Abstract
Nossos estudos anteriores demonstraram que a deleção genética do
gene MUC2
provoca câncer colorretal em ratos. O estudo mostrou ainda que na fase inicial ( 3 meses) a
MUC2
camundongos knockout espontaneamente desenvolveram inflamação crónica no cólon e reto, características patológicas similares como colite humana; e na fase tardia ( 3 meses) os ratos exibiram cancro colo-rectal, incluindo um fenótipo único de prolapso rectal (rectal inflamação grave e adenocarcinoma). Assim, a idade de 3 meses, pode ser o ponto chave da transição da inflamação crónica de cancro. Para determinar os mecanismos de transformação maligna, realizamos matriz miARN sobre as células epiteliais do cólon a partir de 3 meses
MUC2
– /- e
+ /+ ratinhos. MicroRNA perfil mostrou expressão diferencial de miRNAs (isto é, enriquecimentos de expressão inferiores ou superiores) em
MUC2
– /- ratos. 15 deles foram validados por PCR quantitativa. Com base na relevância para citocina e câncer, 4 miRNAs (miR-138, miR-145, miR-146a, e miR-150) foram validar e foram encontrados significativamente regulada negativamente na colite humana e tecidos de cancro colorrectal. A rede dos alvos destes miRNAs foi caracterizado e interessadamente, citocinas miRNA-associados foram significativamente aumentados em
MUC2
– /- ratos. Este é o primeiro a revelar a importância da expressão aberrante de miARNs na transformação dinamicamente de colite crónica de cancro associado a colite. Estes achados lançar luz sobre revelando os mecanismos de transformação maligna colite crônica
Citation:. Bao Y, Guo Y, Z Li, Fang W, Yang Y, Li X, et al. (2014) Profiling MicroRNA em
MUC2
Knockout Camundongos de Colite Associada Modelo Cancer revela epigenéticas Alterações durante crônica transformação maligna colite. PLoS ONE 9 (6): e99132. doi: 10.1371 /journal.pone.0099132
editor: Sergei Grivennikov, Fox Chase Cancer Center, Estados Unidos da América
Recebido: 25 de fevereiro de 2014; Aceito: 11 de maio de 2014; Publicação: 18 de junho de 2014
Direitos de autor: © 2014 Bao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pela concessão do National Natural Science Foundation da China (concessão # 91229115 e 81272251), uma subvenção para a equipe inovadora de Ciência e Tecnologia do Departamento de Educação, Província de Henan, na China, e Fundo de Investigação Doctor (# 100.820 e 505.011) e do Fundo de inicialização a partir University Medical Xinxiang, China. O trabalho também foi apoiado em parte pelo aluno Faculdade Nacional de projectos inovadores de China (# 201310472005 para XL, 201.310.472.012 para BX, e 201.310.472.016 para ZL). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal (CCR) é a terceira doença maligna comum e a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer [1]. À semelhança de outras doenças malignas, os factores genéticos contribuem muito para a formação de CRC, mas, apenas cerca de 20% dos casos de CRC podem ser geneticamente atribuída a história familiarizados [2] – [4]. Na verdade, a maioria dos CRC esporádica estão fortemente ligados a fatores ambientais, através da qual as mais frequentemente mutações no polipose adenomatosa (APC) gene supressor de tumor levar a destruição de Apc /GSK3β /Axin complexo e ativação de Wnt via /β-catenina [ ,,,0],2], [5], [6] a activação aberrante de Wnt via /β-catenina não só promove a proliferação de células epiteliais intestinais, mas também induz a sua prisão à medida que avançam para a extremidade da cripta e prevenir derramamento ou apoptose das células transformadas. A “via genética para o cancro colorectal” canonical tem sido bem estudos. Os mecanismos emergentes de formação de cancro colorectal por fatores ambientais estão associados com inflamação crônica, com o nome associado a colite câncer colorretal (CAC) [7] – [10] Com as mudanças de dieta e estilo de vida na China, CRC taxa de incidência aumenta rapidamente do que quaisquer outros tipos de câncer nos últimos anos [11], e bastante quantidade de casos de CRC estão ligadas à doença inflamatória crónica do intestino (IBD). É aceitável que é precedido por CAC [8] clinicamente detectável IBD, [12], tais como a doença de Crohn (DC) ou a colite ulcerosa (UC). Epidemiologia e estudos clínicos têm sugerido que a UC aumenta o risco de CAC em até 18-20%, enquanto CD em até 8% após 30 anos de doença ativa [13] – [15]. Em modelos de ratos, injeção única de cancerígeno azoximetano (OMA) leva a múltiplos tumores do cólon, somente quando combinado com colite crônica induzida por sulfato de sódio dextrano (DSS), enquanto que quando a inflamação está ausente leva múltiplas injeções de AOM e mais tempo para a formação de tumores [16], [17]. Estas observações clínicas e experimentais identificar claramente CAC como o cancro-driven inflamação clássica. No entanto, ao contrário Apc /Wnt via /β-catenina, os mecanismos subjacentes cancro associado a colite, e particularmente, da transformação maligna colite, são em grande parte claro, majoritariamente devido à falta de um modelo apropriado para investigação dinâmica.
epitélio intestinal são protegidos por uma camada de mucina segregada pelas células caliciformes contra lesões mecânicas e químicas, causas potentes da inflamação, e a mucina segregada intestinal mais abundante é codificada pelo
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gene [18]. Estudos anteriores têm demonstrado que a diminuição do número de células caliciformes e reduzida
MUC2
expressão é vulgarmente observado na colite ulcerosa e carcinoma colorrectal [19]. A importância da
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na homeostase intestinal é refletida por alterações da proliferação celular, migração e apoptose no intestino do rato em cima deleção genética do
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gene [20], eo mais importante,
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ratos -deficiência (
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– /- ratos) desenvolvem espontaneamente pequeno e grande intestinal e retal, tumores [20]. Estudos mecanísticos têm mostrado que a tumorigénese está associada com a activação da inflamação crónica, e não está associada com Wnt /β-catenina sinalização [20]. No entanto, a inflamação aumentou tumorigênese intestinal em camundongos mutante Apc através da introdução de
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deficiência aos ratos [21], e perda de p21WAF1 ciclina dependente inibidor da quinase reforçada a formação do tumor intestinal em
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– /- ratos [22], o nosso estudo mostrou ainda que
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deficiência ratinhos desenvolvem espontaneamente colite crónica à sua idade precoce ( 3 traças), cuja histopatologia foi semelhante a colite ulcerosa em pacientes. Após 3 meses, o
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– /- ratos desenvolvem tumores do cólon e do reto. Portanto, a idade de 3 meses pode ser o ponto chave na qual colite crônica progride para câncer colorretal, ou seja, colite transformação maligna, e
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ratos poderia ser um dos modelos melhor engenharia de cancro associado a colite para dinasticamente estudar o mecanismo de transformação maligna de colite crônica
Para revelar os mecanismos moleculares de transformação maligna colite, foram isoladas células epiteliais do cólon a partir do
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-. /- ratos e conduziu profiling miRNA. Encontramos expressão diferencial de miRNAs no ponto-chave da transformação maligna. Alguns miRNAs foram caracterizados na colite humana e tecidos de cancro colorrectal. Curiosamente, os miRNAs reprimidos foram consistentes com as alterações em camundongos, e ligado aos aumentos de citocinas, sugerindo as alterações epigenéticas podem desempenhar um papel crítico durante a transformação maligna colite.
Materiais e Métodos
Ética declaração:
o cuidado com os animais ea utilização foram aprovados pelo Comitê cuidado e uso Institucional animal do University Medical Xinxiang e da Universidade de Illinois, em Chicago, e coleta de amostras humanas e de utilização foram aprovadas pelo Conselho de Xinxiang Medical Institutional Review Universidade. Todos os pacientes deram consentimento informado por escrito
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Modelo rato e Patologia Caracterização:.
Como relatado anteriormente [20] – [22], o
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+/- ratos foram retrocruzadas para gerar
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– /- e
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+ /+ ratos e 10 ratinhos por grupo foram alimentados com dieta roedor ração padrão para 3 meses ou 6 meses. Nos pontos finais, os murganhos foram sacrificados, todo tracto gastrointestinal foi aberto e lavou-se com PBS frio e fixadas em formalina a 10% tamponada. Os tecidos foram embebidos em parafina, seccionados e corados para a caracterização histopatologia
MUC2
mouse cólon epitélios Cells recolha, análise mRNA e miRNA Profiling:.
Usando o protocolo publicado por nós [23] – [25], as células epiteliais do cólon de rato foram coletadas a partir de 3 meses com idade
MUC2
+ /+ e
MUC2
– /- ratos, respectivamente. Foram utilizadas quatro ratos de cada grupo. Os ARNs totais foram extraídos utilizando o reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) para a análise do mRNA de citocinas e análise de arranjo de miARN. A qualidade e quantidade de ARN foi determinada utilizando electroforese em gel e Bioanalyzer. Os níveis de ARNm de citocinas foram analisados utilizando Q-RT-PCR. Os iniciadores utilizados para a análise de citoquina rato foram listados na Tabela S1.
A matriz miARN foi realizado nas instalações genómico da Universidade de Chicago (Chicago, Illinois). Affymetrix GeneChip miRNA Arrays versão 3.0 foi utilizado para o perfil de miRNA. Em resumo, 200 ng de ARN total foram marcados utilizando FlashTag Biotina HSR Labeling kit de acordo com o protocolo do fabricante (Affymatrix), e cerca de 130 ul de tampão de hibridação Affymatrix cocktail (FS450-002) foram utilizados durante cerca de 18 horas de acordo com o protocolo (Affymatrix) . A matriz foi então digitalizado utilizando Affymatrix GeneChip Scanner 3000. Os dados brutos foram processados com Console Expressão 1.2.0.20, valor de dados foi definido utilizando o Log Expressão de Sinais – RMA-DABG. Os miARNs com uma mudança vezes 2,0, ou 0,5 e um valor 0,01 foram seleccionados como miARNs expressos diferencialmente. O delineamento experimental detalhado, protocolo detalhado e análise de dados pode ser acessado em Gene Expression Omnibus (GEO) (Acesso # GSE56577)
Mouse miRNA Validação usando quantitativa Reação em Cadeia da Polimerase Transcrição Reversa (qRT-PCR):.
com base nos graus de níveis de miRNA alterado a partir do perfil de matriz miRNA, 6 dos mais regulada e 9 dos miRNAs mais reprimidos foram validados utilizando qRT-PCR. Os transcrição reversa (RT) primers e primers para a frente e sondas utilizadas para a validação miRNA foram listadas na Tabela S2. A sonda Taqman universal e iniciador inverso universal de qRT-PCR foram adquiridos a Integrated DNA Technologies (IDT) (Tabela S2).
O ARN total de ratinho epitélio do cólon foi poliadenilado com poli (A) polimerase Tailing Kit (Epicentre ). Resumidamente, 10 uL de reacção, incluindo de 1 ug de ARN, 1 ul de tampão 10x reacção, 1 ul de ATP 10 mM e 1 unidade do poli (A) polimerase foi incubada a 37 ° C durante 30 minutos, seguido de inactivação da enzima a 65 ° C durante 5 minutos e em seguida, colocar no gelo. Depois de poliadenilação, a transcrição reversa foi realizada numa reacção de 10 ul contendo 1 uL do produto da reacção de poliadenilação, 1 ul de 0,5 uM iniciador de RT, 0,5 ul de dNTP 10 mM, 1 ul de AMV 10x tampão de reacção, e 50 unidades de AMV alta desempenho da transcriptase reversa (Promega, Madison, WI). A reacção foi incubada a 42 ° C durante 60 min, e depois terminada por aquecimento a 70 ° C durante 10 min. Os produtos de RT foram amplificadas e detectadas utilizando um método de S-poli (T), como relatado por nós [26]. Uma reacção de PCR de 20 uL contém 2 ul de produtos de RT (diluição de 4 vezes), 10 ul de 2x GoTaq® Hot Start Mistura Mestre incolor (Promega, Madison, WI), 0,2 ^ M, iniciador de sentido directo a 0,2 uM universal iniciador inverso, e 0,25 ? M sonda Taqman universal. A reacção de PCR foi realizada a 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 10 s e 60 ° C durante 30 s. Os resultados de qRT-PCR foram analisados como relatado por nós [27] – [29]. O snoRNA202 foi utilizado como controle interno
amostras humanas Coleção:.
Dezesseis paires de tecidos com cancro colorectal humanos, colite tecidos, e sua adjacente mucosa do cólon normal, foram coletadas a partir de novembro de 2012 a outubro de 2013, a partir do primeiro hospital afiliado eo Hospital Central Affiliated Xinxiang, Xinxiang Medical University. Porção das amostras foram tiradas em azoto líquido e depois armazenadas a -80 ° C durante a extracção de ARN e análise de qRT-PCR. Todos os pacientes deram consentimento informado por escrito. A recolha da amostra e da utilização foi aprovado pelo Institutional Review Board da Universidade de Medicina Xinxiang.
extracção de ARN e qRT-PCR para análise de ARNm de amostras humanas foram semelhantes como acima descrito para a análise de células epiteliais do cólon do rato. Os iniciadores e as sondas utilizadas para a análise foram listados miARN Tabela S2. . SNORD 44 foi utilizado como controle interno
miRNA alvos Identificação, funções biológicas Categorização e Análise de Redes:
Para identificar os alvos dos miRNAs, utilizamos software online – David (http: //david.abcc.ncifcrf.gov/) e uma lista prevista de genes alvo de miRNA conservados obtidos a partir TargetScan (https://www.targetscan.org/), Base Estelar (https://starbase.sysu.edu.cn/) , Tarbase (https://microrna.gr/tarbase/), e miRBase (https://mirbase.org/index.shtml). As funções biológicas dos miARNs foram categorizadas pelo gene Oncologia (GO). rede alvos potentes e sinalização foram propostas usando KEGG (https://www.kegg.jp) e Ensembl (https://www.ensembl.org) ferramentas da web.
Resultados
Histopatologia do
MUC2
rato Modelo de Câncer colite associada:
trabalhos anteriores demonstraram que o alvo knockout gene da
gene MUC2
causou a formação de tumores em todo trato gastrointestinal, incluindo duodeno, cólon e reto [20], e
MUC2
– /- doenças inflamatórias bacia ratos são suscetíveis a DSS-induzida [30]. Neste estudo, verificou-se que em 3 meses ou anterior, o
MUC2
– /- ratinhos desenvolveram espontaneamente inflamação crónica no cólon e reto, que acompanha com alguns tumores nesses locais (Figura 1). Como mostrado na Figura 1A, a mucosa do cólon carecido de células caliciformes e exibiram as características de colite ulcerativa, tais como a erosão superficial e infiltrações intensiva de células inflamatórias em toda a mucosa, submucosa e mesmo camada muscular do cólon, o que era semelhante à observada em colite ulcerosa humana. A colite crónica era acompanhada por um adenoma. Na idade de 6 meses,
MUC2
– /- ratos desenvolveram tumores no cólon e reto, como relatado [20], mas inflamação grave ainda foi observada em tumores intra-e extra-tumores (Figura 1B). Um fenótipo original era que
MUC2
– /- ratos desenvolvidos prolapsos retais (Figura 1C) que nunca foi relatado anteriormente. Histologicamente, o prolapso foi adenocarcinoma com inflamação grave no rectos (Figura 1D), que indicam a erosão superficial, as células inflamatórias de infiltração e invasão de células de cancro. Além disso, a gravidade da infiltração de células inflamatórias foi relacionada com a gravidade da prolase rectal, mas não foi associada com a invasão de células do cancro e diferenciação no recto (dados não mostrados).
A, colite e em um adenoma cólon mouse na idade de 3 meses. setas cinzentas apontou infiltração grave de células inflamatórias, seta branca apontou um adenoma. B, o adenocarcinoma do cólon com infiltração de células inflamatórias na idade de 6 meses. C, rectal prolapso em 6 meses. . D, Histopatologia do prolapso retal, mostrando a invasão de células de câncer e inflamação grave no reto (idade de 6 meses)
miRNA Profiling Revelado expressão diferencial de miRNA em
MUC2
– /-
Ratos
estudos recentes têm sugerido os papéis importantes de miRNAs na carcinogénese. Para investigar se a expressão aberrante de miRNAs estão envolvidos na transformação maligna colite, foram isoladas as células epiteliais do cólon de ratos de 3 meses de idade (4
MUC2
– /- ratos e 4
MUC2
+ /+ camundongos) e conduzido profiling miRNA. Sabe-se que a interacção entre as células estromais e epiteliais desempenha um papel importante na condução do cancro colo-rectal associada à colite (CAC).
MUC2
foi sobre-expresso em células epiteliais do cólon, e deficiência genética deste gene é suficiente para provocar a colite e cancro colo-rectal, exercendo a importância de
MUC2
no desenvolvimento de colite e CAC. Para determinar os papéis dos miRNAs expressos de maneira aberrante resultou de
MUC2
ausência em iniciar colite e facilitando a transformação cancro colo-rectal, usamos células epiteliais do cólon em vez de células do estroma ou todo tecidos do cólon para matriz de miRNA. Mirna análise de perfil mostrou níveis diferenciais de miRNAs, entre eles 20 miRNAs foram significativamente reprimidos e 71 miRNAs foram upregulated significativamente (Tabela 1) em
MUC2
– /- ratos, em comparação com
MUC2
+ /+ camundongos (mudança dobra 2 ou 0,5; T 0,01, p valor 0,05, valor q 0,05). Conforme demonstrado na Tabela S3 e S4 Tabela, a maior parte dos miARNs têm sido relatados para regular os seus objectivos e desempenham papéis críticos no cancro da iniciação, progressão e metástase, em diferentes tecidos e células. Enquanto, as funções biológicas de alguns miRNAs não são claras e justificar uma investigação mais
Mouse miRNAs Validação por qRT-PCR:.
Para avaliar a precisão da alteração miRNAs perfilado no cólon do rato células epiteliais, foram selecionados 15 miRNAs mais relevantes para a validação utilizando qRT-PCR. Os 6 miRNAs regulados positivamente (MMU-miR-5132-5p, mmu-miR-3104-5p, mmu-miR-669c-5p, mmu-miR-705, mmu-miR-760-3p, mmu-miR-1962) e os 9 miRNAs regulados negativamente (MMU-miR-146a, mmu-miR-138, mmu-miR-5123, mmu-miR-196b, mmu-miR-5099, mmu-miR-150, mmu-miR-145, mmu-miR -27a, mmu-miR-23a) escolhido para a validação também foram baseados em seus genes-alvo previstos, cujas funções são bem relevantes para a inflamação e câncer. Como mostrado na Figura 2, as alterações de miARN ensaiada por qRT-PCR foram consistentes com as alterações de perfil por análise de matriz de miARN.
Quatro ratos em idade de 3 meses a partir de cada grupo de genótipo foram sacrificados e as células do epitélio do cólon eram isolado por extracção de ARN e análise de qRT-PCR. As colunas representava média +/- SD.
expressão aberrante de miRNAs na colite Humano, Colorectal do tumor e normal adjacente Mucosa
Para determinar se os miRNAs expressos de maneira aberrante ter significado clínico, escolheu 4 miRNAs para análise em tecidos de câncer colorretal e colite humanos. Como mostrado na Figura 3, em geral, o nível de miR-138 expressão, o miR-145, miR-146a e miR-150 foram reprimidos por cerca de 3,37, 3,39, 2,56 e 4,99 vezes em cancros colo-rectais que aqueles no combinado normal adjacente mucosa (
p Art 0,0001). Entre eles, todos os 16 cancros colo-rectais apresentaram downregulated miR-138 e miR-150 níveis (Figuras 3A e 3D), e 15 dos 16 cancros colo-rectais apresentaram menores níveis de expressão de miR-145 e miR-146a que o controlo normal (Figuras 3B e 3C). Apenas um paciente (Amostra 6) mostraram regulação positiva de miR-145, mas a sobre-regulação não foi significativa (Figura 3B, p 0,05). Curiosamente, a regulação negativa dessas miARNs também foram observadas nos tecidos humanos colite crónica (Figuras 4, p 0,0001, comparado com a mucosa normal). Embora as observações foram obtidos a partir de pequenas amostras de tamanho, as tendências de regulação baixa significativa dos miRNAs (MIR-138, 145, 146a e miR-150) sugeriu fortemente a sua importância clínica da ligação à colite crônica e câncer colorretal associado a colite, indiretamente, indicando a sua potenciais funções biológicas de envolver na transformação maligna colite. Na verdade, as funções desses miRNAs na supressão do tumor estão sendo sob investigação usando o sistema de cultura de células manipuladas
in vitro Comprar e ratinhos nus portadores de tumor
in vivo
.
A , miR-138 foi significativamente regulada negativamente em cânceres colorretais. B, o miR-145 foi significativamente regulada negativamente em cancros colo-rectais. C, miR-146a foi significativamente regulada negativamente em cânceres colorretais. D, miR-150 foi significativamente regulada negativamente em cânceres colorretais. Cada coluna ficou por um paciente, o total de 16 pacientes. O geral ficou para a média dos miRNAs em todos os pacientes. (***
p Art 0,0001, comparado com a mucosa normal adjacente).
A, miR-138 foi significativamente regulada negativamente na colite. B, o miR-145 foi significativamente regulada negativamente na colite. C, miR-146a foi significativamente regulada negativamente na colite. D, o miR-150 foi significativamente regulada negativamente na colite. Cada coluna ficou por um paciente, o total de 6 pacientes. O geral ficou para a média dos miRNAs em todos os pacientes. (***
p Art 0,0001, comparado com a mucosa normal adjacente)
miRNA alvo Rede Caracterização:.
Uma vez que os miRNAs mudaram teve grande importância na
MUC2
– /- ratos e transformação maligna colite humana, ea miRNA selecionada mostrou downregulation na colite e câncer colorretal, o próximo elucidado se havia alvos comuns destes miRNAs. Infelizmente, nenhuma inflammation- comum e alvos associados ao cancro para todos os 4 miARNs (miR-138, 145, 146a e miR-150) foram identificadas usando ferramentas de previsão de miARN alvo. No entanto, conseguimos encontrar alguns alvos comuns de qualquer 3 ou 2 dos 4 miRNAs. Como mostrado na Figura 5 e na Tabela 2, não foram de 21, 13 e 25 alvos comuns entre o miR-138 e miR-145, miR-146a e miR-150, respectivamente; foram 16 e 15 comum entre o miR-145 e miR-146a e miR-150, respectivamente; e havia 7 metas comuns entre miR-146a e miR-150. Tenha em atenção que CCT3 e PAPPA foram alvos comuns para miR-138, miR-146a e miR-150, e ZHX2 era o alvo comum para miR-138, miR-145 e miR-150. Curiosamente, a maioria desses alvos são oncogenes. GO anotação prazo mostrou que todos os alvos estão envolvidos no processo fisiológico celular e metabolismo, ea regulação do processo celular e regulação de processos fisiológicos são os termos GO mais significativamente enriquecidos. Assim, qualquer desregulação desses miRNAs e seus alvos pode ser suficiente para causar o início da inflamação e transformação maligna inflamação crônica, estudos sobre quaisquer alvos comuns de dois ou mais miRNAs na carcinogênese é mais significativo do que quaisquer alvos de um único miRNA.
as citocinas em
MUC2
– /-
células de camundongo cólon epiteliais foram Up-regulada:
Para validar a precisão da análise do miRNA e sua associação com mRNAs de citocinas, o mais tarde são frequentemente visto em cancro associado a colite, nós determinamos as alterações de citocinas no cólon mouse. Como mostrado na Figura 6, em comparação com
MUC2
+ /rato +,
MUC2
– /- ratos mostraram regulação positiva significativa de citocinas (por exemplo, IL-6, Cox2, TNF-a e IL-1β, etc) em células epiteliais do cólon a partir da mucosa do cólon com aparência normal (p . 0,01)
em comparação com
MUC2
+ camundongos /+,
MUC2
– /- ratos mostraram regulação positiva significativa de citocinas (** p 0,01, em comparação com
MUC2
+ /+ camundongos). Quatro ratos em idade de 3 meses a partir de cada grupo de genótipo foram sacrificados e as células do epitélio do cólon foram isolados por extracção de ARN e análise de qRT-PCR. As colunas representava média +/- SD.
Discussão
O presente estudo caracteriza-se ainda um modelo de cancro colo-rectal associado a colite (CAC) da
MUC2
– /- ratos, fornecendo evidência direta de que a inflamação crónica no cólon e reto pode ser maligno transformado, e revelando os mecanismos potentes, que era aquela expressão miRNA aberrante em células epiteliais do cólon foram envolvidos e pode desempenhar um papel crítico durante a transformação maligna de colite crônica, interferindo genes alvo.
Vários estudos baseados em evidências têm demonstrado que a colite crônica é uma das causas importantes de câncer colorretal, mas os mecanismos subjacentes não são claros, uma das principais razões é a falta de espontânea colite e modelo de cancro colorrectal associada a colite. Actualmente, uma variedade de modelos animais geneticamente modificados estão disponíveis e são muito úteis para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes a patogênese da CAC [31], mas as características patológicas destes modelos não foram caracterizadas de forma dinâmica. O presente estudo caracterizou o
MUC2 modelo do rato
. O
MUC2
– /- ratos desenvolvem espontaneamente inflamação crônica no cólon e reto na fase inicial ( 3 meses), e depois de 3 meses, a inflamação crónica progresso ao cancro colo-rectal. Mais importante ainda, as características patológicas da inflamação crónica no cólon e reto foram semelhantes, como a colite ulcerosa humana, e os miRNAs expressos de maneira aberrante envolvidos no
MUC2
– /- rato de colite transformação maligna foram observadas na colite humana e tecidos de cancro colorrectal. Outra característica única foram os prolapsos retais – câncer retal com inflamação grave. Portanto, o
MUC2
– /- de rato poderia ser o modelo de roedor apropriado de CAC, e poderia ser utilizado como um dos melhores ferramentas para elucidar a causa da CAC e os mecanismos moleculares subjacentes. O
MUC2
– /-. Mouse também pode ser usado como um modelo de rato para quimioprevenção e terapia para o cancro colorectal associada à colite
miRNAs têm 19-22 nucleotídeos, são um romance classe de pequenos RNAs não-codificantes que suprimem a tradução ea estabilidade do RNA mensageiro (mRNA) por ligação a alvo mRNAs ‘3’ não traduzida regiões (3′-UTR) [32], miRNAs têm funções biológicas e pathophysical importantes de envolver no desenvolvimento, proliferação celular, diferenciação, apoptose, inflamação e resposta ao stress [33] – [35]. evidências crescentes sugerem que miARNs são regulados negativamente ou regulada positivamente em cancros, actuando como supressores de tumores ou oncogenes [33], [35], [36], em que os miARNs desempenham papéis críticos na tumorigénese, a diferenciação, a progressão (por exemplo, migração, invasão, angiogénese, metástase e) [35] – [37], principalmente, por interferir com a expressão de genes alvo. Usando uma matriz de miRNA, temos perfilado expressão diferencial de miRNAs em células epiteliais do cólon a partir do
MUC2
– /- ratos, e estes miRNAs são ou regulada como oncogenes ou reprimidos como supressores tumorais, visando os genes nas categorias de metabolismo, do ciclo celular, a diferenciação, a morte das células, a replicação do ADN, homeostase, transdução de sinal, resposta à estimulação, e inflamação, etc. de entre os miARNs marcadamente alterada, o miARNs regulada negativamente, o miR-138, 145, 146a e 150 , foram validados em ambos os tecidos de camundongos e humanos, em particular, na colite humana e tecidos de câncer colorretal, sugerindo que suprimem papéis de miR-138, 145, 146a e 150 em transição maligno colite via interagir com citocinas e fatores inflamatórios.
estudos anteriores demonstraram papéis supressores de tumor de miR-138 na biologia do câncer. crescimento de miR-138 inibiu cancro celular e a tumorigénese no cancro do pulmão de células não pequenas e carcinoma da nasofaringe por segmentação 3-fosfoinositida-dependente da proteína cinase-1 (PDK1) e CCND1 [38] – [40]. Em colorectal e cancro do ovário, miR-138 suprimiu a migração de células de câncer e metástase através interferiu com TWIST2, SOX4 e HIF1-a [39], [41]. A maioria dos estudos recentes relataram que regulada negativamente o miR-138 sustentado fator inflamatória da activação de NF-kB e promoveu a progressão do cancro esofágico [42], e que o miR-138 de resposta de citocinas pró-inflamatórias depende da estabilização de HIF1-α em células endoteliais microvasculares humanas primárias [43]. miR-145 é também um gene supressor de tumor. miR145 poderia ter como alvo o eixo SOX9 /ADAM17 e inibir células iniciadoras de tumores e efeitos parácrinos IL-6 mediadas em câncer de cabeça e pescoço [44]. Além disso, microARN-145 induz a apoptose com a indução da expressão de ligando (TRAIL) indutor de apoptose relacionado com o factor de necrose tumoral, socs7 oncogene alvo e de indução do interferão-β regulada através da translocação nuclear STAT3 em células de cancro da bexiga [45]. Estudos recentes têm relatado que TRAIL suprime receptor de quimiocinas (CXC motif) 4 (CXCR4) mediada por migração de células de câncer de mama humano, up-regulação da expressão de miR-146a através de NF-kB sinalização [46], e que miR-146 regula UHRF1 regulador epigenética e modula a invasão câncer gástrico e metástase [47], mostrando o importante papel de miR-146 em inibir a metástase do câncer por interferir quimiocinas e regulador epigenética. Quanto ao miR-150, um monte de relatórios têm demonstrado a sua função inibitória tumor [48] – [51]. Enquanto, que o miR-150 interage com citocinas em diferenciação de linfócitos e na inflamação tem sido estudada. Por exemplo, nos linfócitos T citotóxicos (CTL), de IL-2R e sinais inflamatórios agir através de Dicer e miARNs para controlar o programa de diferenciação e citolítica de CTL, em que o miR-139 e miR-150 são regulados negativamente pela inflamação em CTLs, e miR- 150 regula a expressão da cadeia α receptor IL-2 (CD25) [52]. Além disso, a produção de IFN-γ é aumentada significativamente nos miR-150 ratinhos knockout [53]. Voltar aos nossos achados, que foram, citocinas foram significativamente aumentados (Figura 6) e miR-138, 145, 146a e miR-150 foram significativamente menores no
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– colite do cólon do rato e humano – /e cancro colo-rectal, incorporando com as observações publicadas, apoiam fortemente a hipótese de que os miARNs associado com citocinas, o miR-138, 145, 146a e miR-150, desempenham um papel importante na transformação maligna colite crónica através de interferir com citocinas e factores inflamatórios. No entanto, semelhante como as mudanças de citoquinas como uma consequência de colite no cólon do rato, as alterações da miARN pode também ser uma consequência colite crónica e CAC nos tecidos do cólon humano. Poderia ser possível, mas os dados preliminares de nossos estudos funcionais em curso, utilizando sistemas de cultura de células manipuladas e in vivo modelo nu do rato mostraram potencial individual ou synergistical destes miRNA (Bao e Yang, dados não publicados), confirmando funções supressores de tumor destes miRNAs . Além disso, os recursos potentes dos miARNs alterados em colite humano e tecidos de CRC não são claras e necessitam de mais investigação, os restults gerados a partir do qual poderá clarificar as funções causa ou efeito destes miARNs no desenvolvimento de colite e cancro colo-rectal.