Abstract

microRNAs (miRs) ajustar os níveis de mRNAs e proteínas expressão e pode, assim, contribuir para a iniciação e progressão do câncer . Para além da sua função intracelular, miRs são libertados a partir de células e libertar-se na circulação. Nós postulamos que miRs circulam poderia fornecer informações sobre percursos alterados durante a progressão do câncer e pode indicar as respostas ao tratamento. Aqui vamos nos concentrar na progressão maligna do cancro do pâncreas. Nós relatamos que as mudanças nos padrões de expressão de miR durante a progressão de tecidos normais para invasivo adenocarcinoma do pâncreas na p48-Cre /LSL-Kras

modelo do rato G12D espelha as mudanças miR observados em tecidos de câncer pancreático humano. Foram encontrados miR-148a /b e miR-375 expressão diminuído, enquanto que o miR-10, o miR-21, o miR-100 e miR-155 foram aumentados quando se comparam os tecidos normais, e lesões pré-malignas de carcinoma invasivo no modelo de ratinho. do alvo para ARNm de FGFR1 (miR-10) e MLH1 (miR-155) foram encontrados regulados negativamente. A determinação quantitativa dos nove microARNs em amostras de plasma de pacientes com cancros pancreáticos distinguido de outros tipos de cancro, bem como doença pancreática não-cancerosas. Finalmente, o tratamento gemcitabina de animais de controlo e p48-Cre /LSL-Kras

G12D animais com câncer pancreático causado distinta e até mudanças de 60 vezes em miRs que indicam efeitos de drogas diferenciais em tecidos normais e cancerígenas circulantes. Estes resultados suportam a importância da detecção miRs na circulação e sugere que miRs circulam poderia servir como indicadores de resposta à droga

Citation:. LaConti JJ, Shivapurkar N, Preet A, Deslattes Mays A, Peran I, Kim SE , et ai. (2011) Tecidos e microRNAs Serum no Kras

G12D modelo animal transgénico e em doentes com cancro do pâncreas. PLoS ONE 6 (6): e20687. doi: 10.1371 /journal.pone.0020687

editor: Janine Santos, da Universidade de Medicina e Odontologia de New Jersey, Estados Unidos da América

Recebido: 20 Janeiro, 2011; Aceito: 06 de maio de 2011; Publicado: 27 Junho 2011 |

Direitos de autor: © 2011 LaConti et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiado em parte pelo National Institutes of Health conceder CA108440 (AW), US DOD CDMRP (JJL), o Cancer Center Lombardi (NS), a Fundação Gordon (AW), a Fundação Lustgarten (ATR) eo Centro Ruesch (JLM e AW). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

microRNAs (miRNAs ou miRs) são pequenos RNAs não-codificantes, que desempenham um papel significativo no controle das atividades das vias celulares, tanto em fisiologia e patologia (ver por exemplo [1]). A função distinta de miRs em diferentes cancros tornou-se mais evidentes ao longo dos últimos anos [2], [3], e muitos estudos mostram que as assinaturas miR pode ser utilizado para distinguir diferentes tipos de cancro [4], [5], [6], [7] prognósticos [8], [9], [10], [11], [12], [13] ou revelam alvos potenciais [14], bem como as vias de sinalização alterados [15]. Mais surpreendentemente, a comparação de perfis de Mir e ARNm de lesões de cancro primário e metastático mostrou que miRs fornecida uma assinatura mais fiável e distinto do que mRNAs e descobriram que as assinaturas miR foram superiores aos mRNAs na identificação da fonte de órgãos de metástases de origem desconhecida [16] , [17]. Para além destas análises de tecidos normais e doentes, relatórios mais recentes têm mostrado que as espécies miR pode ser detectado na circulação [18] e sugeriram que a análise de amostras de soro para as espécies de miR definidos pode ser utilizada para identificar pacientes com cancros [19], [ ,,,0],20], [21], [22], [23], [24], [25], bem como outras doenças tais como a doença cardíaca [26], [27], [28], [29], [30] ou diabetes mellitus [31].

As sequências de miRs são frequentemente conservada entre espécies e nós especulamos que a análise de miRs em um modelo animal bem definido poderia informar estudos com amostras de pacientes. Estamos particularmente interessados ​​para avaliar se esta podia ser traduzida para a detecção e quantificação de miRs na circulação, pois que pode em última análise, revelam activado ou alteração nas vias de doença com base na análise de uma amostra de sangue, em vez de a análise do espécime de tecido doentes [32] . Além disso, os tratamentos, provavelmente, impacto padrões miR na circulação e esses padrões podem ser úteis na criação de assinaturas dos efeitos de drogas.

Aqui nós nos concentramos em câncer pancreático, que foi diagnosticado em 43.140 pacientes em 2010. O câncer de pâncreas é uma doença fatal, com uma taxa de sobrevivência de 5 anos de apenas 6% [33]. Este resultado é pobre devido à detecção final, bem como a falta de terapias eficazes [34]. Para identificar informativo miRs, foi utilizado um modelo de rato geneticamente modificado, o p48-Cre /LSL-Kras

modelo G12D, que foi primeiramente descrita por Hingorani

et al.

[35]. Este modelo reproduz fielmente a progressão maligna visto no desenvolvimento PDAC humana [34], [35] e numerosos estudos com este modelo estreitou para baixo as células de origem de PDAC [36] e mostrou a contribuição de genes de driver diferentes [37], [38 ], [39], que controlam a biologia e progressão desta doença [40]. Foram utilizados tecidos colhidos em diferentes estádios de progressão maligna do presente modelo de murganho para avaliar um painel de miRs que tinha sido mostrado para ser para cima ou para baixo regulados positivamente em tecidos de cancro pancreático humano e que tinha sido recentemente revista e compilado por Seux e colegas [41 ]. Esta análise foi então seguido por quantificação de miRs na circulação de pacientes com cancros pancreáticos ou controlos e outros e que encontraram padrões de expressão de miR que distinguem entre os diferentes grupos. padrões de expressão de miR no soro dos animais experimentais em paralelo os resultados em pacientes. Finalmente, o tratamento de animais com a gemcitabina de drogas anti-câncer que está aprovado para tratamento de primeira linha de câncer pancreático [42], mostrou uma mudança padrão distinto nos níveis de miR na circulação de animais com câncer no pâncreas em comparação com controlos.

resultados de

expressão microRNA em tecidos pancreáticos durante Kras

G12D-induzida progressão maligna

Um painel de miRs consistentemente para cima ou para baixo-regulado através de diferentes estudos em tecidos de câncer de pâncreas humanos em relação ao tecidos pancreáticos normais foi selecionado a partir de pesquisas bibliográficas e de base de dados (ver Tabela S1; Refs [7], [41], [43], [44], [45]). Para este painel miR nós estabelecemos a detecção quantitativa de RT-PCR [46], porque se esperava uma grande gama de concentrações de miR quando se comparam extractos de tecidos em comparação com as amostras de sangue ou amostras através de murino e humano.

Amostras de tecido pancreático

de ratinho foram colhidos em diferentes idades do modelo do rato p48-Cre /LSL-Kras

G12D. Pâncreas epitélios conduta nesses animais progredir através das lesões displásicas precoces e tardias, PanIN (= pâncreas carcinoma in situ) durante o período de vários meses para câncer invasivo e progressão maligna, assim, mímica da doença humana [34], [35]. Cada amostra de tecido foi colhido encenada através de uma análise histológica de alterações do ducto pancreático (Figura 1A). Os tecidos de controlo continha 100% de pâncreas normal (Figura 1B). Pâncreas de ratos mais jovens (Figura 1C) continha mais de 50% de condutas com lesões displásicas nas fases iniciais (PanIN-1 ou -2). Pâncreas de ratinhos mais velhos (Figura 1D) continha ~ 10% de condutas com lesões displásicas fase tardia (pancreáticas intraepiteliais-3), além de ~ 50% de condutas com PanIN-1 ou -2. tecidos PDAC contido adenocarcinoma principalmente invasiva (Figura 1E).

(A) A quantificação de alterações histopatológicas no pâncreas de controles ou p48-Cre /Kras

camundongos G12D. As amostras foram separadas em controles, lesões displásicas fase precoce (PanIN-1 e -2), lesões displásicas fase tardia (PanIN-3 presentes) e invasivo adenocarcinoma do ducto pancreático (PDAC). (B a E) imagens de histopatologia representante de cada um dos seguintes grupos: (B) pâncreas normal, (C) PanIN-1 e -2 (cedo), (D) PanIN-3 (final) e (E) PDAC. Média ± erro padrão da% do tecido pancreático com os respectivos lesões é mostrado (n = 3 animais para cada grupo). 0, não detectado

A análise da expressão de miRs individuais revelou três principais tendências (Figura 2A-C):. Em primeiro lugar, a expressão de miR-10, o miR-16, o miR-21, miR- 100 e miR-155 aumentou nas primeiras lesões pancreáticas intraepiteliais em relação ao controlo, e mantidas expressão elevada no final dos tecidos pancreáticas intraepiteliais e adenocarcinoma. (Figura 2A) Em segundo lugar, o miR-22, o miR-148a /b, o miR-212 e miR-375 foram altamente expresso em tecidos de controlo e a sua expressão foi reduzido em PanIN (Figura 2C), bem como em tecidos de adenocarcinoma. Em terceiro lugar, a expressão de miR-29b, o miR-34a /c, de miR-141, o miR-199, miR-210c e miR-301a não se alterou significativamente durante a progressão maligna (Figura 2B).

(A- C) Os níveis de expressão de miRs individuais no controle e os tecidos pancreáticos em diferentes fases de transformação maligna. Os níveis MIRs foram agrupados como aumentando (A), estável (B), ou diminuindo (C) com base numa comparação dos níveis em cada grupo (n = 3 por grupo). Média ± erro padrão mostrado é para cada expressão miR. (D) de agrupamento hierárquico de tecidos de camundongos com base na expressão de miR. grupos distintos são indicados pelo azul e da caixa amarela. (E) de agrupamento hierárquico de miRs com base em seus níveis de expressão. miRs que foram expressos em níveis elevados no controle (caixa azul) versus tecidos PDAC (casa amarela) são indicados. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001; controle vs. início PanIN, tarde PanIN ou PDAC. #: Au 0,85 e p = 0,06, ##: au 0,85 e p 0,05, ###: au 0,90 e p 0,01. (Au, a probabilidade de aproximadamente imparcial).

agrupamento distinto dos miRs e dos tecidos pancreáticos com diferentes estágios da doença

Um agrupamento sem supervisão dos tecidos de camundongos com base em seus níveis de expressão de miR identificou três grupos distintos (Figura 2D). Os tecidos de controle separados de todos os outros tecidos em um agrupamento de sua própria (caixa azul). Cinco dos seis tecidos classificadas como em lesões in situ (PanIN) foram agrupados em conjunto num segundo grupo. adenocarcinoma invasivo e um dos tecidos segregados final pancreáticas intraepiteliais em mais um conjunto (caixa amarela). Assim, o conjunto de miRs analisado aqui é suficiente para distinguir as diferentes fases de mutantes Kras induzida progressão maligna do pâncreas.

agrupamento não supervisionada dos miRs individuais foi realizada para determinar quais miRs comportar em paralelo e pode, assim, servir como assinaturas comuns coincidentes com o estágio da doença (Figura 2E). Um grupo (caixa amarela) continha essas miRs que mostraram a expressão mais elevada nos tecidos de adenocarcinoma e o menor nos tecidos de controle. Um grupo separado (caixa azul) mostrou um padrão recíproco expressão miR, com os níveis mais altos em tecidos de controle e os níveis mais baixos em adenocarcinoma. Estes agrupamentos sugerem que um subconjunto de miRs pode definir a classificação de um tecido corroborando trabalhos anteriores de outros com amostras cancerosas humanas diferentes [16], [17].

Uma comparação dos resultados no modelo do rato (Figura 1 2) com estudos publicados em cancros pancreáticos humanos mostra as mesmas mudanças qualitativas para mais de doze miRs analisadas em ambas as configurações (Tabela S1; Refs [7], [43], [44], [45]): Sete miRs regulada em cancro contra tecidos normais no modelo de ratinho também foram regulados positivamente em cancros humanos. De cinco miRs encontrados reprimidos no modelo de rato, quatro também foram reprimidos ou não mostraram nenhuma mudança em estudos com amostras humanas. Apenas miR-212 foi regulada em humanos e reprimidos em amostras do mouse PDAC. É tentador especular que a discordância de miR-212 entre amostras humanas e mouse PDAC pode indicar espécies diferenças de interações epitélio-estroma durante a progressão maligna [47]. No geral, a estreita coincidência de miR muda em tecidos pancreáticos malignos entre espécies e entre diferentes estudos sugere que adenocarcinoma do pâncreas clínica está bem representada pela p48-Cre /LSL-Kras

modelo G12D animal.

A expressão de genes-alvo mir e miRs rato em tecidos pancreáticos

estudos recentes têm mostrado que a actividade predominante de miRs (84%) é o seu impacto no ARNm alvo níveis de estado estacionário [48]. Para assss isso no modelo de rato, identificamos alvos de RNAm candidatos a partir de uma lista imparcial de sub-expressos mRNAs em cancros pancreáticos humanos e combinou-as com o painel de miR estudo (Tabela S3). O conjunto de genes regulados negativamente em câncer pancreático correspondência contém MLH1 como um alvo previsto para miR-155, e FGFR1 como alvo de miR-10. Numa comparação de tecidos normais e cancerosas recolhidas a partir da expressão de ARNm de modelos de ratinho de MLH1 e de FGFR1 mostrou uma relação significativa, inverse miR-155 e miR-10, respectivamente (Figura 3).

Os tecidos de P48-Cre /Kras

ratinhos G12D com invasivo ductal adenocarcinoma pancreático (PDAC) e os pâncreas normal foram analisadas para expressão de miR-10 e miR-155 em relação aos respectivos mRNAs alvo candidatos, FGFR1 e MLH1, utilizando RT-PCR quantitativo. Média ± SEM de n = 3, em cada grupo; *** P 0,001 normal versus câncer

efeito do tratamento gemcitabina em circulação miRs no modelo animal

A presença de tecidos doentes pode ser indicado por concentraions miR alterada no. circulação (ver Introdução). Como uma extensão lógica, as concentrações de miR na circulação também poderia servir como marcadores de fácil acesso de eficácia do tratamento e até mesmo indicar caminhos alterados por um determinado tratamento. Testamos esta hipótese no modelo do rato PDAC em relação aos animais controle, sem câncer. A gemcitabina é um fármaco de primeira linha utilizados no tratamento de doentes com cancro do pâncreas e foi administrada durante uma semana para animais com PDAC e para os animais de controlo da mesma idade. O esquema de doses e tratamento foram adaptados de outros estudos que mostraram eficácia ao longo de um período de tratamento mais longo [49], [50]. Uma amostra de sangue pequeno ( 0,1 ml) foram colhidas antes do início do tratamento para comparar os níveis séricos de miR antes e depois do tratamento entre estes dois grupos de animais. A presença de PDAC nas P48-Cre /Kras

G12D animais foi confirmada por análise histológica dos tecidos pancreáticos no final do estudo. Foram selecionados seis miRs que foram encontrados upregulated e dois que foram regulados em tecidos PDAC em relação aos controles (ver Figura 2). A intervalo de concentração de 10000 vezes destas oito miRs foi encontrada na circulação dos animais (Figura 4A). Antes do tratamento (Figura 4A, barras em branco), os níveis séricos de miR-10 e miR-155 foram elevadas 2 vezes (p 0,05) no PDAC (vermelho) versus o grupo de controlo (preto). Em contraste, os níveis séricos de miR-21, o miR-148b e miR-375, onde indistinguíveis entre os grupos. a gemcitabina (Figura 4A, barras a cheio) reduziu os níveis séricos de miR-10, o miR-21 e miR-155 em animais com PDAC e em controlos por 6 a 60 vezes (p 0,05 a 0,01; Figura 4B) . Os níveis séricos de miR-100 e miR-375 foram reduzidos em 2 vezes após o tratamento, embora só as controlos mostraram diferenças estatisticamente significativas (p 0,05). Os níveis séricos de miR-148b não foi alterada pelo tratamento e miR-16 os níveis de aumento 5 vezes após o tratamento. É digno de nota que o tratamento de animais com gemcitabina níveis séricos PDAC reduzida de miR-21, 10-miR-155 e miR por um 2-, 3- e 6-vezes adicionais que se seguem a redução observada em animais de controlo, embora apenas o miR- 155 atingiu significância estatística na comparação de PDAC e de controlo (Figura 4B; p 0,05). Estes dados sugerem que a monitorização miRs adequadas na circulação pode distinguir os efeitos da droga em tecidos doentes a partir dos efeitos de drogas sobre os tecidos não-alvo saudáveis.

(A) miR-níveis em amostras de soro colhidas antes (barras abertas) e depois de um tratamento de uma semana com gemcitabina (5 doses de 40 mg /kg). (B) Rácio das concentrações séricas antes /depois do tratamento gemcitabina. A linha a ponteado indica uma diferença de duas vezes. *, P 0,05; ** P . 0,01

miRs na circulação de pacientes com cancros pancreáticos e outros

Nove miRs diferentes foram isolados e quantificados a partir de amostras de plasma de pacientes com câncer de pâncreas, outra cancros gastrointestinais, e controles não-cancerosas. Os diagnósticos dos doentes estão resumidos na Tabela S2. miR-100a e miR-10 foram significativamente aumentados nos pacientes com câncer pancreático em comparação com controles não-cancerosas, enquanto uma série de outros miRs (MIR-16, 21, 155, 199, 221, e 223) mostrou uma tendência de aumento da expressão que não atingiram significância estatística (Figura 5A). Outro subconjunto de miRs mostraram diferenças de expressão significativas entre câncer de pâncreas e pacientes com câncer de cólon, mas não em relação aos pacientes com outros cancros gastrointestinais. Os padrões das diferentes miRs circulam expressão sugerem que alguns são melhores em distinguir entre pacientes com câncer e não-cancerosas, enquanto outros melhores distinguem os órgãos doentes.

As amostras eram de pacientes com câncer de pâncreas, controles não-câncer e pacientes com outros cancros gastrointestinais. (A) As concentrações de nove miRs detectadas na circulação mostrar diferenças individuais entre grupos de pacientes. Observe os diferentes intervalos das escalas nos eixos Y. (B) Análise Floresta aleatória Unsupervised comparando câncer pancreático (círculos pretos) versus controles não-cancerosas com doença pancreática (triângulo branco), os controles não-cancerosas sem doença pancreática (círculos brancos), o câncer superior GI (círculos azuis), cancros do cólon ( círculos vermelhos), e cancros do fígado (círculos amarelos). Circulado em vermelho são a maioria dos cânceres de pâncreas. As setas indicam dois espécimes de pacientes com cancro do duodeno. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001. As características dos pacientes são fornecidos na Tabela S2.

Numa análise floresta aleatória sem supervisão que considerada a expressão de todos os nove miRs isolados a partir da circulação, cinco dos seis doentes com cancro pancreático agrupados num grupo separado do maioria dos outros pacientes (Figura 5B). Isso confirma que o padrão de expressão combinada destes nove miRs na circulação foi suficiente para identificar pacientes com câncer de pâncreas como separado de pacientes com outros tipos de câncer e controles GI. Destacam-se duas amostras de doentes com neoplasias duodenais (setas) que agrupavam mais próximo de pacientes com câncer pancreático, possivelmente devido ao envolvimento pancreático não detectados no momento da amostragem. Além disso, a partir de amostras de pacientes com doença pancreática não-cancerosas e não cancerosas controlos agrupadas indicando que o painel de expressão miR é específico para o cancro do pâncreas, em vez de qualquer doença de origem a partir do pâncreas.

Discussão

O mutante Kras

G12D-driven modelo de cancro pancreático foi bem caracterizada em vários níveis moleculares e biológicas [35], [36], [37], [38], [39]. A análise de amostras de tecido que mostra algumas alterações miR associados com cancro do pâncreas invasivo já está aparente durante as primeiras fases da doença (Figura 2). Mais surpreendente foi a extensão em que mudanças na expressão de miR no modelo animal imitou mudanças de expressão de miR observados no cancro pancreático humano (ver Tabela S1). Com efeito, um subconjunto de miRs que inclui o miR-10 e miR-155 foram regulados positivamente em tecidos de cancro pancreático de doentes e ratinhos, assim como nas respectivas amostras de sangue. Assim, este estudo fornece evidências de que a semelhança entre espécies de expressão de miR no contexto do câncer de pâncreas é relativamente conservado, muito provavelmente devido a Kras mutante como um grande iniciador desta malignidade [42].

O comparativa análise da expressão de miR durante a progressão maligna no modelo do rato nos permite tirar algumas conclusões sobre miRs relevantes na circulação que podem indicar a presença de lesões precursoras. Habbe et ai. [51] relataram sobre os níveis de expressão de miRs em humanos intraductais papilares neoplasmas mucinosos tecidos (IPMN), e concluíram que o miR-155 é regulada positivamente e um possível biomarcador tecido de doença pré-invasiva. Encontrámos miR-155 para ser regulada positivamente nos conjuntos que contêm lesões pancreáticas intraepiteliais no modelo de ratinho e também encontrou o miR-155 sobre-regulada em amostras de plasma de doentes com cancro pancreático. Outros estudos que avaliaram a circular conclusões semelhantes miR-21, miR-210, miR-155 e miR-196a em diferentes conjuntos de pacientes com câncer pancreático foram desenhadas sobre o potencial diagnóstico de miRs [52]. IPMN, mucinoso neoplasia cística (MCN) e PanIN representam três lesões precursoras conhecidas de PDAC. Estes três tipos de premalignancies têm muitas semelhanças genéticas e patológicas, mas também algumas características que permitem diferenciá-los [53]. Nossos resultados suportam a hipótese de que os níveis plasmáticos de miR-155 pode realmente representar um biomarcador que indica a presença de lesões pancreáticas intraepiteliais.

miR semelhantes muda em tecidos e na circulação sugerem-nos que miRs são liberados a partir de tecidos doentes de uma maneira contínua, possivelmente através de exossomas [54], [55], embora possa haver mecanismos de libertação específicos que podem favorecer alguns miRs sobre os outros [56]. Aqui nós principalmente focados no miRs que são elevados em tecidos doentes em vez do que aqueles cuja expressão é reduzida ou perdida. Nós fundamentado que a perda de uma dada miR única terá um impacto sobre os níveis de estado estacionário na prática, se o órgão doente é a principal fonte do miR presente na circulação. Por exemplo. miR-148a /b e miR-375 são reprimidos fortemente no câncer de pâncreas em relação aos tecidos pancreáticos normais. miR-375 tem mostrado desempenhar um papel importante no desenvolvimento dos ilhéus pancreáticos [57], e da função, bem como na manutenção da homeostase da glucose [58], [59] e é de notar que um sintoma precoce de PDAC pode ser adulto diabetes mellitus do início. miR-148 pode reprimir a expressão de DNMT3B através de uma região na sua sequência de codificação [60] e pode, portanto, influenciar os mecanismos de reparação de ADN

Apesar de a . redução de 100 vezes de miR-375 e miR-148a /b durante a transformação maligna de tecidos pancreáticos, é surpreendente que seus níveis séricos não são reduzidos em animais com PDAC (veja a Figura 2C e 4A). Isto sugere que a contribuição do pâncreas aos seus níveis séricos só é pequena. Isto é provavelmente verdade também para miR-21, onde os aumentos dos níveis de 100 vezes durante a transformação maligna de pâncreas no modelo animal não são reflectidas nos níveis séricos aumentados (ver Figura 2A e 4A). Em contraste, o miR-10 e miR-155 níveis no soro são aumentados durante a transformação maligna do pâncreas em ratos e em doentes que apoiam a noção de que o órgão doente é um contribuinte significativo para os níveis séricos destes miRs (ver Figura 4A e 5A).

estudos recentes do laboratório Bartel demonstraram que a actividade predominante de miRs é para diminuir os níveis de ARNm alvo e verificou que mais de 84% de miR efeitos sobre a produção da proteína são, devido a este esgotamento do alvo ARNm [48]. Assim, miRs que são regulados positivamente na circulação de indivíduos doentes podem coincidir com os níveis reduzidos de ARNm alvo no tecido doente de origem. Nós ainda mais a hipótese de que miRs encontrada para ser aumentada na circulação de pacientes pode estar presente em níveis muito mais elevados nos doentes tisses devido à diluição sobre a sua clivagem para a corrente sanguínea. Nós identificamos alvos de RNAm candidatos e uma lista imparcial de mRNAs expressa-abrigo de câncer pancreático contra tecidos normais compilados a partir de diferentes estudos retornou 154 mRNAs que poderia ser câncer metas relevantes miR. Estes foram combinados com o painel de miR estudo (Tabela S3).

O conjunto de genes devolvidos a partir desta análise contém

MLH1

previsto como um alvo para miR-155. De facto, a sobre-expressão de miR-155 em linhas celulares resultou numa regulação negativa do hMSH2, hMSH6, e hMLH1. Além disso, uma correlação inversa entre os níveis de miR-155 e proteínas MLH1 ou MSH2 expressão foi relatada para cancros colorrectais humanos [61]. MLH1 é uma proteína de reparação de mis-jogo que contribui para a acumulação de erros genéticos no contexto de cancro do pâncreas e familiar alguns casos esporádicos [34]. Seu mRNA foi encontrado regulados negativamente em amostras de cancro do pâncreas e uma fracção de a perda da expressão de ARNm MLH1 em cancros pancreáticos tem sido atribuída a hipermetilação do promotor [62]. Observou-se uma relação inversa significativa entre a expressão de miR-155 e ARNm MLH1 na comparação de tecidos normais e de cancro (Figura 3A). Além disso, o ARNm de FGFR1 foi encontrado regulada negativamente no adenocarcinoma pancreático humano (Tabela S3) e observou-se uma regulação negativa significativa no modelo de rato PDAC em relação aos tecidos normais (Figura 3B). Estes achados com miR-10 e miR-155 e seu alvo previsto mRNAs MLH1 e FGFR1 apoiar a noção de um potencial função reguladora desses miRs durante progressão maligna.

Em uma nova série de estudos com animais com potencial clínico directo aplicação, nós testamos se miRs pode indicar a eficácia da droga. A gama de concentrações circulantes de miRs monitoradas Nesse experiências é 10000 vezes e o impacto do tratamento com drogas não estava relacionado com a concentração de pré-tratamento dos oito miRs monitorados (Figura 4A). Após o tratamento gemcitabina miR-16 foi encontrado um aumento no soro de 5-vezes na PDAC, bem como animais de controlo. expressão de miR-16 está associada a apoptose [63], a supressão do crescimento através de p53 [64] e supressão de tumor [65]. O aumento desta miR-16 nos animais de cancro e de controlo de circulação coincide com a actividade citotóxica do fármaco em tecidos saudáveis. Em contraste com este aumento, os níveis séricos de miR-148b não foram afectados após o tratamento da toxicodependência e soro de miR-10 e miR-155 foram reduzidos a (-dobra 60 e 30-) mais após o tratamento com gemcitabina. Estes dois miRs tinham sido encontrados elevados no soro de animais PDAC relativos aos controlos antes do início do tratamento medicamentoso. Além disso, os níveis séricos de miR-10 e miR-155 em animais tratados com PDAC caiu abaixo dos níveis de soro de animais de controlo tratados (Figura 4A B), sugerindo-los como potenciais indicadores de efeitos específicos de tumor do tratamento. No geral, os resultados neste cenário experimental apoiar o conceito de um câncer pancreático eficácia seletiva de gemcitabina embora os efeitos sobre a homeostase de outros tecidos saudáveis ​​também se tornou aparente.

Conclusão

miR muda em tecidos e a circulação mostram notáveis ​​similaridades entre o câncer de pâncreas em pacientes e do p48-Cre /Kras

modelo do rato G12D da doença. Além do mimcry de patologia molecular humana no modelo de rato, os miRs assinatura identificados aqui podem também servir como indicadores informativos de eficácia da droga no desenvolvimento do agente ou combinação de terapias individuais desesperadamente necessários [42] desta doença devastadora.

Materiais e Métodos

mouse análise de tecido

protocolos de estudo em animais foram aprovados pelo animal Care Universidade de Georgetown e Use Committee (GUACUC # 08-028). A p48-Cre /LSL-Kras

modelo do rato G12D foi descrito anteriormente [35]. No controlo, no final e PanIN grupos adenocarcinoma, os ratinhos foram sacrificados aos 16 meses de idade. Controles faltava tanto o G12D KRAS

ou o alelo p48-CRE. Para o grupo PanIN cedo, os ratos em um mês de idade foram tratados com caerulin e sacrificados em quatro meses de idade na sequência de um protocolo estabelecido [66]. Pâncreas foi cortada a partir da cauda para a cabeça com um meio fixo em formalina e a outra metade congelados em azoto líquido. Um patologista marcou o mais alto grau PanIN per lóbulo de todos os lóbulos contados em um H representante E de slides de pâncreas de cada rato [35] manchada. “Normal” inclui qualquer mudança normal e reativa ductal. PanIN-1 e -2 foram combinadas em uma única categoria de “primeiros” lesões enquanto os tecidos com PanIN-3 foram incluídos em uma categoria separada de lesões “tardia” devido à alta probabilidade de progressão maligna.

miR e a expressão do mRNA no tecido pancreático do rato

o ARN total foi extraído a partir de tecidos usando o reagente TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) como descrito pelo fabricante. miRs foram ainda isolado a partir do ARN total utilizando um kit de isolamento de miR (SA Biosciences, Frederick, MD). O MIR foi convertido em ADNc, utilizando poliA rejeito seguido por iniciação universal com o Kit de miR First Strand e quantificada utilizando pré-concebido miR qPCR específica (SA Biosciences, Frederick, MD) em um sistema de HT PCR em tempo real ABI 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA). A quantificação de ARNm foi descrito em [46]. Em resumo, o cDNA foi sintetizado usando a ARN total extraído e o Kit de Síntese de ADNc iScript, de acordo com o protocolo do fabricante (Bio-Rad Laboratories). qRT-PCR foi realizada utilizando o IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories) numa iCycler (BioRad) com: 95 ° C durante 3 min seguido de 40 ciclos (95 ° C durante 20 seg, 60 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 40 seg) e passo curva de fusão (95 ° C durante 1 min, 55 ° C durante 1 min, aumento do gradiente de temperatura de 50 ° C de 0,5 ° C por 10 segundos nos 80 ciclos seguintes). MLH1 iniciador directo: GCGGCACCCACTTCCAGTCC; reversa: CGGAGAGTCTCATGGCACCGC. FGFR1 iniciador directo: GTAGCTCCCTACTGGACATCC; iniciador inverso:. GCATAGCGAACCTTGTAGCCTC

miR detecção e quantificação, em amostras de sangue humano e de rato

amostras de sangue humano foram obtidos a partir da biorrepositório da Cancer Center Lombardi que recolhe amostras de câncer e não-câncer anónimos pacientes para fins de investigação. Os dados foram analisados ​​de forma anónima. Rato sangue ( 0,1 ml) foi recolhido por meio de hemorragia submandibular usando uma lanceta [67]. As amostras de soro ou de plasma foram misturados numa proporção de 1:10 com Qiazol reagente de lise e vortex. O lisado foi extraída com CHCI3 e a fase aquosa foi ainda processado para o ARN total usando o miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) e enriquecido por miARN utilizando o kit de isolamento de RT2 qPCR-Grau miARN, MA-01 (SABiosciences).

tratamento gemcitabina de animais

a gemcitabina foi obtido a partir da farmácia hospitalar e administradas a 22-23 meses de idade p48-Cre /Kras

G12D ou idade correspondida animais de controle em 40 mg /kg de 5 doses ao longo de uma semana. Esta dose de 200 mg /kg /semana foi baseado em refs. [49], [50]. O sangue foi colhido antes do início do tratamento ( 0,1 ml) e um dia depois da última dose. A presença de PDAC foi confirmado no G12D p48-Cre /Kras

por análise histológica postmortem

A análise dos dados

Os métodos de processamento de dados foram codificados em R (http: //www. .r-project.org). agrupamento hierárquico foi realizada com base na média centrado e escalado níveis de expressão de miR.