Abstract

O cancro do pulmão é a neoplasia mais letal, e um diagnóstico precoce é a melhor maneira para melhorar a sobrevivência. pacientes sintomáticos que frequentam pulmonar Serviços poderia ser diagnosticado com câncer de pulmão mais cedo, se indivíduos de alto risco são prontamente separados de indivíduos saudáveis ​​e doentes com patologias respiratórias benignas. Temos procurado por um teste de soro não-invasivo conveniente para definir quais os pacientes devem ter testes clínicos mais imediatos. Seis moléculas associadas a cancro (HB-EGF, EGF, EGFR, sCD26, VEGF, e calprotectina) foram investigados neste estudo. Os marcadores foram medidos em soro por ELISAs específicos, em uma população não selecionada, que incluiu 72 pacientes com câncer de pulmão de diferentes tipos histológicos e 56 indivíduos do grupo controle (indivíduos saudáveis ​​e doentes com patologias pulmonares benignos). regressão potenciado e análise florestas aleatória foram realizados para a selecção dos melhores candidatos a biomarcadores. A capacidade de discriminação notável foi observada para o EGF, sCD26, e especialmente para a calprotectina, estas três moléculas que constitui um painel de marcadores apresentando uma sensibilidade de 83% e especificidade de 87%, resultando numa taxa de erro de classificação associado de 15%. Finalmente, um algoritmo obtidos por regressão logística e um nomograma permitiu gerar escores de classificação em termos de risco de um paciente de sofrer de câncer de pulmão. Em conclusão, propomos um teste não-invasivo para identificar pacientes com alto risco de câncer de pulmão a partir de uma população não selecionada assistir a um Serviço de Pneumologia. A eficácia deste painel de três marcador deve ser testado em uma população maior de câncer de pulmão

Citation:. Blanco Prieto-S, Vázquez-Iglesias L, Rodríguez-Girondo M, Barcia-Castro L, Fernández-Villar Um, Botana-rial MI, et ai. (2015) Serum calprotectina, CD26 e EGF para estabelecer um painel para o diagnóstico de câncer pulmonar. PLoS ONE 10 (5): e0127318. doi: 10.1371 /journal.pone.0127318

Editor do Academic: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ‘, ITALY

Recebido: 07 de novembro de 2014; Aceito: 13 de abril de 2015; Publicado: 18 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Blanco-Prieto et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada por PS09-00405 projeto do Instituto de Salud Carlos III, Agrupamento de Inbiomed 2012/273, e financiamento do FEDER DXPCTSUG-Feder (CN 2011/024). S. Blanco-Prieto foi apoiado por uma bolsa da Programa Nacional de Formação de Professorado Universitário (FPU, Ministério espanhol da Ciência e Inovação). M. Rodríguez-Girondo reconhece o apoio financeiro da Grant MTM2011-23204 (apoio FEDER incluído) do Ministério da Ciência e Inovação e INBIOMED 2009-063 da Xunta de Galicia espanhol. As amostras utilizadas neste trabalho pertencem ao Biobank do CHUVI (Retic-FIS-ISCIII RD09 /0076/00011)

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução o câncer de

Lung (LC) é a neoplasia mais fatais respondendo por 18% das mortes totais de câncer [1]. A classificação histológica dos tumores de pulmão inclui dois grandes grupos: câncer de pulmão de pequenas células (CPPC) e câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), o que representa 75-80% dos cancros do pulmão recém-diagnosticados [2]. No momento do diagnóstico de uma proporção substancial de pacientes mostra disseminação do tumor e extremamente mau prognóstico, com uma taxa de sobrevida em 5 anos de 16% para NSCLC [3]. No entanto, a sobrevivência varia consideravelmente dependendo do estágio, de 52% na doença local para uma dramática 4% para estágio avançado [4].

O National Cancer Institute conduziu o julgamento National Lung Screening que demonstrou uma redução de 20% na mortalidade LC para uma população de alto risco referido rastreio com uma dose baixa de tomografia computadorizada (TC) [5]. Assim, as orientações existentes dos EUA afirmam que provas suficientes suporta a execução do rastreio LC com [6] CT. Por outro lado, a incerteza permanece dentro da Europa pendente para a estimativa combinada de mortalidade com base nos ensaios em curso de triagem [7]. A escolha de qual grupos de risco devem ser rastreados também é duvidosa. Os resultados preliminares do maior ensaio de rastreio do cancro do pulmão Europeia, NELSON, mostraram distribuição fase favorável, com 70,8% dos indivíduos sendo diagnosticados na fase I, que espero venha a resultar em uma redução da mortalidade [8].

No entanto, uma das principais preocupações da triagem LC com CT é a alta taxa de resultados falsos positivos que tornam esta tecnologia procedimentos de diagnóstico adicionais de custo-eficácia, o que implica [9]. Como consequência, os modelos de previsão de risco que incorporam biomarcadores genéticos e moleculares para o diagnóstico precoce estão ganhando interesse para pré-selecionar pacientes a serem submetidos a uma dose baixa de CT [10, 11].

Recentemente, painéis de marcadores sorológicos para definir alta populações -Fatores para a LC e especificamente para NSCLC foram relatados. Planque

et al

. [12] estabeleceu um modelo com várias Calicreínas, enquanto outros autores selecionados matrizes de biomarcadores com uma implicação documentado em LC [13-15].

Foram analisados ​​os níveis de 6 marcadores candidatos em amostras de soro recolhidas de câncer de pulmão pacientes e comparou-os com um grupo controle composto por dois controles saudáveis ​​e indivíduos com afecções benignas do pulmão. As moléculas seleccionadas são marcadores associados a cancro que cobrem uma vasta gama de funcionalidades envolvidas no desenvolvimento e progressão do cancro: a forma solúvel do receptor do Factor de Crescimento Epidérmico (sEGFR) [16]; dois dos ligandos que se ligam a EGFR: Factor de Crescimento Epidérmico (EGF) e heparina de ligação ao factor de crescimento epidérmico (HB-EGF); o Factor de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) como um dos principais executores da angiogénese [17]; sCD26, a forma solúvel do CD26, uma actividade de serina-protease do rolamento glicoproteína da superfície celular e envolvida na regulação imune e cancro [18-20]; e uma molécula associada à inflamação, calprotectina (CAL) [21], sobre-regulada em vários cancros, incluindo pulmão [22].

O objetivo do nosso estudo é a obtenção de um painel de romance e precisa de marcadores para pacientes exigentes com alto risco de LC. Os níveis séricos das seis analitos foram medidos, e um procedimento estatístico de duas etapas foi aplicado para derivar um algoritmo de classificação óptima. Foi determinado um escore de cada paciente, permitindo uma melhor seleção dos pacientes para outros procedimentos de diagnóstico.

Materiais e Métodos

amostras clínicas

Os indivíduos incluídos prospectivamente no presente estudo são pacientes com sintomas respiratórios que frequentam o Serviço de Pneumologia do Complexo Hospitalar Universitário de Vigo (Espanha) entre maio de 2007 e novembro de 2010.

Oito ml de sangue periférico foram coletadas em tubos estéreis contendo heparina e gelose, no primeiro visita. As amostras foram centrifugadas a 3000 rpm durante 15 minutos, e o soro foi armazenado a -20 ° C até à análise. Os dados do paciente e de soro foram obtidas em plena conformidade com as práticas clínico-éticos do Governo espanhol e da Declaração de Helsínquia, e Comissão de Ética Galego de Investigação Clínica aprovou o estudo. consentimento informado por escrito foi fornecido a partir de indivíduos eo anonimato foi garantido.

Clínica de diagnóstico trabalho-up seguiu as recomendações dos guias clínicos atuais [23-25]. O diagnóstico da LC foi alcançada através da avaliação histológica de tumores seguintes os critérios da OMS, em 1999 [26]. O estadiamento foi determinada de acordo com a 5

th edição do sistema TNM em uso no momento em que o estudo foi realizado [27]. Doentes com recidiva ou progressão de um cancro diagnosticado anteriormente e a administração de um tratamento por quimioterapia ou radioterapia foram excluídos do estudo. O grupo com câncer incluiu 72 casos de câncer de pulmão: a idade média dos pacientes era de 71 anos (intervalo 47-88), 58 eram do sexo masculino e 14 do sexo feminino e tabagismo ocorreu em aproximadamente 90%. NSCLC foram responsáveis ​​por 64 casos, enquanto 8 foram diagnosticados como SCLC. Dentro do tipo NSCLC, adenocarcinoma foi o tipo histológico predominante (34 pacientes) e estágio IV foi o palco mais frequente (28 casos; as fases I e III 17 casos cada e 2 estágio tumores II).

O grupo de controlo consistiu em 56 indivíduos, divididos em dois grupos: um subgrupo de controlo incluiu pacientes com patologias benignas do pulmão, tais como doenças infecciosas (n = 31) e um doente com doença pulmonar intersticial o outro subgrupo consistiu de controlos saudáveis ​​(n = 24) e incluiu pacientes que foram clinicamente verificados com base nos sintomas respiratórios como tosse, dispneia ou dor torácica, mas sem sintomatologia específica para LC. A idade média deste grupo de controlo foi de 60 anos (variação 24-88), composto por 33 machos e 23 fêmeas, apresentando 64% dos controles hábitos tabágicos. As características clínicas e patológicas para os doentes e indivíduos sem LC LC são descritas na Tabela S1.

Medição de biomarcadores de soro Concentração

A determinação das concentrações dos biomarcadores foi conduzida utilizando disponível comercialmente de imunossorvente ligado a enzima (ELISA) ensaios, em conformidade com os protocolos sugeridos o respectivo fabricante. HB-EGF, ensaios de EGF e EGFR foram adquiridos a partir de R D Systems (Minneapolis, MN); sCD26 e VEGF a partir eBioscience (Irlanda, Reino Unido) e no ensaio de CAL de Hycult Biotecnologia (Uden, Holanda). Ambas amostras padrão e de soro foram analisadas em duplicado. As leituras de absorvância foram recolhidos num leitor de placas EnVision Multilabel (Perkin Elmer).

Métodos Estatísticos

Individual Biomarcador Avaliação.

As variáveis ​​contínuas são apresentadas como mediana (intervalo), e categóricas como frequências (porcentagens). Os testes não-paramétricos de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis foram utilizados para avaliar as diferenças na concentração de cada biomarcador entre os grupos de LC e controle, e para realizar comparações de pares entre os controles e casos subgrupos. Curvas ROC (ROC) e correlação de Pearson entre os níveis de biomarcadores também foram calculados.

P

-Valores 0,05 foram considerados estatisticamente significativos e corrigidos pelo método de Holm [28] para evitar a inflação do erro de tipo I, devido a testes de múltipla na análises de subgrupo (simultaneamente considerando os subgrupos definidos pela encenação LC e subtipos de controle). Análises univariadas foram realizadas utilizando o software estatístico SPSS 15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) e R (Wirtschafts Universität, Wien, Áustria).

Análise Seleção Painel multivariada.

concentrações de marcador foram log

10 transformado antes da análise multivariada para reduzir a assimetria. Utilizou-se um procedimento em duas etapas, que combina redução variável e adequação do modelo por meio de regressão logística.

regressão Impulsionado [29, 30] e Floresta aleatória [31] foram conduzidos para a redução do número de marcadores. Usamos uma abordagem impulsionar gradiente descendente funcional, onde o problema de ajuste é reinterpretada como a minimização empírica de uma função de perda pré-definido. Minimização é alcançada por repetidamente (m iterações) encaixando árvores de regressão para os gradientes negativos da função de perda.

florestas aleatórios contar com a agregação de bootstrap. Ou seja, inúmeras árvores de regressão são cultivadas para cada subconjunto de biomarcadores e cada árvore é usado para prever os membros do grupo para cada observação. Estes são contadas como “votos” para a participação no grupo e uma dada observação é atribuído ao grupo com maior número de votos

.

Para ambos os métodos, foram considerados 1.000 árvores e erro fora-de-saco (OOB) as taxas foram obtidos considerando formação de conjuntos com os 75% dos casos e ensaios conjuntos contendo os restantes 25%. Para a regressão impulsionado, m age como um parâmetro de ajuste e é determinado pela minimização da taxa de erro fora-de-saco (OOB). Da mesma forma, nas florestas aleatórias, as árvores são montados nos conjuntos de treinamento e são posteriormente utilizados para prever a participação no grupo de casos de teste de 25%. Nós reaparelhado cada modelo de 1.000 vezes e nós relataram um ranking dos biomarcadores de acordo com a sua importância relativa média [32].

Nós equipado todos os possíveis modelos de regressão logística com base nos biomarcadores maior classificados. Vários índices de desempenho foram calculados e comparados entre os modelos: critério de informação de Akaike (AIC), critério de informação Bayesiano (BIC) e erro médio quadrático (MSE) como medidas de falta de ajuste (valores mais baixos indicam melhor ajuste) e a área sob a curva ROC (AUC) como uma medida de discriminação. Enquanto AIC e BIC complexidade do modelo penalizar, favorecendo modelos mais simples, MSE e foco AUC na própria capacidade preditiva, favorecendo modelos mais complexos.

Nós usamos previsões OOB e nós fornecemos valores médios ao longo de 1.000 repetições. Todos os modelos de regressão logística incluiu idade e sexo para ajustar o potencial de confusão. Finalmente, nós fornecemos uma representação gráfica nomograma.

Para avaliar a capacidade de diagnóstico do painel indicado como melhor de acordo com os índices de referência (AIC, BIC, MSE e AUC), foram fornecidos os termos de sensibilidade e especificidade. Sensibilidade refere-se à percentagem de pacientes com cancro do pulmão que resultam positiva com o ensaio, por outras palavras, a capacidade do ensaio para detectar a doença; a especificidade é a percentagem de indivíduos não-cancerosas em que o teste é negativo.

Todas as análises estatísticas multivariadas foram realizadas com o software estatístico R (Wirtschafts Universität, Wien, Áustria).

resultados

Análise de marcadores séricos em pacientes com câncer de pulmão e no controle Assuntos

as concentrações séricas, juntamente com análises estatísticas univariadas comparando grupos de controle e LC para cada um dos seis biomarcadores são apresentados na Tabela 1. aumentou significativamente as concentrações séricas de EGF (

p Art 0,001), sEGFR (

p

= 0,037) e CAL (

p Art 0,001) foram encontrados em pacientes com LC em comparação com o grupo de controlo, ao passo que sCD26 foi reduzida (

P

0,001). Curiosamente, apenas sCD26 (

p

= 0,045) e CAL níveis (

p Art 0,001) em patologias benignas conservadas diferença significativa em relação aos níveis de LC, enquanto que para EGF esta distinção não atingiu significância (

p

= 0,100).

O potencial utilidade clínica destes 6 analitos como biomarcadores para LC foi avaliada utilizando curva ROC univariada (Tabela 1). capacidade discriminatória notável foi encontrado para EGF e sCD26, com uma área sob a curva (AUC) de 0,701 e 0,711, respectivamente; CAL exibiu o perfil mais promissora, com uma AUC de 0,781.

Correlação entre os marcadores também foi avaliada revelando que várias moléculas estavam ligeiramente correlacionados uns com os outros (dados não mostrados). Apenas para sCD26 e CAL com VEGF, a correlação foi . 0,3

Análise de marcadores séricos de acordo com a

Tumor Classificação

Os níveis dos marcadores foram também analisadas em pacientes com NSCLC (89% dos casos LC) de acordo com a disseminação do tumor (Tabela 2). Entre os marcadores discriminantes significativas, os níveis de EGF e CAL já foram estatisticamente distinguível de controles saudáveis ​​e benignos nas primeiras fases I-II (

p Art 0.001 e

p

= 0,002, respectivamente). Esses marcadores também mostrou diferenças significativas entre NSCLC estádios III-IV pacientes e controles (

p

= 0,012 para EGF e

p Restaurant 0,001 para CAL), apesar de EGF exibindo notáveis ​​níveis inferiores em fases avançadas em relação às fases anteriores. Por outro lado, foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre os níveis de sCD26 em estágios iniciais e aqueles em controles (

p

= 0,116), mas eles efetivamente diferiam em estágios disseminadas em relação aos controles (

p

. 0.001)

Para os restantes marcadores, a estratificação pela extensão do tumor não resultou em diferenças com o grupo de controlo, com a única exceção de VEGF. Quando estratificado por estágio do tumor, sEGFR perdeu a sua discriminação dos controles, tanto nas primeiras fases I-II, e em estágios avançados III e IV (

p

= 0,375 para ambas as comparações). Por outro lado, para o VEGF do aumento acentuado nos seus níveis com a progressão da doença levou níveis para significativamente mais altos em estágios progressivos III-IV do que aqueles no grupo de controle (

p

= 0,028).

S2 Tabela fornece uma análise mais profunda dos níveis de marcadores em fases NSCLC individuais. Para marcadores que se mostraram discriminadores significativas entre indivíduos controle e pacientes LC globais, sCD26 e CAL mostrou uma tendência bastante homogêneo a um agravamento dos seus níveis com progressão NSCLC, que representaram a diferenciação de tarde NSCLC sobre controles no caso de sCD26. Notavelmente, a tendência para os níveis de EGF foi o oposto, com níveis em estágios avançados que se aproximam aqueles exibidos pelos indivíduos do grupo controle.

Apesar de uma análise detalhada de acordo com a extensão do tumor não era possível no grupo SCLC devido à amostra reduzida tamanho, houve uma notável diferença entre os níveis de doença limitada e estendida para HB-EGF (111.00

contra

236,00 pg /mL), EGF (78,37

contra

447,90 pg /mL) e CAL (97,32

contra

313.00 ng /mL). níveis semelhantes foram encontrados em estágios limitadas e estendidos no caso de sEGFR (41.96

contra

35,22 ng /mL), sCD26 (339,00

contra

294.00 ng /mL) e VEGF (530,82

contra

493,76 pg /mL).

a visualização gráfica dos perfis de biomarcadores individuais considerando todos os subgrupos de doentes é apresentada como box-plots na Figura 1.

Box-plots de os níveis dos seis biomarcadores candidatos nos subgrupos de soros de controles e pacientes com câncer de pulmão. As linhas horizontais representam os valores medianos.

Comparação de Biomarcadores com Demográfico Parâmetros

Os níveis de HB-EGF, EGFR, VEGF e CAL não mostraram qualquer relação com parâmetros demográficos. EGF (

p

= 0,004) e sCD26 (

p

= 0,014) os níveis variaram significativamente por sexo; Além disso, os níveis de sCD26 diminui progressivamente com a idade (

P

= 0,001). Apenas EGF correlacionada com tabagismo, com níveis notadamente superiores em fumantes (

p

= 0,011) (Tabela 3).

.

A seleção de um Multi- painel de marcadores para a detecção de Lung Cancer

Usando a dinamização e florestas aleatórias métodos, cada marcador foi classificada pela importância para a previsão de LC (Tabela 4). Ambos os métodos permitem uma classificação dos marcadores que mais contribuem para a distinção entre câncer e controles. De acordo com o método de reforço, CAL mostrou importância relativa superior, seguido de sCD26 e EGF com uma importância relativa semelhante; Floresta aleatória coincide principalmente na sua classificação. À luz destes resultados, escolheu CAL, sCD26 e EGF como os biomarcadores relevantes para a detecção de LC.

Em seguida, construímos todos os possíveis modelos de regressão logística com base em combinações destes três marcadores e sexo e idade como potenciais variáveis ​​de confusão (Tabela 5). Vários índices de desempenho foram aplicados para investigar qual o modelo se comporta melhor. Enquanto BIC é mais conservadora e identifica o modelo com CAL sozinho como do ótimo (valor mais baixo BIC), AIC identifica o modelo com três marcadores como do ótimo (ele exibe o menor valor de AIC), de acordo com o mais alto AUC e menor previsão MSE.

Classificação Algoritmo

Como derivado de índices de desempenho, um painel de marcadores valioso que pode ser útil para o diagnóstico LC foi estabelecido, constituído por CAL, sCD26 e EGF. O modelo de regressão logística associada gerado um algoritmo para estimar uma pontuação de classificação (

P

) para cada paciente, dado pela probabilidade estimada de apresentar LC, como uma função dos biomarcadores seleccionados (CAL, sCD26 e EGF), definido como se segue: Onde X

1, …, X

i são a transformada logaritmicamente (base de 10), as concentrações de marcadores, α

0 é a constante específica do modelo e α e β são os coeficientes para variáveis ​​demográficas (sexo e idade) e cada um dos biomarcadores seleccionados, respectivamente.

Desempenho de diagnóstico do painel selecionado de marcadores

Com o objetivo de estimar os parâmetros de diagnóstico do selecionado de três marcador algoritmo de classificação em nossa população de pacientes, os valores para a pontuação de classificação

p

foram gerados para os indivíduos avaliados em nosso estudo. diferentes pontos de corte para

p

com as sensibilidades e especificidades associadas foram propostos (Tabela 6). O limiar ideal para a discriminação dos cancerosos de pacientes não-cancerosos foi 0,559, o que significa que um paciente com uma pontuação mais elevada é considerado como tendo câncer de pulmão e um paciente com uma pontuação inferior a 0,559 é considerado como não tem câncer, este corte transporta uma sensibilidade de 83% e uma especificidade de 87%.

Impacto das variáveis ​​demográficas e clínicas na classificação incorreta pelo modelo de previsão

a taxa de erros de classificação geral para o painel de três marcador, para um ponto de corte fixa de 0,559, foi de 15%. Foi então realizada uma análise dos grupos individuais para avaliar o papel das variáveis ​​demográficas e clínicas sobre a classificação casos incorreto. O painel rendeu uma taxa mais elevada classificação errada dos não fumadores (26%) do que os fumantes (16%), por (pelo menos em parte) o efeito de confusão do tabagismo sobre os valores do FEG. Em relação à encenação, erros de classificação em estágios iniciais I-II foram altamente equivalentes aos apresentados em estágios avançados III-IV, 11 e 13%, respectivamente. SCLC casos foram classificados erroneamente a um grau maior, 50% (4/8 casos), que os casos de NSCLC (12%). Ao olhar exclusivamente a coorte composta por controles saudáveis, apenas um sujeito foi erroneamente classificada dos 24 testados (4%), enquanto que 6 de 32 pacientes com afecções pulmonares benignos foram erroneamente classificados (19%).

Prediction nomograma

o nomograma é uma maneira simples de interpretar um painel de marcadores multivariada e visualizar os diferentes perfis de pacientes que produzem para diferentes valores do escore de classificação associado

p

. A Fig 2 mostra um nomograma para o painel, incluindo CAL, sCD26 e níveis de EGF (log transformado). Para obter a contagem de um determinado paciente, os valores correspondentes para cada marcador estão localizados no eixo correspondente e verticalmente relacionado com o eixo “Pontos” que atribui pontos para a variável dependendo seus níveis. Note-se que CAL é o marcador associado com o maior número de pontos, o que significa que é a variável de maior importância para calcular a pontuação

p

. Uma vez calculada a contribuição em pontos de cada variável, eles são somados, e o eixo do total de pontos, em seguida, pode ser diretamente relacionado com a pontuação de classificação

p

eixo abaixo.

Multivariable modelagem de regressão logística nomograma base para definir pontuação câncer de pulmão

p

baseado em calprotectina, sCD26 e concentração EGF (log transformado), sexo e idade.

Discussão

O nosso objectivo era a identificação de marcadores séricos candidato para constituir um painel e propor um modelo de classificação para ser utilizado na população não seleccionada sintomática habitual visitar os Serviços pulmonares para a selecção desses pacientes passíveis de ser submetidas a processos de diagnóstico. Inicialmente incluímos moléculas 6:. HB-EGF, EGF, sEGFR, o VEGF, sCD26 e CAL para investigar o seu potencial como marcadores de diagnóstico in LC

sEGFR, compreendendo apenas o domínio extracelular do EGFR, é encontrado no sangue [ ,,,0],33, 34] e pode potencialmente refletir as mudanças no crescimento do tumor. Dois dos ligantes que se ligam a EGFR também foram selecionados para este estudo: EGF e HB-EGF. Ambos EGFR soro e EGF demonstrou boa capacidade diagnóstica em pacientes LC em um estudo anterior [35], enquanto o papel de HB-EGF em LC só foi avaliada em termos de resposta ao tratamento EGFR [36]. VEGF como um mediador de angiogénese [17] tem sido extensivamente avaliada como um factor de prognóstico em LC [37, 38]. sCD26, a forma solúvel da transmembrana protease de dipeptidil-peptidase IV (DPPIV) [18] é relatada em níveis baixos em malignidades sólidas [20] e é sugerido como um ensaio sensível notável para o diagnóstico precoce e rastreio de CRC [39]. A pertença à família de proteínas de ligação S100 cálcio, CAL é uma proteína imunogénica expressa abundantemente e libertada pelos fagócitos, exercendo antimicrobiana e as propriedades pró-inflamatórias [21]. Uma função no desenvolvimento do câncer tem sido sugerido, devido à sua sobre-regulação em diversos tumores, como de pulmão [22].

A partir dos nossos resultados podemos concluir que a EGF, sCD26 e CAL apresentou a maior capacidade discriminativa para malignidade pulmonar . EGF demonstrado um bom desempenho relativamente ao diagnóstico de LC com níveis significativamente aumentada em comparação com o grupo de controlo. Em um estudo anterior (Lemos

et al

. [35]), descrevemos os níveis estatisticamente mais baixos de EGF no soro de pacientes com NSCLC do que nos controles. Estes resultados são aparentemente contraditórias, devido a diferenças nos grupos de controlo e de pacientes. Aqui nós incluídos patologias benignas, e indivíduos saudáveis ​​foram os sintomáticos, enquanto no trabalho anterior eram dadores saudáveis. Além disso, o grupo do paciente no primeiro estudo incluiu pacientes com NSCLC principalmente avançados. Por outro lado, a dependência dos níveis de EGF sobre gênero e tabagismo não foi relatado neste estudo.

Os resultados referentes sCD26 no diagnóstico LC também foram promissores. O papel do CD26 na carcinogênese não é inequívoca. Por um lado, as actividades pró-oncogénicas que medeiam a metástase pulmonar são relatados [40]. Por outro lado, um papel supressor sobre o cancro do pulmão foi demonstrado [41], como re-expressão de CD26 inverteu o fenótipo maligno de células de cancro do pulmão de células não-pequenas. Em nosso estudo, sCD26 experimentou uma redução significativa do seu nível em pacientes com câncer em comparação com indivíduos controle. Essa redução já foi observado [42] e, de igual modo, uma associação com maior idade e os níveis de sCD26 inferiores foi encontrado; Além disso, um decréscimo significativo na actividade de DPPIV com a idade numa população de indivíduos saudáveis ​​tinham sido anteriormente descrito [43]. De Chiara

et al

. [44] sCD26 no soro medidos em um grande coorte e relataram níveis médios globais de 522 ng /mL (intervalo de 118-3062), de acordo com os níveis de nossa coorte de controlo. Da mesma forma, eles observaram-se concentrações ligeiramente maior em mulheres e uma redução mínima dos níveis ao longo de décadas.

CAL refere-se ao heterodímero formado pelas proteínas S100A8 e S100A9, e é um mediador de diversos processos de inflamação crónica dentro sendo níveis elevados característico para as condições inflamatórias. A expressão diferencial de CAL foi mostrado para representar um passo importante contribuindo para o desenvolvimento e progressão do cancro em neoplasias da bexiga, da pele, da mama, gástrico, colorectal, pulmão, pâncreas, próstata e carcinomas esofágicos escamosas [21, 22].

em um trabalho anterior, uma alta precisão de CAL para predizer malignidade em pacientes com derrame pleural exsudativa foi demonstrado [45]. níveis de CAL em LC causando derrame (255,4 ng /ml) foram semelhantes aos que aqui relatada no soro. Em contraste, os níveis médios mais elevados em derrames pleurais benignas (2,627.1 ng /ml) foram encontrados em comparação com os níveis médios em soros (141,93 ng /ml), evidenciando a diferente natureza dos fluidos analisados. Uma expressão forte de tecido S100A8 e S100A9 em doença dos pulmões em comparação com os tecidos do pulmão e periféricas adjacentes benignos foi reportada [46], de acordo com os nossos dados.

Um dos principais requisitos de um marcador tumoral é a sua capacidade de detectar a doença em estágios iniciais. níveis de EGF e CAL já estão alterados nas fases I-II de NSCLC em comparação aos controles, enquanto a sCD26 apresentou um decréscimo acentuado, embora não significativa. análise similar em pacientes com CPPC não pôde ser executada devido ao baixo número de indivíduos; no entanto, os pacientes com doença limitada apresentaram níveis de EGF e CAL inferiores aos do grupo de controle que poderiam indicar algum grau de dificuldade em classificar esses pacientes. No geral, estes resultados sugerem a utilidade do painel em campanhas de rastreio. Este fato evidencia a principal limitação do nosso estudo, o tamanho relativamente pequeno do nosso coorte que impede comparações como o já mencionado, garantindo novos estudos de grande escala para validar esses achados. O mesmo se aplica para a produção do modelo de classificação, embora neste caso os procedimentos estatísticos em ambos os passos foram repetidos 1000 vezes e parâmetros resultantes em média, o que evita sobreavaliação e assegura a reprodutibilidade do modelo em populações futuras.

Para chegar a um algoritmo de classificação clinicamente significativo para LC com base em marcadores mais discriminativos uma estratégia estatística em duas etapas foi realizada. O reforço e métodos florestais aleatórios permitir a classificação de biomarcadores de acordo com os índices de importância de variáveis ​​relativas com base na influência relativa média em todas as árvores geradas [32]. Ambos, impulsionando e métodos Floresta aleatória, confirmou a superioridade do CAL, sCD26 e EGF. Num segundo passo, o painel de biomarcadores foi usada para ajustar modelos de regressão logística para derivar um (ideal) regra de classificação para a atribuição de diagnóstico de um paciente. De acordo com índices de desempenho aplicados, o painel incluindo CAL, sCD26 e EGF foi estabelecido como o mais informativo. O modelo incluiu sexo e idade para corrigir o efeito de confusão, especialmente no caso de sCD26, cujos níveis são influenciados pela idade. Desde fumar dados estão em falta para alguns indivíduos esta variável não poderiam ser considerados na análise.

Deve-se notar a força de CAL tanto em modelos de regressão univariada, em que o preferido é aquele incluindo CAL sozinho, e considerando a combinação de marcadores, reforçando CAL como o biomarcador mais importante para o diagnóstico LC.

Aplicabilidade do algoritmo correspondente permite a obtenção de um resultado através da introdução no modelo as do paciente concentrações próprio marcador. Se o resultante

p

pontuação é maior do que o ponto de corte fixo, o indivíduo vai ser classificados como tendo LC com uma sensibilidade e especificidade em relação a este corte. Além disso, nós fornecemos uma representação nomograma do modelo multivariada ideal para uma melhor interpretação do sistema de pontuação, permitindo verificar a combinação possível de valores dos biomarcadores que estão associados com um valor específico da pontuação

p

.

O painel de três marcador mostrou uma taxa de erro de classificação global de 15%. Dentro dos erros de classificação, Quimioterapia era a histologia mais frequentemente misclassified, mas o número de pacientes é muito pequeno para extrair uma conclusão definitiva.