Abstract

As linhas de células LNCaP e C4-2B formar um excelente modelo pré-clínico para estudar o desenvolvimento de metastático resistente à castração cancro da próstata, uma vez que as células C4-2B foram derivadas de uma metástase óssea que cresceram em ratos nus após a inoculação com as células, C4-2 resistente à castração derivado de LNCaP. Exome sequenciação detectada 2188 e 3840 de mutações em células LNCaP e C4-2B, respectivamente, dos quais 1784 foram encontrados em ambas as linhas celulares. Surpreendentemente, as células LNCaP parentais têm mais de 400 mutações que não foram encontrados no genoma C4-2B. Mais de metade das mutações encontradas no exomes foram confirmadas por análise dos dados de ARN-SEQ, e observou-se que os genes expressos são mais propensas a mutações do que os genes que não são expressos. Os transcriptomes também revelou que 457 genes mostram aumento da expressão e 246 genes mostram diminuição da expressão em C4-2B comparação com células LNCaP. Ao combinar a lista de mutações específicas do C4-2B com a lista de genes diferencialmente expressos, detectamos mudanças importantes na adesão e dos receptores ECM vias de interação focais. Integração destas vias converge a luz miosina gene da cadeia quinase (MLCK), que pode contribuir para o potencial metastático de células C4-2B. Em conclusão, nós fornecemos extensas bases de dados de genes mutantes e genes diferencialmente expressos em linhas celulares de cancro da próstata LNCaP e C4-2B. Estes podem ser úteis para outros pesquisadores que utilizam estes modelos celulares

Citation:. Abrange L, Helsen C, Clinckemalie L, Van den Broeck T, Prekovic S, Joniau S, et al. (2014) Genômica Comparativa e análises transcriptomic de LNCaP e C4-2B do cancro da próstata Linhas Celulares. PLoS ONE 9 (2): e90002. doi: 10.1371 /journal.pone.0090002

editor: Irina U. Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de dezembro de 2013; Aceito: 24 de janeiro de 2014; Publicação: 28 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Spans et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi possível graças a bolsas de investigação a partir do FWO-Vlaanderen (G.0684.12N), do governo federal belga (Plano Nacional de Câncer KPC_29_023) e da KU Leuven (OT /11/081). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é o cancro mais frequentemente diagnosticado e terceira principal causa de morte entre os homens na Europa [1]. Apesar de sua prevalência, a maioria dos homens é diagnosticado com PCA localizada, de baixo risco e nunca iria morrer por causa de seu câncer quando não tratada [2]. No entanto, os pacientes com alto risco e doenças, especialmente metastático têm um risco muito maior de morrer de APC com taxas específicas de mortalidade-PCA relatados até 28,8% para a doença de alto risco e 66,1% para a doença metastática aos 10 anos de acompanhamento [ ,,,0],3]. Dados epidemiológicos recentes têm mostrado que quase 10% de todos os pacientes CaP são metastática no momento do diagnóstico, o que sublinha a importância clínica de desenvolver uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes da CaP metastático [4]. As mudanças genómicas e transcriptomic que acompanham a transformação de doença localizada a CaP metastático resistente à castração estão a ser descoberto, mas são obstruídas pelas dificuldades para obter biópsias das diferentes fases da doença [5], [6].

como alternativa, as linhas celulares podem ser utilizadas como modelos para estudar a transição para CaP metastático resistente à castração [7]. Uma das linhas de células de CaP mais bem estudados, sem dúvida, é a linha celular LNCaP. Esta linha celular foi derivada a partir de uma biópsia de agulha feita a partir do nó de linfa supraclavicular esquerda de um homem caucasiano de 50 anos de idade [8]. Este paciente sofria de um APC a progredir rapidamente com resposta mínimo e breve para terapia hormonal e ausência de resposta à quimioterapia. Subsequentemente, a sub-linha C4-2 foi derivada de um tumor que se desenvolveu em ratinhos nus injectados com células castrados LNCaP. Finalmente, a linha celular foi derivada C4-2B de uma metástase óssea após o transplante ortotópico de células C4-2 em ratinhos nus [9], [10]. Em outras palavras, é um derivado C4-2B metastático das células LNCaP. portanto, o modelo de progressão LNCaP e C4-2B imita a doença avançando de mal tumorigénico, e não-metastático em LNCaP, para metastático e andrógeno-insensitive (ou resistente à castração) em C4-2B sensível andrógeno.

para estas duas linhas celulares, as alterações nos números de cópia genómica do cariótipo e, algumas mutações pontuais, inserções e deleções foram descritas, mas a comparação das sequências de exome não foram ainda relatados [9], [11]. O primeiro objetivo deste estudo foi, portanto, para obter dados exome abrangentes para células LNCaP e C4-2B. É claro, a comparação destes paisagens mutacionais só faz sentido na presença da informação sobre a actividade dos genes afectados. Este último foi obtido a partir de transcriptoma analisa.

Um primeiro passo para catalogar mutações pontuais, inserções e deleções nas células LNCaP foi relatada em Spans

et al.

[12]. Aqui, nós relatamos em um estudo comparativo toda exome e transcriptoma sequenciamento de ambos LNCaP e linhas celulares C4-2B. Para nosso conhecimento, esta é a primeira comparação direta e minuciosa deste tipo. Além disso, esses bancos de dados podem ser muito informativa para os estudos pré-clínicos para os quais tanto LNCaP e as células C4-2B estão sendo usados. Eles também podem ser usados ​​para gerar hipóteses sobre o processo metastático, tal como exemplificado para a via MLCK.

Materiais e Métodos

isolamento do DNA

A linha de células de LNCaP foi obtido a partir de a American Type Culture Collection, enquanto as células C4-2B foram um presente amável do Dr. M. Stallcup (Norris Comprehensive Cancer Center, University of Southern California, EUA) [9]. Ambas as linhas celulares foram crescidas em meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI, Gibco, Invitrogen), contendo 2 g /l de glucose suplementado com soro fetal de vitelo inactivado pelo calor 10% (FCS). O número passagem das células LNCaP e C4-2B foi de 48 e 42, respectivamente. ADN de elevado peso molecular foi extraído de células cultivadas utilizando o kit de ADN genómico de mamíferos GenElute Miniprep (Sigma-Aldrich). Após purificação utilizando precipitação com etanol, com acetato de amónio, a concentração foi quantificada utilizando um espectrofotômetro Nanodrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific) e Bioanalyzer (Agilent).

Whole exome sequenciamento

captura Whole-exome das células LNCaP foi realizada utilizando o Sistema de humanos Todos os Exão SureSelect (Agilent) de acordo com as instruções do fabricante. Emparelhado-end, 100 bp de comprimento sequenciamento lê foram gerados usando o sequenciador GAIIx (Illumina). A captura exome das células C4-2B foi realizada utilizando a versão 2 kit SeqCap EZ exome (Roche NimbleGen) e emparelhado-end 100 bp longo lê foram gerados usando o HiSeq2000 (Illumina).

O controle de qualidade foi realizado usando software FastQC (versão 0.10.1) (https://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/) e Picard (versão 1.22) (https://picard.sourceforge.net/). Sequenciamento leituras foram alinhados ao genoma de referência humana (hg19, NCBI Construir 37) usando BWA, onde lê foram cortados quando a qualidade era inferior a 15 (versão 0.5.9) [13]. arquivos de alinhamento foram processados ​​ainda mais com Genome Analysis Toolkit (GATK) antes variante chamada e incluiu a remoção duplicada, realinhamento indels torno conhecidos locais e recalibração qualidade base (versão 1.0.5777) [14]. As amostras foram carregados individualmente com o software GATK UnifiedGenotyper. Mutações pontuais e dados de expressão foram representados graficamente utilizando o software Circos (versão 0,52) [15]. Comparação de mutações pontuais foi realizada utilizando (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html).

isolamento RNA

células

LNCaP e C4-2B Venny , com números de passagem 30 e 43, respectivamente, foram plaqueadas em placas de 6 poços (1,75 milhões de células /poço) e tratou-se durante a noite (18 h) com 1 nM R1881 (Perkin Elmer). As células foram recolhidas e lavadas com PBS. O sedimento de células foi utilizado para extrair o ARN total utilizando o Kit RNeasy da Qiagen mini. A qualidade e a pureza do RNA foi observada num Nanodrop ND-1000 espectrofotómetro. A integridade do RNA foi verificada no Bioanalyzer na Genomics Núcleo do UZ Leuven.

RNA sequenciamento

Depois de seleção de poliA + RNA, o RNA foi convertido em bibliotecas de cDNA usando a amostra TruSeq RNA kit de preparação (Illumina). Após sequenciação emparelhado-end curta lê de 100 pb com o HiSeq2000 (Illumina), contagens de genes normalizados (fragmentos por quilobases por milhão de mapeada lê, FPKM) foram calculados através do oleoduto Tuxedo (Tophat – Abotoaduras – Cummerbund) [16]. Em suma, os dados de ARN-SEQ foram alinhadas com o genoma de referência usando TopHat (versão 2.0.6) que utiliza Bowtie como o núcleo algorítmico. O pacote de abotoaduras (versão 2.0.2) montadas as transcrições e detectados genes e transcritos diferencialmente expressos. Cummerbund (versão 2.0.0) foi usada para visualizar os dados de expressão de genes. Variante chamar usando os dados de ARN-SEQ foi realizada com GATK (versão 2.2), após o alinhamento com Tophat [14]. RNA-seq para ambas as linhas celulares foi realizada em triplicado, o que permite a identificação de genes expressos diferencialmente. Para a variante de chamada, as triplicatas foram agregados para se obter uma maior cobertura. Caminho-Express foi utilizada para determinar, a partir de uma lista de genes, seja em uma via específica mais genes estão envolvidos do que seria esperado pelo acaso [17].

cDNA RT-PCR quantitativo

foi gerado a partir de RNA (1 ng) com iniciadores aleatórios e Hexâmero RevertAid transcriptase reversa (Thermo Scientific). Quantitative PCR em tempo real foi realizado utilizando Platinum QPCR SYBR Green Supermix-UDG (Invitrogen). Os resultados foram normalizados para o gene constitutivo β-actina e cada amostra foi analisada em triplicado. A sequência dos iniciadores utilizados são: β-actina directo 5′-ACCCAAGGCCAACCG-3 ‘e inverso 5′-TGTACGTTGCTATCCAGGCTGT-3′, 5’-TMPRSS2 frente CCTGCATCAACCCCTCTAACTG-3 ‘e inverso 5′-AGGCGAACACACCGATTCTC-3′, IGF1 para a frente 5’-TGGATGCTCTTCAGTTCGTG-3 ‘e inverso 5′-TCATCCACGATGCCTGTCT-3′, 5’-IGF1R para a frente GTACAACTACCGCTGCTGGA-3 ‘e inverso 5′-TGGCAGCACTCATTGTTCTC-3’.

números

adesão

Binary sequência de alinhamento /mapa (BAM) arquivos de todo dados exome sequenciação, bem como dados de RNA-seq foram depositados no banco de dados do Nucleotide Arquivo Europeia com o número de acesso PRJEB4877 e são acessíveis através https://www.ebi.ac.uk /ena /data /view /PRJEB4877. Os números de acesso da amostra são ERS363578 e ERS363580 para dados exome sequenciamento inteiras de LNCaP e C4-2B respectivamente. Para o RNA-sequenciação, os números de adesão das amostras são ERS363579 e ERS363581 para LNCaP e C4-2B células, respectivamente.

Confirmação de variantes não sinónimas

As variantes de interesse foram confirmadas por seqüenciamento Sanger de Os produtos de PCR amplificados. Os iniciadores específicos para a região contendo a variante a serem testados foram concebidos utilizando o NCBI Primer-explosão (https://ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) e obtido a partir de Integrated DNA Technologies. reacções em cadeia da polimerase foram realizadas de acordo com protocolos padrão, utilizando polimerase de ADN Taq (Thermo Scientific). A amplificação de fragmentos específicos de PCR foi confirmado por electroforese em gel de agarose. Sanger de sequenciação foi realizada no LGC Genomics. arquivos de rastreamento sequência foram analisados ​​utilizando Chromas Lite.

Resultados

Detecção de mutações pontuais com toda exome sequenciamento

Foi realizado um estudo re-sequenciação de todo o exome tanto para LNCaP e C4 células 2b utilizando 100 pares de bases, emparelhado-end lê na plataforma Illumina. Isto gerou 49 e 80 milhões de lê para LNCaP e C4-2B respectivamente (Tabela S1); para células de LNCaP, 74% do exome foi coberto pelo menos 20x, contra 88% para as células C4-2B. características de sequenciação e os dados de controle de qualidade são semelhantes para ambos os conjuntos de dados (Tabela S1 e Figura S1)

As mutações pontuais nos exomes foram detectadas utilizando o gasoduto GATK ao qual foi aplicado filtragem adicional:. únicas mutações que tiveram pelo menos 12 × cobertura e uma frequência de mutação acima de 30% foram tidos em conta. Os dados também foram filtrados para a ausência da mudança par de bases em dbSNP130. Além disso, o viés vertente foi eliminado manualmente (Tabela S2). Isto resultou em listas de 2188 e 3840 mutações pontuais não sinónima em células LNCaP e C4-2B, respectivamente (Tabela S3-4). Apenas 1,784 mutações eram comuns entre ambas as linhas de células, indicando claramente a acumulação de mais de 2000 mutações adicionais no genoma C4-2B. Esta grande diferença na carga mutação não pode ser explicada pela ligeiramente menor cobertura da exome LNCaP. Muito provavelmente, estas mutações C4-2B adicionais surgiram durante a progressão tumoral e metástase óssea.

Detecção de mutações pontuais no transcriptoma sequenciamento

transcriptoma sequenciamento foi realizado, inicialmente, para determinar a expressão diferencial de genes. O ARN foi isolado a partir de células LNCaP e C4-2B que tinham sido tratadas durante 18 horas com o metiltrienolona androgénio sintético. Obtivemos 157 e 131 milhões de 100 pares de bases, emparelhado-end lê para as células LNCaP e C4-2B. Nestes lê, a percentagem de ribossomais, bases intrônicas e intergênicas foi muito baixa (1,6% do total), resultando em uma alta cobertura das bases de mRNA (Tabela S1). Como medida para a qualidade dos dados de transcriptoma, a variação da cobertura ao longo de cada transcrição é mostrado na Figura S2. Esta não mostra nenhum 5 ‘ou 3’ de polarização, embora haja uma cobertura de um pouco mais baixa perto das extremidades dos transcritos.

O fluxo de trabalho para a detecção e subsequente filtragem de mutações pontuais foi semelhante ao utilizado para a sequenciação exome descrito superior. Encontrámos 1505 e 1882 de mutações em células LNCaP e C4-2B respectivamente, dos quais 1054 foram detectados em ambas as linhas celulares (Tabela S5); 451 foram específicos para LNCaP e 828 para C4-2B.

Comparando exome com dados de transcriptoma sequenciamento

Uma comparação das contagens de leitura específica de alelo de dados do genoma e sequenciamento do transcriptoma de todas as mutações pontuais detectadas pode ser usado como uma medida da qualidade de sequenciação. A maioria das mutações têm uma frequência do alelo idêntico em ambos ADN e ARN sequenciação (Figura 1A-B). Mesmo as poucas mutações homozigotos com freqüência do alelo perto de 1 nos dados exome, têm uma frequência de alelos semelhantes nos dados de RNA de sequenciamento.

A-B. A comparação da frequência variante alélica de mutações detectadas usando exome todo e sequenciamento do transcriptoma. Os pontos pretos são mutações que foram encontrados por sequenciação exome e sequenciamento do transcriptoma; pontos vermelhos só foram detectados por sequenciação exome e pontos verdes apenas por seqüenciamento RNA. Para a variante de chamada, foi aplicado um corte de frequência variante alélica de 30%. Ao lado do gráfico uma figura mostra o número de mutações de sequenciação exome, sequenciação transcriptoma e do número encontrado por ambos os métodos. Os gráficos são mostrados para LNCaP (A) e células C4-2B (B), respectivamente. C. Sobreposição de todas as mutações observadas por exome e sequenciamento do transcriptoma em células LNCaP e C4-2B.

A combinação de ambos os exome e transcriptoma sequenciação resultou em um total de 2244 mutações comuns a ambas as linhas celulares (Figura 1C). Além disso, o número de mutações específicas de LNCaP (546) é muito menor do que a de C4-2B-específicos mudanças (2129), indicando novamente que as mutações ter acumulado durante a progressão para C4-2B. RNA-sequenciação confirmou apenas 41 e 35% das variantes ex�icas identificadas por toda a sequenciação exome de LNCaP e C4-2B. Este número subiu para 52% quando levou apenas os genes expressos em conta (FPKM 1). Por outro lado, 60 e 71% do LNCaP e C4-2B variantes identificadas pelo sequenciamento do transcriptoma, respectivamente, foram confirmadas por sequenciação exome.

substituições de nucleotídeos

Os diferentes tipos de transições e transversões nas exomes e transcriptomes de linhas celulares LNCaP e C4-2B pode dar uma visão nos processos de mutação que tiveram lugar durante o desenvolvimento destas células. Observou-se que as mutações predominantes (40-42%) em ambas as linhas celulares foram G-a-A e C-a-t transições (Figura 2).

Percentagens de mutações em cada uma das seis possíveis mutações classes são representadas para os dados de sequenciamento de sequenciamento exome e transcriptoma de ambas as células LNCaP e C4-2B.

o tipo mais comum de edição de RNA em eucariotas superiores é a conversão de adenosina em inosina. Como inosina é lido como uma guanina após sequenciação, este tipo de edição manifesta-se no ARN-sequenciação como uma substituição A-para-G [18]. No entanto, nos conjuntos de dados, o número de transições de A para G no exome e os dados de sequenciação é transcriptoma discussão comparável contra um papel importante de edição de ARN (Figura 2).

Validação de mutações pontuais

no total, 80 mutações nos dados exome de LNCaP (47) e C4-2B (33) foram validados pelo manual de sequenciação de Sanger re-(Figura 3). Os genes que foram escolhidas para validação foram classificados em uma alta definição de prioridades funcional de todos os genes mutados na linha celular C4-2B (calculado como em [12]). Nove destas mutações (em PIK3R1, TP53BP1, PRKCQ, CHEK2, RIPK2 e KLK3) foram detectados por sequenciação de ADN e ARN, em ambas as linhas celulares, e estes foram confirmados com Sanger de sequenciação de DNA genómico e complementar de LNCaP e C4-2B. Quando testamos sete das mutações C4-2B exome (PIAS1 P216S e K380M, MKNK2 L229M e T244N, I85N STAT5A e A1571T MYO18A e Q646 *), eles não foram detectados por sequenciação LNCaP exome, mas a sua presença no genoma LNCaP foi evidente nos dados de sequenciação de ARN e também confirmado por sequenciação de Sanger no DNA genómico e complementar.

validação foi realizada utilizando PCR em ambos ADN genómico e copiar-DNA, seguido de sequenciação de Sanger convencional. A primeira e a segunda coluna representa o nome do gene e o ácido substituição de aminoácido, respectivamente. O terceiro, quarto, sétimo e oitavo coluna representam resultados de sequenciamento de próxima geração para exome todo e sequenciamento do transcriptoma, que depois são validados com o seqüenciamento Sanger, no quinto sexto, coluna, nono e décimo. A + indica que a mutação foi detectada, a – indica que a mutação não foi detectada, enquanto que 0 significa que nenhum produto de PCR pode ser amplificado e /que esta posição não foi coberto com sequenciamento de última geração

.

também detectadas e confirmadas mutações específicas em C4-2B CASP9, FLNB, POLR2A e STAT5A em ADN genómico e de ADNc de células de C4-2B, mas não em células LNCaP. Por fim, mutações em genes que não são expressos em LNCaP ou C4-2B (KIT e GRAP) só poderia ser confirmada no DNA genômico.

Em conclusão, o GATK UnifiedGenotyper para a variante de chamada que combinado com a nossa ampla filtragem geradas poucos falsos positivos. Resultados semelhantes foram demonstrados recentemente por Liu

et al.

comparando GATK com SAMtools, atlas 2 e glftools [19]. Além disso, deve notar-se que os nossos validações indicou que o exome análises não descobrir todas as mutações, mas as variações que foram descobertos mais provável mutações são genuínos.

Expressão

diferencial de genes entre células LNCaP e C4-2B

a seguir, queria procurar genes diferencialmente expressos entre as duas linhas de células, uma vez que estes podem fornecer pistas para os mecanismos por trás da evolução das células LNCaP em células C4-2B. A expressão diferencial foi chamado pelo algoritmo do smoking com base em dados de RNA-seq de triplicados para cada linha de células, com filtragem adicional de log2 vezes mudança 2 e q-valor 0,001. Todas as réplicas foram muito semelhantes, como pode ser visto na Figura S3. Além disso, o coeficiente de variação quadrado, que é uma medida normalizada de variabilidade inter-replicar, é inferior a 0,05 para os genes expressos.

A nossa análise resultou na identificação de genes expressos diferencialmente 703 (Tabela S6), dos quais 457 genes são expressos na maior C4-2B e 246 são expressos mais elevada em células LNCaP (Figura S2). Uma visão geral sobre a localização de genes diferencialmente expressos em todo o genoma pode ser visto na Figura 4, em conjunto com a frequência de mutações pontuais detectados em ambas as linhas de células, em células C4-2B única, ou em apenas células LNCaP. RT-PCR quantitativa em cinco genes diferencialmente expressos confirmaram os dados de ARN-SEQ (dados não mostrados).

ideograma de cromossomas são mostradas em torno do anel exterior e orientado pter-qter, numa direcção dos ponteiros do relógio com centrómeros indicados a vermelho. O anel externo representa genes diferencialmente expressos: 457 genes com expressão mais elevada em C4-2B (pontos vermelhos) e 246 genes com expressão mais elevada em LNCaP (pontos azuis). Outras faixas contêm (de fora para dentro): 2244 mutações em comum entre as células LNCaP e C4-2B, 2129 mutações específicas para células C4-2B e 546 mutações específicas para as células LNCaP mostrados pela densidade por 10 megabases

.

Fu

et al.

já descritos alguns genes diferencialmente expressos entre LNCaP e C4-2B, mas nenhum dos genes eles detectados são diferencialmente expressos em nossos dados [20]. Propomos que as condições de cultura e as diferenças entre as plataformas de detecção mais provável explicar esta discrepância. Por outro lado, há uma sobreposição considerável dos nossos conjuntos de dados com os de outros estudos que compararam LNCaP e transcriptomes C4-2 [21] – [25].

análise Caminho de conjuntos de dados genômicos e transcriptomic

células LNCaP e C4-2B continuar a ser utilizados em pesquisa básica e pré-clínica. Propomos as nossas bases de dados de mutações e genes diferencialmente expressos como importantes fontes de inspiração para novos projectos de investigação. Além disso, esses bancos de dados podem agora ser verificado para mutações específicas antes que se começa a usar essas células para estudar qualquer via relacionada-PCA específico.

Este parágrafo dá um exemplo de uma hipótese com base em

in silico

análise dos nossos dados. análise de caminho-Express das mutações específicas C4-2B combinados com os 703 genes diferencialmente expressos entre LNCaP e as células C4-2B indicou que as mudanças mais significativas foram encontradas na via interacção-receptor ECM e na adesão focal. Ambas as vias convergem na expressão regulada positivamente da cadeia leve da miosina-quinase (MLCK) gene (Figura 5).

Alterações são definidos como tendo um aumento (vermelho) ou a diminuição da expressão (azul), em comparação com C4-2B LNCaP ou por mutações somáticas em células C4-2B apenas (linhas pretas corajosas). Superexpressão de quinase de miosina de cadeia leve em células C4-2B pode distingui-las a partir de células LNCaP na migração celular e características de adesão focal.

Discussão

A alta taxa de mutação em LNCaP e C4- 2B

C4-2B células são derivadas de uma metástase óssea em ratinhos nus inoculados com células provenientes dos xenoenxertos derivado de LNCaP, resistente à castração chamados C4-2. Eles são considerados um modelo pré-clínico útil para metastático resistente à castração e receptor de andrógeno positivo CaP. Aqui, nós fornecemos para os primeira vez mapas comparativos das mutações pontuais detectadas nas células LNCaP e C4-2B. Além disso, embora transcriptoma análises de LNCaP e C4-2 foram relatados, a nosso conhecimento, esta é a primeira análise de transcriptoma de células C4-2B.

C4-2B células, bem como células LNCaP tem uma surpreendentemente elevado número de mutações pontuais: 4373 e 2790 mutações, respectivamente. Como em CaP primária e amostras de CaP resistente à castração, o espectro mutacional é dominado por L-a-A e C-a-t transições [26] – [28]. Sabe-se que os defeitos de reparação de emparelhamentos incorrectos causar mutações de transição, em particular L-a-A e substituições C-a-T [29]. Assim, a maioria das mutações pode ser causada pelo sistema de reparação de emparelhamentos defeituosos em células LNCaP, devido à deleção homozigótica da extremidade 3 ‘do gene MSH2 [30]. Chen

et al.

Já descreveu uma alta instabilidade correlacionando de DNA satélite em células LNCaP [31].

O número de mutações pontuais em nossas linhas de células é muito maior do que a média 16-33 mutações detectadas em amostras inteiras de exomes CaP [26], [32] – [34]. Estas linhas celulares são, portanto, atípica, mas pode ser considerado um modelo para os casos de CaP em que reparo incompatível está com defeito, como descrito por exemplo, Barbieri

et al.

, Onde um único tumor CaP abrigava uma mutação frameshift do gene MSH6 entre outras mutações 996 [32]. Obviamente, essas taxas de mutação mais elevadas explicaria o ainda maior número de mutações que encontramos em C4-2B comparação com LNCaP. Infelizmente, isso também vai obscurecer as mutações condutoras que podem ter conferido uma vantagem de sobrevivência durante o processo metastático.

Ligação entre as taxas de mutação e expressão

Para tanto o LNCaP e linha de células C4-2B, vemos que genes altamente expressos mais frequentemente contêm mutações pontuais do que genes não transcrita (p 0,0001, teste de Chi Square, para o mais alto versus o mais baixo tercil expressa). Isto contradiz a ligação geral entre organização heterocromatina e taxas de mutação regionais superiores em células cancerosas humanas [35]. Possivelmente, nestas linhas celulares, a cromatina aberta e transcrição ligados induz mais desencontros que normalmente são eficientemente corrigidos, mas não no caso de um reparo incompatível deficiente.

Comparação das mutações LNCaP e C4-2B

Detectamos 1784 mutações compartilhadas nas exomes de LNCaP e C4-2B e mudanças específicas C4-2B-2056, o que faz sentido uma vez que as células C4-2B são derivadas das células LNCaP. No entanto, também detectou 404 alterações específicas do LNCaP, muitos dos quais foram confirmados por nossos sequências transcriptoma. Obviamente, as células LNCaP que analisamos se desviaram as células LNCaP que foram usados ​​originalmente para desenvolver as células C4-2B [9]. Com efeito, temos mostrado anteriormente que até mesmo as células LNCaP de diferentes laboratórios são geneticamente diferente e enquanto os nossos células foram obtidas a partir de ATCC (passagem 48), o C4-2B foram mais provavelmente derivada a partir de uma passagem muito mais cedo de células de LNCaP em 1994 [9] , [12].

Sugestão de um papel de MLCK no processo metastático

Nossos dados podem claramente levam à hipótese sobre o processo metastático que teve lugar durante a conversão de LNCaP para C4- 2B. Isto é exemplificado pela convergência de um número de vias afectados a uma regulação positiva da MLCK. Na verdade, existem vários links publicados entre MLCK eo processo metastático. A análise discriminante de microarrays identificaram o gene MLCK como o gene mais informativo para o processo de gênese CaP [36], e inibição da MLCK em ratos CaP células resulta na redução da capacidade de invasão, que foi devido principalmente a motilidade celular prejudicada [37]. Inibindo MLCK em fibrossarcoma, células cancerosas e câncer de mama pancreáticas resulta também na diminuição da adesão, migração e invasão e aumento da apoptose [38] – [41]. Por outro lado, activando MLCK leva a um aumento na invasão de células de cancro da mama e um aumento do potencial metastático em carcinoma de pulmão de células não pequenas [42], [43]. A expressão diferencial do gene MLCK nas duas linhas celulares investigadas aqui pode, por conseguinte, correlacionada com a capacidade metastática mais elevado das células C4-2B.

Conclusão

Em conclusão, os nossos dados mostram claramente que existem grandes diferenças no número e distribuição de mutações e expressão de genes entre as células LNCaP e C4-2B. Uma vez que estas linhas celulares são universalmente usadas para estudar a progressão da não metastático de CaP metastático, estes dados são cruciais para os investigadores para interpretar correctamente os seus resultados quando se utiliza estas linhas celulares. Além disso, nossos bancos de dados será muito útil no desenvolvimento de novas ideias de investigação.

Informações de Suporte

Figura S1.

FastQC resultados do controlo de qualidade do por base de qualidades. resultados de saída do software FastQC controle de qualidade (versão 0.10.1) são mostrados aqui como exome e transcriptoma sequenciamento de células LNCaP e C4-2B

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090002.s001

(TIF)

Figura S2.

cobertura normalizado por posição. A cobertura relativa média é mostrado em cada posição relativa ao longo do comprimento da transcrição. LNCaP é descrito em verde, enquanto C4-2B é descrito no vermelho. O eixo x representa o comprimento do gene normalizada a 100%, em que 0 é ‘final de cada transcrição e 100 é a extremidade 3’ da extremidade 5

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090002.s002

(TIF )

Figura S3.

Heatmap de 703 genes diferencialmente expressos. O mapa de calor mostra as três repetições de cada linha de células, que são muito semelhantes. Todos os genes diferencialmente expressos foram detectados utilizando o algoritmo de smoking, com q 0,001 e log2 vezes mudança 2 como cut-offs. É claro que a maioria dos genes é regulada positivamente em relação ao C4-2B LNCaP, enquanto que um pequeno grupo de genes é regulada negativamente em C4-2B

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090002.s003

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Tabela S1. .

Características Sequencing

doi: 10.1371 /journal.pone.0090002.s004

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Tabela S2. .

Os filtros usados ​​para identificar mutações pontuais nas exomes de células LNCaP e C4-2B

doi: 10.1371 /journal.pone.0090002.s005

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Tabela S3. : Lista de mutações pontuais identificadas no exome de células LNCaP

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090002.s006

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Tabela S4. : Lista de mutações pontuais identificadas no exome de células C4-2B

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090002.s007

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Tabela S5. .

Os filtros usados ​​para identificar mutações pontuais nas transcriptomes de células LNCaP e C4-2B

doi: 10.1371 /journal.pone.0090002.s008

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Tabela S6. : Lista de 703 genes que são diferencialmente expressos entre as células LNCaP e C4-2B

doi:. 10.1371 /journal.pone.0090002.s009

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Reconhecimentos

Estamos muito gratos a Rita Bollen e Hilde de Bruyn por sua excelente assistência técnica. Agradecemos aos nossos colegas no Endocrinologia Molecular Laboratório para discussões úteis.