimento do tumor normalizados
A. Um crescimento de tumor retardado em todas as condições de tratamento foram anotadas. curvas de crescimento do tumor seguido tendências similares para o XRT sozinho, o mAb Dll4 sozinho, e os tratamentos USMB + XRT. Combinado USMB + + XRT Dll4 mAb foi observado para induzir a resposta maior, com uma diminuição no tamanho do tumor em 5 dias após o tratamento, seguido de inibição do crescimento com duração de aproximadamente 15 dias. B) quantificaram atraso do crescimento do tumor para chegar a duas vezes o volume de partida. Os tratamentos com XRT e continuou mAb Dll4 experimentou um atraso do crescimento do tumor sinérgico significativo de 14 dias. Enquanto isso, o tratamento de combinação tripla (USMB + XRT + Dll4 mAb) causou um atraso do crescimento tumoral de 24 dias. diferenças estatisticamente significativas em atraso do crescimento tumoral são indicados com * para p≤0.05.
Discussão
Neste estudo, partimos para investigar a eficácia da combinação estrategicamente a biofísica, a radiação tratamento baseado, vascular interromper seguido por um agente farmacológico-desregulamentação angiogênese. foi postulado que este seria otimizar a resposta ao tratamento. A fim de maximizar a destruição vascular, terapia de microbolhas estimulada por ultra-sons foi utilizado para as células endoteliais do tumor primeiro radiossensibilizar, seguido por uma única dose de radiação ionizante (XRT) para induzir efeitos vasculares rápidas. Dll4 mAb foi subsequentemente administrado como uma terapia “manutenção”. Uma ilustração de postulou combinada USMB, XRT e efeitos Dll4 mAb sobre as células endoteliais do tumor são apresentadas na Figura 5. Diferentes permutações das três modalidades de tratamento combinados também foram investigados. Os resultados sugerem uma resposta sinérgica do crescimento do tumor em animais tratados 1.4X com uma sessão de terapia de combinação tripla (6), em que um atraso de crescimento de tumor ~ 24 dias foi obtido (Figura 4). Isto está provavelmente ligado a um desligamento vascular tumoral sustentada induzir a morte de células no interior do tumor. Anti-Dll4 tratamento com mAb, em seguida, actua de modo a manter o desligamento vascular. Em comparação, a combinação de radiação e Dll4 mAb (4) causou um atraso significativo do crescimento de ~ 14 dias. Nenhum outro significância foi observado em ensaios de atraso de crescimento. Os tumores que receberam radiação sozinho experimentaram o atraso do crescimento tumoral menos (~ 3 dias), provavelmente ligado a danos no DNA radiobiológica não vascular convencional.
Nós postular que o pré-tratamento de tumores com microbolhas activado por ultra-som pode primeira radiossensibilizar as células através de um processo biofísico. Após a aplicação de radiação, as células endoteliais sofrem apoptose em primeiro lugar, levando à morte das células tumorais. fornecimento contínuo de um deregulator angiogénese tumoral impediria reperfusão, que serve como uma terapia de manutenção.
A diminuição do tamanho do tumor foi observada dentro de 5 dias após o tratamento de combinação tripla (6), o que demonstra uma resposta aguda e sugerindo uma rápida do tumor com base em vascular “colapso”. Observou-se um VI diminuir a potência de Doppler de mais do que 50% em 24 horas em ambos XRT + Dll4 mAb (4) e tratamentos de combinação tripla (6), em comparação com sozinho radiação (2), em que não foi observada nenhuma diminuição na VI ( Figura 1). A diminuição VI só foi sustentada 7 dias nos tratamentos de combinação tripla. recessão do volume do tumor é provavelmente associado com grande desligamento vascular, que conduz à rápida formação de regiões necróticas no núcleo do tumor. Postulamos que as células mortas são rapidamente desintegrados e aclarado em tumores tratados com a terapia de combinação tripla, o que explicaria a extensa coloração menos ISEL quantificada para os tratamentos de combinação tripla (Figura 2), e a redução do tamanho do tumor. Observamos, também, uma quantidade significativa de morte celular 24 horas após esta terapia de combinação tripla (6), enquanto que nenhuma outra significação foi encontrado em outras condições de tratamento (Figura 2). Aqui, ISEL quantificadas as áreas de morte celular por corte transversal do tumor persistiu a longo prazo (mais de 24 horas) e atingiu cerca de uma média de 30% da secção transversal do tumor por 7 dias seguintes da terapia. A radiação combinada com Dll4 mAb (4) também causou morte celular significativa 7 dias após a terapêutica, no entanto, os volumes dos tumores nesta condição foram anotados para ser maior do que o tumor tratado com a terapia de combinação tripla. H E imagens coradas indicado um microambiente tumoral heterogénea e necrótica persistindo após 30 dias de terapia (Figura S3). Estes resultados demonstram claramente a potência da combinação USMB, radiação e Dll4 mAb (6) acima e para além de qualquer terapia sozinha.
para os animais tratados com o mAb Dll4 XRT + (4) ou USMB + + XRT Dll4 mAb (6 ), uma diminuição rápida e significativa no índice vascular foi observado por 24 horas depois da terapia (Figura 1). No entanto, postulamos que o desligamento vascular, resultando em alguns destes tratamentos é de natureza diversas. Em USMB + + XRT Dll4 mAb (6) animais tratados, as células endoteliais sofrem apoptose provavelmente rápida associada com uma perturbação da membrana devido a efeitos mecânicos de microbolhas, e que resulta na produção de ceramida [29], [30]. Retorno de vasos funcionais em tumores tratados é então suprimida por meio de tratamentos Dll4 mAb. Em contraste, o tratamento com mAb Dll4 XRT + (4) são propensos a causar alguma morte celular endotelial (como sugerido na coloração de CD31), que conduz a um encerramento temporário vascular [15]. Aos 7 dias seguintes XRT + Dll4 mAb (4) tratamentos, o índice vascular parece estar voltando ao nível da linha de base, enquanto o índice de depressão vascular persiste na combinação tripla tratados com animais.
O tratamento com Dll4 mAb sozinho (3) induziu uma resposta similar aos descritos na literatura [9] – [12]. Como antecipado, a coloração quantificada CD31 aumentou após o início do tratamento, enquanto o fluxo de sangue activo, tal como avaliado usando ultra-som Doppler, diminuiu (Figura 3). Esta é uma característica de bloqueio Dll4, onde ocorre angiogénese excessiva, mas diminui a perfusão paradoxalmente vasculares. Neste estudo, o desligamento da função vascular foi mantida durante até 7 dias após o início do tratamento mAb Dll4 (3) (Figura 1). No entanto, um atraso do crescimento do tumor à radiação semelhante sozinho (2) foi observada, indicando que o encerramento vascular baseado Dll4 mAb não é suficiente para induzir dano substancial do tumor (Figura 4).
investigações recentes demonstraram que o pré-tratamento tumores com USMB pode radiossensibilizar células endoteliais à radiação, aumentando subsequentemente a resposta total de tumores [19]. Nós descobrimos que o tratamento USMB seguido de XRT (5) provoca uma diminuição aguda e significativa na VI, tal como medido com energia ultra-som Doppler (Figura 1).