Sumário

Background

Os microRNAs (miRNAs) foram considerados como um fator crítico na segmentação oncogenes ou genes supressores de tumor em tumorigênese. A predisposição genética de vias de miRNAs-sinalização relacionados com o desenvolvimento de carcinoma de células escamosas oral (CCEO) continua por resolver. Este estudo examinou as associações de polimorfismos com quatro miRNAs com a suscetibilidade e clínico-patológicas características da CEB.

Metodologia /Principais Achados

Um total de 895 indivíduos do sexo masculino, incluindo 425 controles e 470 do sexo masculino câncer bucal pacientes, foram selecionados. em cadeia da polimerase comprimento do fragmento de reação restrição polimorfismo (PCR-RFLP) e PCR em tempo real foram usados ​​para analisar miRNA146a, miRNA196, miRNA499 e miRNA149 polimorfismos genéticos entre o grupo controle eo grupo caso. Este estudo determinou que uma associação significativa de miRNA499 com o genótipo CC, em comparação com os indivíduos com genótipo TT, tinham um risco mais elevado (AOR = 4,52, IC 95% = 1,24-16,48) do CEB. Além disso, um impacto daqueles quatro miRNAs polimorfismo do gene da susceptibilidade de noz de betel e consumo de tabaco levando ao câncer oral também foi revelado. Nós encontramos um efeito protetor entre o desenvolvimento clínico fase (AOR = 0,58, 95% CI = 0,36-0,94) eo crescimento do tamanho do tumor (AOR = 0,47, 95% CI = 0,28-,79) em pacientes mais jovens (idade 60).

Conclusões

Nossos resultados sugerem que o polimorfismo genético de miRNA499 está associada a carcinogênese oral, ea interação do polimorfismo genético miRNAs e carcinógenos ambientais também está relacionado com um risco aumentado de câncer bucal em Taiwan.

Citation: Chu YH, Tzeng SL, Lin CW, Chien MH, Chen MK, Yang SF (2012) Impactos do microRNA gene polimorfismos sobre a susceptibilidade dos fatores ambientais na carcinogênese em Câncer Oral. PLoS ONE 7 (6): e39777. doi: 10.1371 /journal.pone.0039777

editor: Brock C. Christensen, Geisel School of Medicine, em Dartmouth, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de janeiro de 2012; Aceite: 25 de maio de 2012; Publicado: 28 Junho 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Chu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

MircoRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs de fragmento, que contém aproximadamente 20-22 nucleotídeos, pode ter como alvo mRNAs específicos e negativamente regular a sua eficiência e estabilidade de translação [1]. resultados anteriores demonstraram que um miARN poderia influenciar a expressão de vários genes alvo. De acordo com a regulação diferentes ARN alvo, miARN pode participar em processos celulares, incluindo a proliferação, diferenciação, sobrevivência e [2]. expressão miRNA alterada foi observada em várias doenças, especialmente no câncer [3].

Em Taiwan, o câncer bucal é o quarto tipo de câncer mais comum entre os homens. Um rápido aumento da incidência de câncer de boca ocorreu nos últimos anos e taxa bruta de mortalidade de câncer oral foi de 10,1 por 100.000 em 2007 e classificado como a sexta causa de morte por câncer [4]. Nos últimos anos, a incidência de câncer oral foi particularmente elevado no sul da Ásia. Este fenómeno acontece especialmente em populações acostumados a mastigar areca (betel) porca [5]. Estudos epidemiológicos têm sugerido também que a susceptibilidade de câncer oral é mediada por ambos os agentes cancerígenos ambientais (incluindo a ingestão de álcool, consumo de tabaco, e betel de mascar nut) e fatores genéticos [6]. Cada vez mais evidências mostra que miRNAs estão associados com câncer de cabeça e pescoço /oral [7], e vários miRNAs têm sido mostrados para ser regulamentada no câncer de cabeça e pescoço [8]. Esta relação também foi determinada de pesquisa de laboratório [9].

polimorfismo de um único nucleótido (SNP) é uma variação na sequência de ADN que ocorre quando nucleótidos (A, T, C ou G) alteração em pelo menos uma % de uma determinada população. Algumas evidências epidemiológicas mostram que miRNA variações genéticas estão associadas a progressão para o câncer oral [10], [11]. Enquanto miARNs têm recebido uma atenção considerável, nos últimos anos, os SNPs em miARN e sequências pré-miARN foram descobertos para serem ligados aos seus genes candidatos [12]. Na base de dados dbSNP, mais de 400 miARNs SNPs foram documentados. Para obter poder adequado para avaliar o potencial associação, investigamos miRNA146a (rs2910164), miRNA149 (rs2292832), miRNA196 (rs11614913) e miRNA499 (rs3746444), aqueles com freqüências menores de alelos ≥5% e também localizados nas regiões pré-miRNA nas populações chineses [13], [14]. Num outro aspecto, estes quatro miARN SNPs foram relatados como importante para a tumorigénese, devido à sua segmentação em vários genes importantes [15]. Portanto, estas quatro SNPs miARN foram seleccionados neste estudo. Nós também considerado um fenómeno único no Sul da Ásia, onde a maioria dos indivíduos com câncer bucal tem uma mastigação hábito noz de betel. Nós combinamos de status e de laboratório resultados clínicos para determinar a relação entre esses SNPs ea susceptibilidade de câncer oral.

Resultados

A análise estatística das características demográficas é mostrada na Tabela 1. Não houve diferenças significativas nas distribuições de mascar betel-quid (

p Art 0,001), consumo de álcool (

p Art 0,001), e uso de tabaco (

p Art 0,001 ) entre indivíduos saudáveis ​​e pacientes com tumores. Porque essas diferenças entre os dois grupos podem ser fatores de confusão, nós ajustamos essas características em outra análise estatística.

A distribuição dos genótipos miRNA SNP são descritos na Tabela 2. Em nossos controles saudáveis, polimorfismos de miRNA (rs2910164 , rs11614913 e rs3746444) conformados com o equilíbrio de Hardy-Weinberg, exceto para rs2292832 (

p Art 0,001). Utilizou-se modelo de regressão logística para estimar os odds ratio ajustada (ORa). Depois de ajustar a idade, status, consumo de álcool e noz de betel hábitos de mascar fumo, descobrimos que genótipos miRNA499 CC exibiram significativamente (

p Art 0,05) maiores riscos de 4.52- (IC 95% = 1,24-16,48) de Tendo CEB em comparação com o de tipo selvagem correspondente (WT) homozigotos. No entanto, não houve significativamente maior risco de câncer bucal para os indivíduos com o miRNA146a, miRNA149 e gene polimórfico miRNA196 em comparação com aqueles com o gene WT.

Considerando que os fatores de risco, tais como mascar noz de betel pode modificar o susceptibilidade genética para o cancro oral, e os efeitos interativos entre fatores de risco ambientais e polimorfismos genéticos de miRNAs são apresentados na Tabela 3, Tabela S1 e S2 tabela. Indivíduos com pelo menos um alelo C de miRNA499 e uma betel nut-mastigação hábito tinha respectivos riscos mais elevados de 17.33- (IC 95% = 9.63-31.17) de ter câncer oral (Tabela 3). Indivíduos com pelo menos um alelo G do miRNA146a, o alelo C de miRNA149, ou o alelo C de miRNA196, e um hábito betel nut-mastigação tinha respectivos riscos mais elevados de 9.93- (IC 95% = 6,01-16,41), 8.67- ( IC 95% = 5,06-14,89), e 10.98- (IC 95% = 6,21-19,39) de ter câncer oral (Tabela S1). Da mesma forma, o consumo de tabaco elevou significativamente o risco de câncer oral em indivíduos polimórficos para miRNA146a, miRNA149, miRNA196 e miRNA499 em comparação com indivíduos com o gene WT, mas sem fumo (Tabela 3 e Tabela S2). Foram avaliados ainda mais a interação estatística gene-ambiente entre os polimorfismos, tabagismo e betel quid miRNA sobre o câncer oral (Tabela 3, Tabela S1 e Tabela S2). A significância estatística foi encontrada para a interação entre todos os miRNA polimorfismos, tabagismo e betel quid no desenvolvimento do câncer oral (p 0,05). Os resultados sugerem que os polimorfismos do gene miRNAs têm um forte impacto na susceptibilidade câncer bucal em noz de betel e /ou consumidores fumadores.

Para explorar os impactos de genótipos polimórficos de miRNAs sobre o estado clínico do CCEO, que mais pacientes com tumores classificados em dois subgrupos: um subgrupo com pelo menos um alelo polimórfico, e outro subgrupo com alelos homozigóticos WT. Os dados da análise estatística mostrou que a que têm gene miRNA499 polimórfica tinha um efeito protector do crescimento do tamanho do tumor (AOR = 0,46, IC 95% = 0,29-0,72), em comparação com os pacientes com o tipo selvagem (Tabela 4). No entanto, não se observaram associação significativa entre miRNA416a, miRNA149 e polimorfismos do gene miRNA196 e as co-variáveis ​​clínico-patológicas (dados não mostrados). Além disso, em comparação com o genótipo WT (T /T), os doentes com, pelo menos, um alelo polimórfico de miRNA499 C mostrou um efeito protector entre a fase de desenvolvimento clínico (AOR = 0,58, IC 95% = 0,36-0,94) e o crescimento do tamanho do tumor ( AOR IC = 0,47, 95% = 0,28-0,79), em pacientes mais jovens (age≤60), como mostrado na Tabela S3. No entanto, não houve associação significativa entre polimorfismos do gene miRNA499 e as co-variáveis ​​clínico-patológicas foram observados em pacientes idosos (idade 60). (Tabela S4)

Discussão

Neste estudo, nós fornecemos novel informações de SNPs de miRNA499 sobre a associação da susceptibilidade ao câncer oral. Depois de combinar o principal fator de risco de câncer oral, estes genética afeta também pode aumentar a susceptibilidade de câncer oral. Considerando os achados anteriores, miRNA499 foi determinada para exibir expressão elevada em tecidos do coração e do músculo esquelético [16]. Em particular, no coração, estudos anteriores também descobriram que a expressão elevada de miRNA499 aumenta o risco de cardiomiopatia e hipertrofia de cardiomiócitos. Além disso, algumas evidências sugerem que miRNA499 pode regular dinâmica mitocondrial através da segmentação por proteínas específicas, tais como p53 [17]. Estudos anteriores também demonstraram que miRNA499 é altamente associada com doenças cardíacas por regular a proliferação e diferenciação celular [18], [19]. Esses resultados mostram que miRNA499 possivelmente está associado com doenças do coração e também carcinogênese.

Com base no estado clínico, estudos anteriores descobriram que o miRNA-486, miRNA-30d, miRNA-1, e miRNA-499 exibiu alta expressão e no soro também foram associados com a sobrevivência no cancro do pulmão de não-pequenas células [20]. Outros estudos revelaram que a variante genética em pré-miARN pode contribuir para o processo de carcinogénese no cancro da mama [14], [21], o cancro gástrico [22], o cancro do colo do útero [23], [24], e cabeça e pescoço câncer [15]. Neste estudo, nós demonstramos pela primeira vez que o polimorfismo de miRNA499 está associado ao câncer oral.

Estudos anteriores descobriram que miRNA146a pode contribuir para a progressão do tumor, metástase, prognóstico e sobrevida no câncer de estômago e câncer oral [25 ], [26]. Outra descoberta também mostrou que o polimorfismo miRNA146a pode regular a expressão miRNA146a [27]. Vários estudos laboratoriais também descobriram que miRNA146a poderia inibir a diferenciação celular e sobrevivência no sistema hematopoiético [28]. Além disso, ligada ao câncer, miRNA146a poderia suprimir a invasão celular em câncer pancreático [29]. Em pormenor, algumas evidências conecta miRNA146a com factores de transcrição tais como NF-KB [30]. Estes resultados fornecem uma nova visão que miRNA146a poderia afetar a progressão do câncer, regulando a diferenciação celular, mas não pode afetar a apoptose. Embora não encontramos nenhuma associação entre miRNA146a e vários estados clínicos em nosso estudo, com base nestas constatações, estudos futuros poderia considerar estatuto prognóstico conjunta ou mesmo taxa de sobrevivência.

Estudos recentes identificaram que miRNA196 podem interagir com vários fatores de transcrição e envolver no desenvolvimento e progressão de cancro [31], [32]. Alguns resultados sugerem que a superexpressão da miRNA196 leva a prognóstico mais favorável e a sobrevivência na leucemia [33]. Além disso, miRNA196 está associada com a inflamação em cancros específicos [34]. Além disso, Christensen et al., Relata um polimorfismo na sequência madura de miRNA196a2 em um estudo de caso-controle (n = 1.039) de carcinoma de cabeça e pescoço de células escamosas (CECP) [35]. Quando os autores estratificada no local do tumor não observaram uma associação significativa entre o câncer oral e miRNA196a2, embora a estimativa de efeito era protetor, semelhantes aos resultados apresentados neste estudo. Embora a razão para essas discrepâncias não é bem conhecido, os diferentes resultados do relatório e do presente estudo pode estar relacionada com a diferença racial /étnica.

Considerando que as causas da carcinomas são complexas, analisamos vários riscos fatores, como tabagismo e hábitos de mascar noz de betel, neste estudo. Esperamos que esses polimorfismos do gene poderia influenciar a susceptibilidade de câncer oral. Com base nos resultados, observamos que esses polimorfismos aumentou significativamente a razão de chances, em cada grupo, possivelmente porque as funções desses miRNAs regulam as diferenciações e proliferações na progressão tumoral. Nós também descobrimos que o polimorfismo genético de miRNA499 está associado a metástases distal da CEB. Um estudo anterior para o cancro colorectal tem encontrado que a sobre-expressão de miRNA499 pode facilitar a migração e a invasão de células cancerosas in vitro, bem como a metástase do pulmão e do fígado, in vivo [36]. box Além disso, este estudo também identificou forkhead O4 (FOXO4) e morte celular programada 4 (PDCD4) como alvos directos e funcionais de miRNA499 [36]. Além disso, Reis et al., Relata também que PDCD4 como um supressor de migração e invasão e pode ser um biomarcador clinicamente relevante com o valor prognóstico em CEB [37]. Estas conclusões acima referidas, podem fornecer uma explicação preliminar com o nosso achado para a associação entre miRNA499 e metástase distal da CEB. mecanismos detalhados relevantes podem justificar mais estudos.

Uma das limitações do nosso estudo é que a informação sobre o álcool, noz de betel e uso de tabaco é dicotomizado em “constante do usuário” versus “não-usuário.” À medida que o resultado, uma análise mais detalhada com base na quantidade, duração e passado histórico de noz de betel, álcool e consumo de tabaco não foram capazes de ser realizada. A coleta de dados baseou-se em auto-relatórios, para o qual alguns indivíduos podem estar relutantes em denunciar o seu uso habitual de tais substâncias. Assim, pode haver efeito de confusão residual da noz de betel, álcool e uso de tabaco má classificação. Além disso, o papel funcional de miRNA no crescimento ou metástase de câncer oral vale a pena para uma investigação mais aprofundada, que será incluído no nosso trabalho futuro. Os clones contendo vários genótipos de miRNA499 SNPs será construído de modo a elucidar as possíveis funções de miRNA499 (proliferação, a regulação do ciclo celular, migração e invasão) em linhas celulares de cancro oral, bem como os mecanismos subjacentes. Além disso, este estudo revelou a não conformidade de miRNA 149 (rs2292832) genótipos de Hardy-Weinberg no grupo de controle. Um estudo anterior com genótipos 107000 gerados a partir de 443 SNPs tem encontrado que as distribuições dos genótipos para 36 de 313 ensaios (11,5%) foram desviados de HWE (P 0,05) [38]. Após a procurar as possíveis razões, ensaios para SNPs mostrou erros não-específicos ou de genotipagem foram identificados. No entanto, eles também encontraram o desvio da HWE para os restantes 10 SNPs foi inexplicável. Embora a razão para a não conformidade de miRNA 149 genótipos de HWE em nosso grupo controle ainda não é explorado, os resultados do estudo acima referido pode fornecer algum sentido para o nosso estudo futuro.

Em conclusão, descobrimos uma associação significativa entre miRNA499 polimorfismos do gene ea susceptibilidade de câncer oral. No entanto, não há conexões entre o SNPs e estado clínico. Depois de considerar mascar noz de betel, que é o fator mais influente do câncer bucal, descobrimos que esses quatro miRNAs que portadores do genótipo mutação pode aumentar a susceptibilidade de câncer oral. Estas mutações genéticas podem afetar miRNA eficiência e estabilidade alvo e aumentar a incidência de câncer oral, mas os mecanismos detalhados dos níveis de genes para os níveis de proteína que, finalmente, afetar o desenvolvimento do tumor deve ser classificada, talvez traçar um novo rumo para a terapia-alvo.

Materiais e Métodos

sujeitos e Colheita

Foram recrutados 470 pacientes do sexo masculino no Hospital Chung Shan Medical University, em Taichung e Changhua Hospital Christian e Show Hospital Memorial Chwan em Changhua, Taiwan como um caso grupo entre 2007 e 2011. Enquanto isso, os controles foram recrutados a partir do exame físico durante aqueles três hospitais, que são também as instalações que os casos foram coletados a partir de. No final do recrutamento, um total de 425 participantes do sexo masculino que não tinha nem auto-referidas história de cancro de sites foram incluídos. Além disso, indivíduos com doença pré-cancerosa oral, tais como fibrose oral, submucoso, leucoplasia, eritroplasia, hiperplasia verrucosa, etc. foram excluídos do grupo de controle. A taxa de participação foi de aproximadamente 91% para os casos e 76% para os controles. Uma vez que todos os casos e controles foram consecutivamente recolhidos sem qualquer selecção, e com base nas informações fornecidas nos questionários, nenhuma relação genética ou familiar significativo história foram encontrados.

Quanto aos casos e controles, informação de exposição, incluindo betel quid mastigação ( nunca- vs. não-usuário), o uso do tabaco (fumante vs. não-fumante) e consumo de álcool (atual bebedor pesado, definido pelo CDC como consumir uma média de mais de 2 bebidas por dia vs. não bebo muito atual), foram todos obtidos a partir de questionários. Enquanto a informação médica de casos, incluindo TMN estadiamento clínico, tamanho do tumor primário, comprometimento de linfonodos e grau histológico, foram obtidos a partir de registros médicos. pacientes com câncer bucal foram encenadas clinicamente no momento do diagnóstico de acordo com o sistema TNM encenação da Comissão Americana conjunta sobre Câncer (AJCC) [39]. diferenciação tumoral examinado por patologista acordo com a classificação AJCC. Este estudo foi revisto e aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional e consentimento informado por escrito foi obtido de cada indivíduo.

Extração de DNA

As amostras de sangue total, coletados a partir de controles saudáveis ​​e pacientes com câncer bucal, foram colocadas em tubos contendo EDTA, depois centrifugados e armazenados a -80 ° C. O sangue venoso de cada sujeito foi desenhada em tubos vacutainer contendo EDTA e armazenadas a 4 ° C. O ADN genómico foi extraído de DNA QIAamp mini-kits de sangue (Qiagen, Valencia, USA) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA foi dissolvido em tampão TE [10 mM de Tris (pH 7,8), EDTA 1 mM] e em seguida quantificada por uma medição de OD260. Preparação final foi armazenado a -20 ° C e utilizados como moldes para a reacção em cadeia da polimerase.

Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP)

O miARNs rs2910164 gene, rs11614913, e polimorfismos rs3746444 foram determinadas por ensaio de PCR-RFLP [15]. As sequências de iniciadores e a enzima de restrição para a análise destes polimorfismos do gene miARNs foram descritos na Tabela S5. A PCR foi realizada num volume total de 10 ul contendo 100 ng de ADN molde, 1,0 ul de 10 x tampão de PCR (Invitrogen, Carslbad, CA, EUA), 0,25 U de Taq ADN polimerase (Invitrogen), 0,2 de dNTPs mM (Promega, Madison, WI , EUA) e 200 nM de cada iniciador (MDBio Inc. Taipei, Taiwan). As condições dos ciclos de PCR foram de 5 min a 94 ° C, seguido de 35 ciclos de 1 min a 94 ° C, 1 minat 58 ° C durante miRNA146a, 1 min a 63 ° C durante miRNA196a2, e 1 min a 67 ° C durante miRNA499, e 2 min a 72 ° C, com uma etapa final a 72 ° C durante 20 min para permitir uma extensão completa de todos os fragmentos de PCR. Os resultados foram mostrados na Figura 1. Para cada ensaio, os controlos apropriados (nontemplate e genótipo conhecido) foram incluídos em cada série tipagem para monitorizar contaminações dos reagentes. Para validar os resultados de PCR-RFLP e para controle de qualidade, cerca de 10% dos ensaios foram repetidos de lotes diferentes e vários casos de cada genótipo foram confirmados pela análise da sequência de DNA.

(A) Para o polimorfismo do gene rs2910164 miRNA146a , os alelos homozigóticos tipo selvagem (C /C) rendeu um 25 e 122 pb produtos, os alelos heterozigotos (C /G) produziu 25-, 122- e produtos de 147 pb, enquanto o tipo mutante alelos homozigóticos (G /G ), produziu um produto de 147 pb. (B) Para miRNA196 polimorfismo do gene (rs11614913), os alelos homozigóticos de tipo selvagem (T /T) originou um produto de 149 pb, os alelos heterozigóticos (C /T), produziu o 24-, 125- e produtos de 149 pb, enquanto o tipo mutante alelos homozigóticos (C /C) produziu um produto de 24 e 125 pb (C) Para miRNA499 polimorfismo do gene (rs3746444), o tipo selvagem (T /T) produziu 26- e produtos de 120 pb; os alelos heterozigotos (C /T) produziu 26-, 120- e produtos de 146 pb, enquanto os alelos homozigóticos tipo mutado (C /C) produziu um produto de 146 pb.

em tempo real PCR

a discriminação alélica dos polimorfismos do gene rs2292832 miRNA149 foi avaliada com o StepOne ™ real-Time PCR System ABI (Applied Biosystems) e analisados ​​utilizando software v3.0 SDS (Applied Biosystems), utilizando o ensaio TaqMan. O volume final para cada reacção foi de 5 mL, contendo 2,5 mL TaqMan Genotipagem Master Mix, 0,125 mL sondas TaqMan mistura, e 10 ng de ADN genómico. A reacção de PCR em tempo real inclui um passo inicial de desnaturação a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos, cada um consistindo em 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 1 min.

Análise estatística

as distribuições das características demográficas e freqüências genotípicas entre casos e controles, bem como características clínico-patológicas em diferentes genótipos foram analisados ​​pelo teste exato de Fisher, uma vez que o pequeno tamanho da amostra estava presente em algumas categorias de variáveis. As odds ratio (OR) com intervalo de confiança de 95% (IC) da associação entre freqüências genotípicas e câncer bucal foram estimadas por vários modelos de regressão logística, após o controle de co-variáveis. método não paramétrico foi utilizado devido a não distribuição normal de algumas variáveis ​​estimadas. Nós montado um modelo de regressão logística com efeitos principais (polimorfismo genético miRNAs, status e betel status de mascar quid fumar), bem como um termo de interação entre eles (genótipos miRNAs * característica demográfica), comparando o modelo de encontro a um modelo com apenas os efeitos principais . efeito de interação foi definida como a diferença de seu desvio, e mais avaliada pelo teste da razão de verossimilhança para calcular χ

2 e

valores p

[40]. A

valor p

inferior a 0,05 foi considerado significativo. Os dados foram analisados ​​no software estatístico R.

Informações de Apoio

Tabela S1.

Associação de genótipo e betel de mascar porca status de miRNA.

doi: 10.1371 /journal.pone.0039777.s001

(DOC)

Tabela S2.

Associação de miRNA genótipo e tabagismo.

doi: 10.1371 /journal.pone.0039777.s002

(DOC)

Tabela S3.

Relação do estado clínico e os genótipos em pacientes com câncer bucal miRNA499 (≤60 única, N = 332).

doi: 10.1371 /journal.pone.0039777.s003

(DOC)

Tabela S4.

Relação do estado clínico e genótipos miRNA499 em pacientes com câncer bucal ( 60 somente, N = 138).

doi: 10.1371 /journal.pone.0039777.s004

(DOC)

Tabela S5. sequências

primer e condições de PCR para amplificação de miRNA SNPs.

doi: 10.1371 /journal.pone.0039777.s005

(DOC)