Abstract

Fundo

As propriedades mecânicas da matriz extracelular tem um papel importante no crescimento e diferenciação celular. No entanto, não está claro quanto ao que as células cancerosas medida responder às mudanças nas propriedades mecânicas (rigidez /rigidez) do microambiente e como essa resposta varia entre as linhas celulares de cancro.

Metodologia /Principais Achados

neste estudo utilizou-se um sistema de placa de 96 poços recentemente desenvolvido que as matrizes de géis de poliacrilamida de matriz extracelulares conjugados que aumentam de rigidez de pelo menos 50 vezes ao longo da placa. Esta placa foi utilizada para determinar como as mudanças na rigidez da matriz extracelular modular as propriedades biológicas das células tumorais. As linhas de células ensaiadas dividem-se em duas categorias com base na sua proliferação em substratos de diferentes rigidez: “dependente rigidez” (aqueles que mostram um aumento no crescimento celular como rigidez extracelular é aumentado), e “rigidez independente” (aqueles que crescem igualmente em ambos os substratos macios e duros). As células que cresceram pouco em géis macios também mostrou diminuição da difusão e migração sob estas condições. Mais importante ainda, semeando as linhas celulares dentro dos pulmões de ratos sem pêlo revelou que a capacidade das células para crescer em géis macios

In vitro

correlacionada com a sua capacidade de crescer num ambiente de tecido mole

In vivo

. A linha de carcinoma do pulmão A549 respondeu a cultura em géis macios expressando o marcador epitelial diferenciado E-caderina e diminuindo a expressão do factor de transcrição mesenquimais Slug.

Conclusões /Significado

Estas observações sugerem que as propriedades mecânicas do ambiente da matriz desempenham um papel significativo na regulação da proliferação e as propriedades morfológicas de células cancerosas. Além disso, o formato com vários poços do ensaio soft-placa é um complemento útil e eficaz para modelos de cultura de células em 3 dimensões estabelecidas

Citation:. Tilghman RW, Cowan CR, Mih JD, Koryakina Y, Gioeli D, Slack -Davis JK, et ai. (2010) Matriz de Rigidez regula o crescimento celular Cancer and Cellular fenótipo. PLoS ONE 5 (9): e12905. doi: 10.1371 /journal.pone.0012905

editor: Neil A. Hotchin, da Universidade de Birmingham, Reino Unido

Recebido: 15 de julho de 2010; Aceito: 24 de agosto de 2010; Publicação: 23 de setembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Tilghman et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por bolsas NIH-NCI CA40042 (National Institutes of Health-National Cancer Institute) (www.nih.gov) e financiamento da concessão Coulter Fundação Translational Partners (www.whcf.org) (JTP), NIH HL092961 (DJT) e NIH CA124706 (DG). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O controle da diferenciação de células epiteliais (CE) e proliferação é fundamental para a homeostase do tecido [1], [2]. proliferação de CE é regulada por uma interacção complexa com o microambiente envolvente, incluindo a exposição a factores de crescimento, o contacto com as células adjacentes, e a adesão aos componentes da matriz extracelular (ECM) [3] – [6]. A alteração das vias de sinalização que regulam a resposta a esses sinais do microambiente é um evento crítico no tumor a iniciação, progressão e metástase.

As propriedades mecânicas do ECM foram identificados como um factor importante que regula a diferenciação e proliferação de uma infinidade de tipos de células, tanto

in vitro

e

in vivo

. Especificamente, a rigidez ( “rigidez”) da ECM, definido pelo seu módulo de elasticidade (

E

) em unidades de força por área (Pa), afecta o crescimento, a diferenciação e a funcionalidade de muitos tipos de células, incluindo células estaminais, f ibroblastos, células da glia, e cardiomiócitos [7] – [11]. Além disso, os estados de doença são muitas vezes acompanhadas por um aumento local na rigidez ECM [12], [13]. a progressão do cancro nos tecidos moles é tipicamente associada com um aumento na rigidez devido à acumulação local de uma, matriz de colagénio reticulada permitindo a detecção densa do tumor por palpação física [14], [15]. Assim, células epiteliais mamárias não tumorigénica, que normalmente residem no suave (

E

= 150 Pascal [Pa] ou N /m

2) microambiente da mama, mostra aumento da proliferação quando cultivadas em matrizes mais duras (

e

= 4500 Pa), juntamente com o aumento da migração, a sinalização ERK aumentada, e perda da polaridade celular [16]. Estes atributos são consideradas características das células tumorais e são caracterizados como sendo um componente integral de uma transição a partir de uma relativamente quiescente para um fenótipo “maligno”, devido a um aumento local no ECM rigidez [16]

.

A extensão e variabilidade ao qual linhas de células de cancro humano são sensíveis às variações na rigidez microambiental não é clara. Os fibroblastos transformados com H-Ras oncogénica não mostram a inibição de crescimento em substratos macios [11]. Além disso, as propriedades de crescimento de populações clonais da linha celular de cancro da mama MDA-MB-231 diferem em resposta a rigidez, e que se correlacionam com a capacidade de crescer no pulmão mole ou osso duro

In vivo

[ ,,,0],17]. Isto sugere que as propriedades de crescimento de uma linha celular de cancro particular, em resposta a rigidez substrato pode ser determinada pela sua composição genética ou epigenético.

Análise de linhas celulares de cancro humano é geralmente realizada utilizando células cultivadas em plástico rígido, ou em Matrigel ou de agar mole, as propriedades mecânicas do que são mal definidos e /ou difícil de modular. Neste estudo nós adaptamos um método para a cultura de células em substratos “soft” biologicamente relevantes usando poliacrilamida ECM conjugada (PA) géis que podem se estender a gama rigidez de 100 Pa-150.000 Pa. Nós usamos um desenvolveu recentemente 96 poços sistema de ensaio que as matrizes de geles PA variando rigidez em incrementos definidos pelo utilizador em toda a placa. Este sistema foi usado para determinar como as alterações na rigidez do ECM modular as propriedades biológicas de células tumorais, incluindo o crescimento, morfologia e propriedades migratórias. As linhas de células testadas divergiu em duas categorias baseadas em seus perfis de proliferação: linhas “rigidez dependentes” geralmente exibiram aumento do crescimento celular como rigidez extracelular aumentou, enquanto “rigidez independente” linhas cresceram igualmente bem em todo o espectro testado de rigidez matriz. Importante, as células que cresceram pouco em géis macios também mostrou diminuição da difusão e migração sob estas condições. Foi avaliado o crescimento de quatro linhas celulares representativas seleccionadas a partir destas duas categorias

in vivo

através da introdução das células para o meio ambiente de tecido mole do pulmão. As duas linhas de células independentes de rigidez (PC-3 e mPanc96) cresceu bem em (pulmão) tecido mole, enquanto que as linhas celulares dependentes de rigidez (A549 e MDA-MB-231) não cresceu bem no pulmão. A linha de carcinoma do pulmão A549 respondeu a cultura em géis macios expressando o marcador epitelial diferenciado E-caderina e diminuindo a expressão do factor de transcrição Slug mesenquimais. Estas observações sugerem que as propriedades mecânicas do ambiente da matriz desempenham um papel significativo na regulação da proliferação e as propriedades morfológicas de células cancerosas, e que o “perfil de rigidez” é uma propriedade intrínseca de cada linha celular de cancro.

resultados

crescimento dependente da rigidez de linhas celulares de cancro

Para medir o crescimento de linhas celulares de cancro como uma função da rigidez matriz adaptou um romance de 96 poços sistema de ensaio ( “soft-plate96” ) que utiliza colagénio covalentemente acoplados a géis de poliacrilamida como substratos em lugar de plástico rígido revestido com ECM. As placas macias eram constituídos por cinco secções, contendo cada um duas colunas de gel de PA revestido com colagénio de um módulo de elasticidade específico (Fig. 1), 150 Pa e 1.200 Pa (comparável ao pulmão e da mama), 2.400 Pa e 4.800 Pa ( comparável ao de um tumor mamário), e 9600 Pa (músculo estriado de aproximação). Estes módulos elásticos foram escolhidos com base em medições publicadas da rigidez dos tecidos moles e os tumores [7], [10], [16], [18], e em dados preliminares que mostram que as maiores alterações em termos de proliferação celular dependente de rigidez ocorreu entre 150 Pa e 4.800 Pa (dados não mostrados).

um ensaio de crescimento de 5 dias típico usando um soft-plate96 produz um “perfil de crescimento”, que reflecte o efeito da rigidez sobre a proliferação da linha de células.

determinou-se o perfil de crescimento de linhas celulares de cancro catorze por plaqueamento das células em a macio-plate96 e medindo a mudança vezes no número de células após cinco dias usando um corante de ligação a ADN fluorescente (Fig. 2) . Além disso, foram determinados os perfis de crescimento de células epiteliais mamarias não tumorigénica (MCF-10A) e duas linhas de fibroblastos. O crescimento das células em matrizes definidas gerado um “perfil de crescimento” qualitativa para cada linha celular (Fig. 1, 2). Os perfis de crescimento das linhas de células diminuiu em uma de duas categorias: as células “dependente da rigidez”, pelo menos uma alteração de 2 vezes no número de células ao longo do intervalo de rigidez extracelular testado (por exemplo, células de cancro da mama MDA-MB-231 e células de câncer de pulmão A549), e células “independente de rigidez” que cresceram igualmente bem em toda a gama de rigidez testado matriz (por exemplo, PC-3 células de câncer de próstata e células de câncer pancreático mPanc96) (Fig. 2). Não houve correlação entre a forma do perfil do crescimento dependente da rigidez e do tecido de origem, ou se as células foram cultivadas originalmente a partir do tumor primário ou a partir de uma lesão metastática.

A mesa é uma compilação de cinco ensaios de crescimento a dez dias para 17 linhas de células. Incluído na tabela são fonte original das células (indicados por citações de literatura), a capacidade para crescer em 150 Pa e 9600 Pa (substratos de ensaios SoftPlate96), e o perfil de crescimento macio-plate96 para cada linha celular. perfis cinzentos indicam linhas dependentes de rigidez e perfis pretas indicam linhas independentes de rigidez. O crescimento é medida como se segue: – 1 dobra; + 1-5 vezes; ++ 5-10 vezes; +++ 10-15 vezes; ++++ 15-20 vezes; +++++ . 20 vezes de aumento no número de células durante 5 dias

Nós caracterizar ainda duas linhas de células que mostrou crescimento dependente da rigidez (MDA-MB-231 e A549) e duas células linhas que apresentaram crescimento independente de rigidez (mPanc96 e PC-3). Cada linha de células demonstraram crescimento celular robusto em plástico revestidos com colagénio rígido (Fig. 3A). As células dependentes de rigidez demonstraram um aumento de 4-5 vezes no número de géis mais rígidas (4800-9600 Pa) relativamente aos (150-1200 Pa) géis macios (Fig. 3b, painéis superiores). Em contraste, as duas linhas celulares independentes da rigidez demonstraram números quase equivalentes sobre os geles moles e rígidas (Fig. 3B, painéis inferiores). Para determinar se o crescimento diferencial em substratos flexíveis ou rígidos representada a selecção de uma população de células que exibem crescimento preferencial sobre os diferentes substratos, A549 ou células MDA-MB-231 foram cultivadas em substratos de plástico ou de 150 Pa durante 15 dias. Estas células foram então recolhidas e sujeitas a um ensaio de crescimento de 5 dias em um soft-plate96. Nenhuma mudança no perfil de crescimento macio-placa foi observada após cultura prolongada em substratos macios (Fig. S1). Estes dados estabelecem claramente as diferenças específicas de linha de célula na capacidade para crescer em moles em relação substratos rígidos e sugerem que o “perfil de rigidez” é uma propriedade intrínseca de cada linha de células.

.) Ensaio de crescimento de 5 dias de quatro linhas celulares de cancro de plástico. B.) ensaios de crescimento de 5 dias das quatro linhas celulares de cancro em um soft-plate96. Os dados são expressos como alteração de dobragem sobre o número de células inicialmente plaqueadas. Os resultados mostram ± SEM médio de, pelo menos, três experiências independentes. * P . 0,05 vs. crescimento sobre 9600 Pa medida pelo one-way ANOVA seguido pelo teste de Tukey

Propriedades de linhas de rigidez dependentes e celulares independente de em substratos diferentes

foi avaliado se o crescimento diminuiu de células dependentes de rigidez em gel macio era devido a defeitos de adesão ao substrato, um bloco no ciclo celular, ou indução de apoptose. As células A549 e MDA-MB-231 foram plaqueadas em soft-plate96, deixou-se aderir durante seis horas, e o número de células ligadas medido. Ambas as linhas celulares eficientemente ligados aos geles de colagénio, independentemente dos módulos elásticos (Fig. 4A), indicando que os números de células mais baixos nos geles depois de cinco dias não é devido a uma falta de aderência celular.

a). As células A549 e MDA-MB-231 foram plaqueadas numa macio-plate96 e número total de células por poço foram contadas depois de 6 horas de ligação. Os dados são expressos como percentagem de adesão para os géis de 150 Pa. B.) A549 e células PC-3 foram cultivadas em 150 Pa ou 4800 substratos gel Pa durante 5 dias, seguido de análise do ciclo celular. Os resultados mostram média de pelo menos três experiências ± SEM. * P . 0,05

A falta de sinalização de adesão nas células dependentes de fixação resulta em um bloco no G1 S checkpoint /do ciclo celular [19]. As células A549 cultivadas num gel de 150 Pa durante cinco dias mostrou uma acumulação modesto, mas significativo, na fase G1 do ciclo celular com uma diminuição correspondente na percentagem de células na fase S (Fig. 4B), consistente com um bloco na G1 /S checkpoint. Em contraste, as células MDA-MB-231 não exibiram nenhuma alteração significativa no perfil do ciclo celular, similar à rigidez-independente linhas de células PC-3 e mPanc96 (Fig. 4B). No entanto, ambas as linhas celulares dependentes de rigidez (A549 e MDA-MB-231) exibiram significativa a apoptose quando cultivadas em géis macios, durante cinco dias, enquanto o PC-3 e as linhas celulares independentes de mPanc96 rigidez não (Fig. 5a- B). Nenhuma das quatro linhas celulares exibiram significativa a apoptose quando cultivadas nas (4800 Pa) géis mais rígidas. Estes dados indicam que o “perfil rigidez” de células não reflete diferenças na adesão à matriz, mas é mais provável reflete as alterações dependentes de rigidez na progressão do ciclo celular e apoptose celular.

A.) Micrografias representativas dos A549 e células MDA-MB-231 plaqueadas durante 5 dias a 150 Pa ou 4800 Pa substratos gel. Todos os núcleos celulares são corados com DAPI (azul) e células TUNEL-positivos são marcados com fluoresceína (verde). Barra = 100 um. B.) A quantificação da coloração TUNEL. Média de 2 experiências ± SEM, com um total de pelo menos 400 células contadas para cada condição.

A capacidade das linhas celulares de cancro para formar colónias em tecido mole correlaciona-se com a sua macio-plate96 perfis

foi avaliado se a capacidade diferencial para crescer em substratos macios exibidas pelas linhas celulares rigidez-dependentes e independentes de foi preditiva da capacidade destas células para crescer em um ambiente de tecido mole

in vivo

. Duas linhas dependente da rigidez (MDA-MB-231 e A549) e duas linhas independentes de rigidez (PC-3 e mPanc96) foram estavelmente transduzidas com um lentivírus que codifica GFP, e injectada na veia da cauda de ratinhos nus. De qualquer 2-24 horas ou 14 dias pós-injecção, a população de células positivas para GFP nos homogeneizados de pulmão foi determinado por citometria de fluxo e histoquímica. Cada uma das linhas celulares exibiram número significativo de células do pulmão de pós injecção (Figura 6A, painel da direita;. Dados não mostrados). No entanto, depois de duas semanas, os pulmões dos ratinhos injectados com as duas linhas celulares dependentes de rigidez (MDA-MB-231 e A549) continha menos células GFP positivas, em comparação com os pulmões dos ratinhos injectados com linhas celulares independentes de rigidez (PC- 3 e mPanc96) (Fig. 6A, painel esquerdo). Hematoxilina e eosina (H E) Coloração de secções embebidas em parafina dos pulmões duas semanas após a injecção das células mPanc96 mostraram microcolônias dentro dos alvéolos, enquanto que os pulmões de ratos que foram injectados com as células A549 e MDA-MB-231 containied microcolônias não detectáveis ​​(Fig. 6B, dados não mostrados). Assim, o crescimento das linhas independentes de rigidez no pulmão correlacionada com a sua eficiência de crescimento nos géis de 1200 Pa do ensaio SoftPlate96 (Fig. 6C), uma rigidez semelhante à do tecido pulmonar (DJT, observação não publicada). A correlação entre as taxas de crescimento celular relativa em substratos macios, mas não pratos rígidas, com o crescimento das mesmas linhas de células no pulmão sugere que a capacidade das células para crescer em géis macios

in vitro

pode ser um preditor da sua capacidade para crescerem em tecidos moles

in vivo

.

.) MDA-MB-231, A549, PC-3, ou células mPanc96 marcado com GFP foram semeadas para dentro dos pulmões de ratinhos nus. (Esquerda) O número de células GFP positivas no pulmão foi determinada 4 horas e 14 dias após a injecção, e a alteração no número de células GFP positivas no pulmão ao longo dos 14 dias foi marcado. * P 0,05 vs. células MDA-MB-231 como medido por ANOVA de uma via seguida pelo teste de Tukey. (Direita) A549 marcadas com GFP e foram semeadas as células mPanc96 para os pulmões e a percentagem de células positivas para GFP foram pontuadas em intervalos ao longo de 24 horas. B.) A histologia do pulmão do rato ao 14 ° dia após a injecção de células A549 (painel da esquerda) e células mPanc96 (painel direito). As setas indicam micrometástases. C) Comparação do crescimento de linhas celulares em plástico (tomada a partir da Fig. 3A) e em substratos 1200 Pa (tomada a partir da Fig. 3B).

aumento da proliferação e migração de células de rigidez-dependente células correlaciona-se com o espalhamento das células

próxima avaliado se a proliferação de linhas celulares dependentes de rigidez correlacionados com a capacidade das células para se espalhar sobre substratos de gel diferentes. Tanto as células A549 MDA-MB-231 e exibiram aumentos significativos na célula de espalhamento em géis 4800 Pa em comparação com géis de 150 Pa (Fig. 7A-B). Resultados semelhantes foram obtidos quando BxPC-3 células, de uma linha de pâncreas que exibe um perfil de crescimento comparável a células A549 MDA-MB-231 e (Fig. 2), foram cultivadas em 150 Pa e 4800 Pa géis (dados não mostrados). Curiosamente, PC-3 de células (rigidez-independente) foram capazes de se espalhar sobre 150 géis Pa a uma extensão similar de em 4800 géis PA, enquanto que as células mPanc96 não se espalhou sensivelmente em ambos os substratos flexíveis ou rígidos (independente rigidez-) (Fig . 7A-B). A capacidade de se espalhar sobre substratos mais rígidos também correlacionada com a capacidade de células A549 e MDA-MB-231 para migrar. Em contraste, tanto células mPanc96 PC-3 e não conseguiu mostrar diferenças significativas na migração quando semeadas em macia contra substratos mais rígidos (Fig. 7c). Estes resultados demonstram que para as linhas celulares dependentes de rigidez a capacidade das células para espalhar correlaciona com o aumento da proliferação e da migração. Para as células independentes de rigidez estes comportamentos parecem ser desacoplado.

.) Micrografias de A549, MDA-MB-231, PC-3, e células mPanc96 que foram plaqueadas em 150 ou 4800 Pa substratos de gel durante 20 horas. B.) Áreas de células que foram cultivadas durante 20 horas em 150 ou 4800 substratos gel Pa. Os resultados mostram aumento significativo de dobragem sobre uma célula unspread ± SEM de pelo menos 20 células contadas para cada condição. C.) A549, MDA-MB-231, PC-3, e células mPanc96 foram plaqueadas durante 2 horas, depois filmadas durante mais 18 horas. Velocidade média de células ± SEM em mm /hr foi determinada por detecção e medição dos caminhos de 15 células por rigidez por linha celular. * P . 0,05

quinase de adesão focal (FAK) é uma componente de sinalização crítica de sinalização de integrina e tem sido implicada na percepção da rigidez da ECM [20], [21]. actividade da FAK, tal como medido pela sua autofosforilação sobre tyrosine397, foi apenas modestamente activado como uma função da rigidez da matriz em células A549, e não foi significativamente alterado em outras linhas de células testadas (Fig. S2). Estes dados evidenciam que os comportamentos das diferentes linhas de células de cancro em substratos flexíveis ou rígidas não pode ser simplesmente atribuído a alterações na adesão de sinalização em geral, através da activação da FAK.

As propriedades mecânicas do microambiente regular as propriedades epiteliais e mesenquimais de as células A549

a conversão de células epiteliais normais para malignos metastáticos, homólogos muitas vezes envolve a perda de expressão de e-caderina e a aquisição de um fenótipo mais migratório – um processo denominado epitelial-mesenquimal-a transição (EMT). As células A549 cultivadas em (150 Pa) géis macios durante 5 dias clusters formados sem adesões focais visíveis ou fibras de stress (Fig. 8a). Em contraste, as células em mais rígida (4800 Pa e 19200 Pa) Os géis foram distribuídos e mais dispersa exibindo proeminentes fibras de stress e adesões focais (Fig. 8A), todas as marcas do fenótipo mesenquimal. coloração de imunofluorescência ou análise de transferência de Western de células cultivadas sobre os géis de 150 Pa ou 4800 ou 19200 Pa géis demonstraram regulação positiva significativa da expressão de E-caderina em substratos macios (Fig. 8B-C). No entanto, não houve mudança significativa na expressão da vimentina marcador mesenquimais foi observada em células que crescem em diferentes substratos (Fig. 8C).

a.), As células A549 foram cultivadas durante 3 dias em geles com rigidez de 150 , 4800, ou 19.200 Pa. As células foram fixadas e coradas para a actina (verde) e paxilina (vermelho). As setas indicam as adesões focais. B.), as células A549 foram cultivadas em geles com rigidez de 150 ou 19200 Pa. As células foram fixadas e coradas para a actina (verde) e E-caderina (vermelho). células C.) A549 cultivadas em géis de PA para 3 dias foram lisadas e apagou a expressão da caderina-E, vimentina e actina. D.) Os níveis relativos de mRNA de Slug e E-caderina nas células A549 cultivadas em géis de PA durante 3 dias como medido pelo tempo real de RT-PCR. Os resultados mostram a média ± SEM de três experiências independentes.

O repressor de transcrição Slug é um membro da família do caracol de elementos de ligação de ADN que regula a expressão de E-caderina [22], e tem sido mostrado para ser crítica para conferir um fenótipo metastático num modelo experimental de melanoma [23]. A análise por RT-PCR quantitativa de células A549 cultivadas em substratos de diferentes rigidez revelaram uma supra-regulação de ARNm de Slug quando as células foram cultivadas em geles mais rígidas (4800 e 19200 Pa), em comparação com o gel macio (150 Pa) (Fig. 8D). Os níveis de ARNm do Slug inversamente correlacionada com níveis E caderina-mRNA, que foram mais baixos em células A549 cultivadas sobre os géis mais rígida em comparação com células cultivadas sobre o gel suave, consistentes com alterações observadas na expressão da proteína E-caderina (Fig. 8B-C) . Estes dados indicam que a matriz de rigidez pode modular a E-caderina e Slug em células A549. células Curiosamente, MDA-MB-231, enquanto que exibe proliferação dependente de rigidez, não expressaram níveis detectáveis ​​de E-caderina em cada 150 Pa ou 19.200 Pa (dados não mostrados), sugerindo que estas células, enquanto que morfologicamente se assemelham a células A549 sobre substratos moles e rígidas, não alteram a expressão deste marcador epitelial quando exposto a um microambiente macio.

Discussão

os estudos descritos acima enfatizam a importância das propriedades mecânicas da ECM na regulação proliferação de células de cancro e de sobrevivência. Além disso, descrevemos um sistema de análise eficiente e flexível para determinar como mudanças nas propriedades de células influência rigidez matriz. Análise de 14 linhas celulares de cancro revelou que a alteração da rigidez da matriz revestida de colagénio proeminente altera o crescimento de certas linhas de células de cancro (crescimento “dependente de rigidez”) enquanto teve pouco efeito sobre outras linhas de células de cancro (crescimento “independente de rigidez” ) que cresceu de forma robusta, mesmo em substratos de muito baixa rigidez. As taxas de crescimento mais baixas em géis macios em linhas celulares dependentes de rigidez foram causadas pelo menos em parte pela alteração selectiva na progressão do ciclo celular e a indução de apoptose quando as linhas celulares foram semeadas em matrizes moles. Além disso, as linhas dependente da rigidez mostraram uma diminuição marcada na célula difusão e migração, quando plaqueadas em moles em relação substratos rígidos, e, pelo menos, uma das linhas de células (A549) exibiu uma regulação dependente da rigidez da expressão de E-caderina e a modulação reversível de epiteliais e mesenquimais fenótipo. Finalmente, quando semeadas em pulmões de rato, as linhas celulares dependentes de rigidez não crescer, bem como linhas independentes de rigidez, o que indica uma correlação entre a capacidade de crescer em matrizes suaves

in vitro Comprar e capacidade proliferativa

em

vivo no pulmão.

o ensaio de poços múltiplos macio-plate96 representa uma abordagem relativamente alto rendimento para avaliar o papel de rigidez do substrato sobre as propriedades das células cancerígenas em cultura. Neste sistema, o método de Pelham e Wang [24] foi adaptado para gerar uma placa com múltiplas cavidades, em que o substrato é constituído por geles de poliacrilamida de diferentes graus de rigidez que têm sido funcionalizado de modo a proporcionar uma superfície de ligação de proteínas da matriz extracelular, por exemplo, de colagénio. Nos estudos descritos acima, as placas foram concebidos para abranger cinco níveis de módulos elásticos, que variam 150-9600 Pa, no entanto outros formatos são facilmente criado. O objectivo final do ensaio nos nossos estudos foi a proliferação celular, mas a outros parâmetros, por exemplo, a sobrevivência das células são facilmente configuradas. Tal como ilustrado, o sistema de ensaio proporciona um método rápido e reprodutível para avaliar o papel de rigidez da matriz sobre o crescimento e sobrevivência celular.

Utilizando este ensaio que examinaram um painel de linhas celulares de cancro com o objectivo de determinar como alterações nas propriedades mecânicas da proliferação de células influência matriz. Nove das linhas celulares de cancro exibiu uma dependência de rigidez da matriz para o crescimento, crescimento significativamente melhor em matrizes rígidas /rígidas do que nas matrizes menos rígidas /refrigerantes. As linhas celulares independentes de rigidez exibiu praticamente nenhuma alteração na taxa de crescimento ao longo do intervalo de rigidez da matriz usada nas placas. Surpreendentemente, todas as linhas celulares de cancro examinadas neste estudo eram capazes de proliferar em substratos macios, enquanto que os fibroblastos normais, o músculo liso e células epiteliais exibem uma dependência rigorosa sobre a rigidez da matriz para o crescimento [25]. Este facto reflecte presumivelmente a transformação “oncogénica” das linhas de células de cancro em relação a células normais, eventos que reflectem as múltiplas mutações que caracterizam as células cancerosas. Não está claro neste momento se o perfil de rigidez de um linhas celulares de cancro reflete um ou mais específicas mutações que são adquiridos por uma linha celular individual.

É interessante que as linhas de células que demonstraram crescimento dependente da rigidez também mostrou dependente da rigidez espalhando e migração. Os nossos resultados da análise paralela de uma série de linhas de células de glioma propagadas em substratos poliméricos revestidos com fibronectina de rigidez mecânica definida [26]. Em substratos altamente rígidos ( 100 kPa) as células de glioma espalhar extensivamente, formado fibras de stress proeminentes e amadurecer adesões focais, e migraram rapidamente. No entanto, quando cultivadas em matrizes menos rígidas (valores comparáveis ​​com o tecido normal do cérebro), as células de glioma apareceu arredondadas e não migrar de forma produtiva, semelhante às linhas celulares dependentes de rigidez descritos nos nossos estudos. Curiosamente, a motilidade de células de glioma em substratos altamente compatíveis foi resgatada pela inibição farmacológica da contractilidade baseada actinomyosin, sugerindo que a contractilidade actinomyosin pode ser um componente crítico do aparelho mecanosensorial. Outros estudos têm implicado a FAK, ERK, e a pequena GTPase Rho na regulação do crescimento em resposta a rigidez [16], ou um aumento nos níveis de ciclina D a jusante da activação Rac [25]. Rho GTPases e seus alvos a jusante, que são mediadores críticos de espalhamento das células, a migração, e a contractilidade [27], pode actuar como máquinas mecanosensorial que respondem à rigidez do microambiente. Por exemplo, Ró e o seu efector Rho-cinase (ROCHA) estão envolvidos num loop de feedback que regula tubulogenesis em células epiteliais normais quando são cultivadas em matrizes de colagénio 3-dimensionais macia [28]. Quando as células são cultivadas em matrizes mais rígido, de alta densidade, este circuito fechado de realimentação induz a fosforilação de FAK e ERK, resultando no aumento da expressão dos genes associados com a proliferação, presumivelmente através da activação de Ras dependente de FAK [20]. Embora estas experiências indicam claramente a via de Rho em mecanotransdução em células epiteliais normais, experiências adicionais são necessários para determinar os efeitos da contractilidade e actividade de GTPase Rho sobre o crescimento de células de câncer em substratos macios, em particular em linhas celulares de cancro que abrigam as mutações na via de Ras.

Como demonstrado neste trabalho, a rigidez extracelular afeta o crescimento de certas linhas celulares de cancro, bem como a capacidade de uma linha de células a crescer em um substrato macio

in vitro

pode prever sua capacidade de crescer em um ambiente suave

in vivo

. Além disso, a resposta de um linha de células à rigidez extracelular

in vitro

pode prever sua reação à resposta desmoplastic

in vivo

, ou seja, se um aumento na rigidez do microambiente

in vivo

vai favorecer o crescimento das células tumorais. perfil de crescimento soft-placa de um linha de células também pode prever a sua sensibilidade a drogas terapêuticas em tecidos moles. Por exemplo, a ADN-reticulador mitomicina C tem demonstrado inibir a proliferação de células estaminais mesenquimais de forma mais eficiente em relação rígida substratos macios [29]. Além disso, linhas de células do cancro do pâncreas que expressam marcadores epiteliais, tais como a E-caderina e níveis mais baixos de a vimentina marcador mesenquimais são mais sensíveis ao tratamento erlotinib [30], [31]. Portanto, se uma linha de células (tais como A549) foram a tornar-se mais epitelial semelhante quando cultivadas num ambiente suave, que seria previsto para ser mais sensível ao erlotinib. Além disso estudar tanto

in vitro

e

in vivo

serão necessários para explorar a capacidade preditiva do ensaio soft-placa para determinar as respostas das células de câncer para

in vivo

tecidos moles ambientes e potência terapêutica dentro de tais ambientes.

plasticidade celular, ou a capacidade de transição e para trás entre uma célula epitelial sessile e uma célula mesenquimal migratório, é um fenômeno bem estudado que é fundamental para vários processos fisiológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário, cicatrização de feridas, e progressão do cancro. Uma característica comum a EMT é uma regulação negativa da adesão célula-célula, principalmente através da inibição da expressão de E-caderina, e a aquisição de um fenótipo móveis, juntamente com um aumento da expressão de determinados componentes de infra-estruturas, tais como a vimentina. No entanto, esta transição pode não ser sempre completa, uma vez que existem muitos exemplos de células que se submetem a um EMT “parcial”, em que as células tornam-se móveis por meio da aquisição transitoriamente algumas, mas não todas as características de células mesenquimais [32]. Isto sugere que as células sofrem EMT de um modo complexo e gradual, e nem todos os eventos EMT são necessárias para atingir um fenótipo migratório.