Abstract
Fundo
O DNA mitocondrial (mtDNA) são relatados em diferentes tumores. No entanto, não há informações sobre o desenvolvimento temporal do mtDNA mutações /alteração de conteúdo e sua extensão na mucosa normal e anormal continuamente expostos ao fumo do tabaco em pacientes com câncer de pulmão.
Metodologia
Nós examinamos o padrão de mtDNA alteração (mutação mtDNA e índice de conteúdo) em biópsias da mucosa das vias aéreas 25, tumores correspondentes e linfonodos normais obtidos de três pacientes com câncer de pulmão primários. Além disso, examinou-se o padrão de mutação mtDNA em tumores e nódulos linfáticos normais obtidos a partir de outros oito pacientes com cancros primários de pulmão correspondente. todo o genoma mitocondrial de 16,5 kb foi sequenciado em Affymetrix Mitochip plataforma v2.0 sequenciamento em cada amostra. Para examinar índice de conteúdo mtDNA, foi realizada análise em tempo real PCR.
principais conclusões
As biópsias da mucosa das vias aéreas obtidas de três pacientes com câncer de pulmão foram histopatologicamente negativo, mas exibiu várias mutações do mtDNA clonais detectáveis na tumores correspondente. Uma das pacientes foi operada por duas vezes para a remoção do tumor a partir da parte superior direita e esquerda respectivamente lobo inferior dentro de um período de dois anos. Ambos estes tumores exibiram vinte mutações de ADNmt idênticos. conteúdo MtDNA aumentou significativamente (P 0,001) no cancro do pulmão e todas as biópsias da mucosa histologicamente negativos, exceto um em relação ao nó de controle linfático
Conclusões /Significado:.
Nossos resultados documentar a extensão de remendos clonais maciças que se desenvolvem em fumantes crônicos e, finalmente, dão origem a cancros clinicamente significativas. Estas observações lançar luz sobre a extensão da doença nas vias respiratórias de fumantes rastreáveis através de mutação mtDNA. mutação MtDNA poderia ser uma ferramenta confiável para a avaliação molecular do epitélio respiratório expostos à fumaça contínua, bem como a detecção de doenças e acompanhamento. análise funcional das mutações do mtDNA patogênicos pode ser útil para compreender o seu papel na tumorigênese pulmonar
Citation:. Dasgupta S, Yung RC, Westra WH, Rini DA, Brandes J, Sidransky D (2009) Na sequência mitocondriais Pegadas através um caminho longo das mucosas ao câncer pulmonar. PLoS ONE 4 (8): e6533. doi: 10.1371 /journal.pone.0006533
editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 16 de maio de 2009; Aceito: 06 de julho de 2009; Publicação: 06 de agosto de 2009
Direitos de autor: © 2009 Dasgupta et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por UO1CA084986 concessão EDRN. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o DNA mitocondrial humano (mtDNA) é um 16,5 kb de cadeia dupla fechou molécula circular que codifica para os 12S e 16S rRNAs, 22 tRNAs e 13 proteínas essenciais para o complexo mitocondrial respiratório [1] – [2]. A maioria das células humanas contêm centenas de cópias do DNA mitocondrial (mtDNA) e quase todas estas cópias do mtDNA são idênticos ou seja, no momento do nascimento homoplásmica [1] – [2]. taxa de mutação no mtDNA é aproximadamente 10 vezes mais elevados do que o ADN genómico nuclear (DNAn) [1]. Até à data, as mutações de ADNmt clonais foram relatados em diferentes tumores [3]. Há pouca informação sobre a evolução temporal dessas mutações e sua extensão na mucosa normal e anormal expostos ao fumo do tabaco.
O câncer de pulmão mata mais de 1 milhão de pessoas em todo o mundo com o tabagismo é o fator de risco mais importante [4] . Nos Estados Unidos, havia mais de 215,020 casos de cancro do pulmão e uma morte estimada de 161.840 em 2008 [4]. Apesar da melhora significativa em modalidades terapêuticas, incluindo cirurgia, base de platina quimioterapia e radioterapia sozinho ou em combinação, a taxa global de sobrevida em 5 anos é de apenas 15% [4]. Oitenta e cinco por cento dos cancros do pulmão ocorrem em fumantes de tabaco [4]. Além disso, os pacientes afetados permanecem em risco significativo para o desenvolvimento de segundo tumor primário em toda a sua vida. Assim, o desenvolvimento de métodos adequados para a detecção precoce de doenças, acompanhamento e avaliação contínua das vias aéreas em pacientes com câncer de pulmão primário são de suma importância.
No presente estudo, examinamos o padrão de mtDNA alteração (mutação e conteúdo de DNA) em biópsias da mucosa das vias aéreas obtidas de acompanhamento de pacientes com câncer de pulmão primários. tumores correspondente e nódulos linfáticos normais foram também examinados a partir desses doentes. Todas as biópsias apareceu suspeito e anormal resultante broncoscopia auto-fluorescência, mas foram histologicamente negativo. Mas o mapa das alterações do mtDNA nestas biópsias foi impressionante e forneceu uma perspectiva única sobre a extensão da disfunção mitocondrial e aumento do risco de malignidade em pacientes que continuam a fumar.
Resultados
Pattern of mutação mtDNA na pacientes
a Figura 1 mostra o padrão de mutações mitocondriais na paciente 1. Este paciente foi operada duas vezes dentro de um período de dois anos em ambos os pulmões. O primeiro tumor (T1) foi removido cirurgicamente em 2002 a partir do lobo superior direito seguido pela remoção do segundo tumor (T2) em 2004 a partir do lobo inferior esquerdo. Cinco biópsias da mucosa das vias aéreas foram tomadas a partir da carina principal (M1), inferior direito (M2 e M3) e lobo superior esquerdo (M4 e M5) em torno dos locais de tumor primário em ambos os pulmões, conforme ilustrado. As biópsias da mucosa foram tomadas durante o seguimento deste paciente após a remoção cirúrgica do segundo tumor do lobo inferior esquerdo. Todos os cinco biópsias da mucosa foram histopatologicamente sem evidência de displasia, e ainda exibiu uma gama de 3-11 mutações do mtDNA (Fig. 1). Um total de 16 mutações de ADNmt foram detectados na mucosa do paciente. A primeira biópsia da carina principal exibiu 3 mutações do mtDNA (M1, Fig. 1A). A segunda biópsia exibiu 5 mutações, incluindo 2 sobrepostas mutações com M1 (
A2249C
,
A8341C
, cor correspondente, Fig. 1A-B). A terceira biópsia exibiu 7 mutações do mtDNA, incluindo 3 sobrepostas mutações com M2 (
A3742C
,
G8836C
e
T15982G
, cor correspondente, Fig. 1B-C). A quarta biópsia abrigava 7 mutações do mtDNA, incluindo sobreposição mutações com M3 (
A3742C
,
T3756C
,
G6035C
,
G8836C
e
T15402A
, cor correspondente, Fig. 1A-D), M2 (
A3742C
,
A8341C
e
G8836C
, cor correspondente, Figs. 2B e D) e M1 (
A8341C
, cor correspondente, Fig. 1A-D). A biópsia feita ao lado do tumor no lobo inferior esquerdo exibiu 11 mutações mtDNA incluindo sobreposição mutações com M1 (
A2249C
,
T2516C
e
A8341C
), M2 (
A2249C
,
A8341C
,
G8836C
e
T15982C
), M3 (
C4014A
,
G8836C Comprar e
T15982G
) e M4 (
biópsias
G8836C
) (Fig. 1A-e, cor correspondente) A8341C Comprar e. Ambos os tumores invasivos (T1 e T2) exibiu 20 mutações de ADNmt idênticos, incluindo todos os 16 mutações detectadas na mucosa normal circundante 5 (Fig. 1E-F) (odds ratio 6,9 × 10
10:01). Treze destes 20 (65%) mutações estavam em regiões (COI, COII, ATP6, ND1, ND4 e CYTB) e 7 (35%) de codificação ocorreu em regiões não codificantes (12SrRNA, 16S rRNA, tRNA-lisina, D-laço ) (Fig. 1, F, rectângulo inferior). O adicional de 4 mutações detectadas nos tumores foram representados na Fig. 1E (retângulo de fundo, preto, sublinhado). Dois (
G8836C
e
A8341C) para três mutações do mtDNA (
A2249C
,
A3742C
e
T15982G
) estavam presentes em 4/5 e 3/5 da mucosa, respectivamente, e em ambos os tumores (Fig. 1). fotomicrografias histológicos representativos da mucosa e de tumor são mostradas nas Figs. 1A e 1F. Diferentes códigos de cores correspondem a um padrão de mtDNA mutação específica mostrando a propagação clonal da mutação mtDNA em toda a mucosa e, eventualmente, deu origem aos tumores geneticamente relacionados (Cercado).
O paciente foi operado duas vezes em 2002 e 2004 com a remoção de tumores do lado direito superior (T1) e lobo inferior esquerdo (T2), respectivamente. Cinco biópsias broncoscopicamente anormais das vias aéreas nas mucosas Obtiveram-se após a segunda cirurgia (T2) deste paciente a partir carina principal (M1), lobo superior direito (M2 e M3) e no lobo inferior esquerdo (M3 e M4) que envolve tanto os tumores como descrito (Painel A -E). As biópsias da mucosa exibiu uma gama de 3-11 mutações mtDNA como representado na cor diferente (Painel A-E). Mutações idênticas são mostrados na mesma cor em diferentes biópsias e o tumor. Um código de cor diferente, também foi utilizado para cada mucosa para indicar a progressão clonal das lesões em ambos os pulmões com mutações de ADNmt acumulados. fotomicrografia representativa histológico da mucosa e o tumor foi mostrado no painel A e F. Ambos os tumores T1 e T2 exibiu vinte mutações de ADNmt idênticas (E-F, rectângulo inferior), incluindo todos os 16 mutações exibidas pelos cinco biópsias de mucosas (com correspondência cor). Os 4 mutações de ADNmt adicionais detectados nos tumores são representados sublinhado na cor preta no rectângulo inferior (Painel E-F). Duas mutações do mtDNA (
G8836C
e
A8341C) estavam presentes em 4/5 e 3 outras mutações (
A2249C
,
A3742C
e
T15982G
) estavam presentes em 3/5 biópsias da mucosa. Os tumores são cercados para indicar o seu desenvolvimento a partir das manchas das mucosas clonais. T1: O tumor do lobo superior direito; T2: O tumor do lobo inferior esquerdo; M:. Mucosa
O paciente foi operado em 2005 para a remoção cirúrgica do tumor do lobo superior direito. Cinco biópsias da mucosa das vias aéreas broncoscopicamente anormais foram obtidos a partir de carina principal (M1), lobo inferior direito (M2 e M3) e lobo superior direito (M3 e M4) em torno dos tumores como descrito (Painel A-E). As biópsias da mucosa exibiu uma gama de 2-5 mutações de ADNmt como representado na cor diferente (Painel A-E). Mutações idênticas são mostrados na mesma cor em diferentes biópsias e o tumor. Um código de cor diferente, também foi utilizado para cada mucosa para indicar a progressão das lesões clonal com mutações de ADNmt acumulados. photomicrograph histológica representante do tumor e mucosa normal são mostrados no painel A e D. Os tumores exibiram 9 mutações do mtDNA (representado no retângulo inferior), incluindo todos os 8 mutações exibidas pelos cinco biópsias da mucosa (cor correspondente). Uma mutação mtDNA adicional (
T7001C
) detectado no tumor é sublinhado em preto no retângulo de fundo. Tumor foi cercado para indicar seu desenvolvimento desde os patches mucosas clonais. M:. Mucosa
No caso da paciente 2, cinco biópsias da mucosa foram obtidos a partir da carina principal (M1), lobo inferior direito (M2 e M3) e lobo superior direito (M3 e M4) em torno do primário tumoral no pulmão direito, como mostrado na Figura 2. Todos os 5 lesões eram histologicamente normal, tal como visto no paciente 1, mas exibiu uma gama de 2-8 mutações de ADNmt. A primeira lesão exibiu 2 mutações onde como o segundo exibiram 3 com uma mutação idêntica compartilhada com M1 (
A10995C
, Fig. 2A-B, cor correspondente). A terceira lesão (M3) exibiu 3 mutações do mtDNA com uma mutação sobreposição com M2 (
A14917C
) e M1 (
G8836C
) (Fig. 2A-C, cor correspondente). Na lesão diante (M4), 3 mutações foram detectadas com uma mutação sobreposição (
G8836C
) com M3 e M1 (Fig. 2A-D, cor correspondente). A lesão da mucosa quinta (M5) exibiu 5 mutações incluindo sobreposição mutações do M4 (
A3984C
e
G8836C
), M3 (
A6831C
,
G8836C
e
A14917C
), M2 (A14917C) e M1 (
G8836C
) (Fig. 2A-e, cor correspondente). O tumor primário ressecado do lobo superior direito deste paciente exibiu 9 mutações do mtDNA, incluindo todos os 8 mutações detectadas nos 5 amostras de mucosa aparentemente normais circundantes. Todas estas mutações (9/9) estavam nas regiões de codificação mitocondrial (ND1, COI, ATP6, ND4, Cd5 e CYTB) do DNA mitocondrial (Fig. 2E, rectângulo inferior). A mutação adicional (
T7001C
) detectada no tumor é mostrada na Figura 2E (rectângulo canto inferior direito, preto, sublinhado). Uma mutação mtDNA (
G8836C
) esteve presente em 4/5 e outra mutação (A14917C) esteve presente em 3/5 amostras de tecido da mucosa (Fig. 2). Ambas estas mutações foram também detectados no tumor correspondente (Fig. 2E). fotomicrografias histológicos representativos da mucosa e o tumor são mostradas na Fig. 2A e E). Diferentes códigos de cores correspondem a um padrão de mtDNA mutação específica mostrando a propagação clonal da mutação mtDNA em toda a mucosa e eventualmente deu origem ao tumor geneticamente relacionados (Cercado). Quatro mutações do mtDNA (
G8836C
,
T3756C
,
A3984C
e
A7251C) foram idênticas entre os pacientes 1 e 2 (fig. 1-2) .
o paciente 3 foi um não-fumante com um carcinoma broncoalveolar e exibiu apenas 2 mutações do mtDNA no tumor (Tabela 1). Nenhuma mutação foi detectado na mucosa normal. Uma margem com metaplasia deste paciente também não apresentou qualquer mutação mtDNA (Tabela 1). Estes resultados sugerem uma diferença fundamental na cancerização de campo e extensão de manchas clonais entre um tumor não-fumante. Nós sequenciado outros 8 pacientes para mutação mtDNA e encontrou uma variedade de 1-9 mutações nos tumores primários comparada com o controlo, a maioria das quais eram provenientes das regiões de codificação do DNA mitocondrial (Tabela 2). Outros que mutações do mtDNA somáticas, também detectado alguns germinal sequência de mtDNA variantes nos tumores e biópsias da mucosa de todos os pacientes (Tabela 3) correspondente.
A alteração de conteúdo mtDNA no pulmão doentes com cancro
realizada quantitativa PCR em tempo real para determinar o conteúdo de mtDNA na mucosa do paciente, tumores correspondente, e nódulos linfáticos não-neoplásicas. Com apenas uma única excepção de uma biópsia (Paciente 1, M1) o conteúdo do mtDNA foi significativamente superior (P 0,001) no cancro do pulmão e de todas as biópsias da mucosa histologicamente normais em comparação com o nó de controlo de linfa (Fig. 3). Isto foi verdade mesmo na mucosa e metaplásicas margem identificado no paciente 3, o não-fumante (Fig. 4). MtDNA conteúdo foi aumentada sem uma mutação mtDNA correspondente (Fig. 4). Assim, aumento do conteúdo de mtDNA é uma característica em extensos campos de mucosa de pacientes com câncer de pulmão para fumantes e não-fumantes.
conteúdo mtDNA foi medida por multiplex PCR em tempo real utilizando nuclear β-actina e mitocôndrias codificado codificado gene COI . Uma razão de COI /β -actina corresponde à diferença vezes em comparação com o controlo. conteúdo MtDNA aumentou significativamente (P 0,001) em biópsias da mucosa e tumores correspondentes em comparação com o controlo normal em ambos os pacientes, tal como indicado. N: linfonodo Normal; M: Mucosa; T: tumor. * P valor. 0,05 em comparação com linfonodo normal de
conteúdo mtDNA aumentou significativamente (P 0,05) na mucosa (M), adjacente normal (NT) e na margem metaplásico (MT) em relação ao nó de linfa normais usados como controle.
Discussão
mutações
DNA mitocondrial são frequentes em vários tipos de tumor [3], e detectado em lesões pré-neoplásicas indicando, assim, a sua ocorrência em fases iniciais da progressão do tumor de vários estágios [5]. Detecção de mutação mtDNA é mais fácil e mais fiável em comparação com o DNA nuclear devido ao seu elevado número de cópias em células cancerosas [6] – [7]. Portanto, analisando mutações do mtDNA em um pequeno número de células em diferentes fases da progressão tumoral é possível. A fim de usar mutação mtDNA como uma ferramenta imparcial para a detecção de populações de células clonais, a sequenciação de todo o genoma mitocondrial é necessária e deve ser feito em conjunto com um controlo não-neoplástico apropriada por causa da natureza altamente polimórficos do mtDNA [7]. No presente estudo, a amplificação da quantidade considerável de mtDNA de muito pequenas biópsias de mucosas, de tumores e tecidos normais correspondentes nos permitiu analisar todo o genoma mitocondrial. Isto foi facilmente conseguida sobre a plataforma de alto rendimento de sequenciação Mitochip v2.0 Affymetrix previamente demonstrado ser uma ferramenta fiável para a detecção de mutação mtDNA [5], [8]. Esta versão recente do Mitochip (Comparado com Mitochip v1.0) não só tem uma alta sensibilidade para detecção de mutações abrangendo todo o genoma mitocondrial, mas também capaz de determinar a mutação mtDNA heteroplásmica [8] – [9]. A mutação observada também pode ser verificada por sequenciação convencional. No entanto, Mitochip v2.0 não pode detectar pequena inserção /deleção, pois foi projetado principalmente para detectar a mutação mtDNA. As mutações detectadas no presente estudo eram linha somática ou germinal na natureza e confirmado como não devido a qualquer variação haplotípica [5], [8] – [9]. Assim, todas as mutações de novo detectados e reportados neste estudo estão associados com o fenótipo tumoral.
No paciente 1, os pequenos seguem-se as biópsias foram retiradas de áreas de mucosa das vias aéreas que apareceu anormal resultante Autofluorescence-broncoscopia. Apesar de todas as biópsias foram histopatologicamente negativo e sem alterações displásicas, eles apresentaram várias mutações do mtDNA alguns dos quais foram compartilhadas através de grandes faixas do epitélio das vias aéreas. Estes resultados demonstram a propagação clonal de múltiplas mutações de ADNmt através da mucosa respiratória. propagação clonal de alterações mutação p53 e microssatélites (LOH e mA) a múltiplos focos no epitélio brônquico aparentemente normal foi relatado anteriormente [10] – [12]. No presente estudo, a expansão dramática de clones epiteliais brônquicas mutantes foi rastreado através de mutação mtDNA com grande precisão e de forma imparcial por sequenciação de todo o genoma mitocondrial em todas as amostras.
É provável que as biópsias continham manchas heterogêneos de células com alterações clonais adquiridos pela deriva genética mitocondrial aleatório [7]. Como em um paciente, a maioria dos clones partilhada uma série de mutações de ADNmt idênticos juntamente com mutações adicionais necessários para a expansão clonal (Fig. 5). Os clones mais aptos abrigando mais vantajosas mutações mtDNA /nDNA progrediu através da mucosa e eventualmente deu origem a dois tumores primários aparentemente independentes que são, no entanto, certamente ligadas por mutações do mtDNA idênticos [7], [13]. Detecção de todas as mutações da mucosa do mtDNA em ambos os tumores ressecados dentro de um período de 2 anos, apoia fortemente a sua origem clonal. Além disso, mostrámos também que os dois tumores separados dos pulmões opostas exibiram múltiplas mutações de ADNmt idênticos; as chances de esta ocorrência por acaso são infimamente baixa. O primeiro tumor, provavelmente, desenvolvido a partir de um dos clones mais dominantes espalhadas no pulmão direito depois de adquirir as necessárias alterações mtDNA /nDNA suficientes para promover tumorigênese. O segundo tumor provável desenvolvido da mesma forma no pulmão esquerdo, mas adquiriu nDNA sucessos mutacionais vários meses mais tarde ou caso contrário, poderia ser uma metástase pulmonar. Os dados do paciente 2 também apoiar a extensa propagação clonal de mutações do mtDNA e desenvolvimento do tumor subsequente depois de adquirir mtDNA suficiente e /ou alterações nDNA. A alta resolução do genoma ampla análise destas biópsias de tumores e correspondentes revelou alteração clonal de uma série de genes-chave codificadas DNAn nestes pacientes (observação não publicada) apoiando ainda mais esta noção. No entanto, devido à indisponibilidade, não foi possível examinar o padrão de mtDNA espectro alteração em um número relativamente grande de pacientes.
evolução clonal possível dos tumores de pulmão tem sido retratada. Cada biópsia da mucosa (circulado, M1-M5) compartilhou algumas mutações do mtDNA idênticos (cor correspondente), juntamente com mutações adicionais no campo da mucosa heterogêneo. Os clones mais aptos surgiu nos tumores primários (T1-T2) com as mutações do mtDNA mais selectivos (Total de 20 mutações do mtDNA, 16 foram compartilhados entre M1-M5 como na Figura 1).
A presença de freqüente da linha germinal mtDNA variantes de sequências foi sugerida como um indicador de um fundo genético alta susceptibilidade o que pode facilitar a mutação somática concomitante no mtDNA e nDNA [14]. Detecção de sequência de linha germinal clonal variantes e simultâneas mutações do mtDNA somáticas em tumores e mucosa dos pacientes com câncer de pulmão apoiamos fortemente esta noção.
mutações do mtDNA patogênicos podem indicar por sua contribuição funcional na progressão dos tumores. Entre as mutações do mtDNA observadas nestes pacientes, o G8836C (ATP6) mutação de codificação foi recentemente relatada em pacientes com Neuropatia Óptica Hereditária de Leber (LHON) -como tumores da síndrome e da tiróide [15] – [16]. A conservação inter-espécies do presente nucleótido é alta e esta mutação foi previsto para ser patogénica [15]. Notavelmente, esta mutação mtDNA foi detectada em 8/10 biópsias da mucosa e todos os 3 tumores examinados a partir de ambos os pacientes suportam uma contribuição funcional na tumorigénese. No entanto, uma análise mais aprofundada funcional é necessária para tirar uma conclusão mais definitiva. mutação MtDNA na posição de nucleótido idênticos entre diferentes pacientes de pulmão e câncer renal foram relatados anteriormente [16]. À luz de um contribuindo mutação patogênica /mtDNA, uma mutação mtDNA específico parecia ter sido selecionada em diferentes tipos de tumores. Fizemos observação semelhante no presente estudo e, assim, a ocorrência do G8836C patogênico e outras mutações de mtDNA idêntica observadas entre diferentes pacientes com câncer de pulmão não são susceptíveis de ser devido a contaminações. Nomeadamente, a mutação mtDNA patogénico G8836C detectada em cancro da tiróide e LHON [15] – [16] e, frequentemente, no nosso estudo indica para um papel funcional na progressão do cancro do pulmão
A maioria destas mutações foram encontradas na codificação. regiões do mtDNA que poderia potencialmente levar a uma ruptura do complexo respiratório e resultar em um aumento nas espécies reativas de oxigênio (ROS). Estudos recentes têm mostrado que mutações de ADNmt levar a um aumento da ROS e promover o crescimento de células de tumor, proliferação e metástase [17] – [20]. Um estudo demonstrou um aumento no número de cópias do mtDNA em fibroblastos de pulmão como um evento precoce na resposta ao stress oxidativo [21]. Recentemente, um aumento do teor de mtDNA foi identificado com o envelhecimento e pulmão-tecidos fumadores associado e chefe principal e pescoço escamosas carcinomas de células [22] – [23]. biópsias mucosas histologicamente negativos bem como os tumores de ambos os pacientes exibiram nível significativamente elevado conteúdo de mtDNA. Assim, verifica-se que com a evolução da mutação mtDNA homoplásmica e propagação clonal, teor de mtDNA também aumenta. De nota, algumas mutações (incluindo
G8836C
) eram idênticos em ambos os pacientes que eram fumantes regulares, sugerindo os efeitos de metas comuns de carcinógenos do tabaco no mtDNA. A alta freqüência de mutações do mtDNA entre os fumantes também sugere um papel fundamental para os primeiros mudanças genéticas mitocondriais na progressão dos tumores.
No presente estudo, a progressão clonal de aparecer mucosa respiratória normal histologicamente em tumor foi rastreado através de mtDNA mutações. Este é o estudo mais definitivo para demonstrar que os tumores em 2 as localizações opostas em um paciente (Paciente 1) são clonalmente relacionada. No entanto, não foi possível examinar mais de acompanhamento dos pacientes devido à falta de bio-espécimes. Documentação destes extensas populações clonais com mutações mtDNA lança luz sobre os desafios de abordagens de detecção precoce. Além disso, visando estas mutações mtDNA pode ser útil com base na detecção molecular no escarro e DNA de sangue nas abordagens quimioprevenção e novas terapias biológicas. Uma análise mais aprofundada funcional das mutações do mtDNA comuns nos permitirá compreender melhor o seu papel específico na progressão e chemoresistance câncer.
Materiais e Métodos
Doentes de história e de pulmão espécimes
três pacientes com câncer de pulmão de acompanhamento foram examinados para a mutação mtDNA com o consentimento informado assinado em um Johns Hopkins IRB protocolo aprovado. O paciente 1 era uma mulher de 75 anos que sofreu uma lobectomia superior direita, em 2002, para uma IIB carcinoma de células escamosas pouco diferenciado fase (T3N0MX). Em 2004, ela sofreu uma lobectomia inferior esquerda para uma segunda fase IIB (T2N0MX) carcinoma de células escamosas. O paciente 2 era um homem de 58 anos, que em 2005 sofreu uma lobectomia superior direita para um estágio IA (T1N0MX) carcinoma de células escamosas moderadamente diferenciado. Ambos os pacientes eram fumantes regulares para mais de 10 anos. Paciente 3 era uma mulher de 48 anos que sofreu uma lobectomia superior direita para um estágio carcinoma IA (T1N0MX) bronquioloalveolar. Este paciente foi um não-fumante. Durante o acompanhamento, as biópsias da mucosa das vias aéreas foram tiradas de áreas suspeitas de leve a moderada a displasia grave ou carcinoma in situ (CIS) com base na auto-fluorescência-broncoscopia (R. Y. e J. B.). Todas as amostras de biopsia foram tomados ao mesmo tempo. As biópsias foram histologicamente avaliadas por um patologista pulmonar (W.H.W). Os tumores pulmonares cirurgicamente ressecado também foram obtidos a partir de cada paciente. Como um controlo, nódulo linfático normais combinados livre de tumor foi utilizada em cada caso. Além disso, nós também sequenciados combinado tecidos normais e tumorais de outros 8 pacientes com câncer de pulmão (Tabela 4).
toda mitocondrial amplificação do genoma e sequência
O DNA genômico foi extraído de acordo com a nossa protocolo padrão a partir dos tecidos tumorais e outras amostras microdissecadas [5]. Nós amplificado de DNA genómico total mitocondrial de 10 ng de molde de ADN genómico utilizando repli-g kit de amplificação de ADN mitocondrial de acordo com o protocolo do fabricante, conforme descrito anteriormente [8]. O ADN amplificado foi então purificado utilizando o kit de ADN MINIAMP limpeza (Qiagen, Valência). Foi examinada a pureza do DNA mitocondrial amplificados e a contaminação de ADN nuclear por análise de PCR utilizando o iniciador específico para mitocôndrias codificados COXI /COXII e nuclear codificado β-actina. Quatro a quinhentos nanogramas de mtDNA purificado foi utilizado para a sequenciação na plataforma Affymetrix MitochipV2.0 [5], [8].
Mitochip v2.0 análise de arranjo de sequenciamento
Foi realizada fragmentação, rotulagem e Chip hibridação do DNA mitocondrial, conforme o protocolo Affymetrix com controlos adequados, tal como descritos anteriormente [5], [8]. A análise dos dados foi realizada utilizando software Affymetrix GSEQ ea Revista Cambridge Sequência de referência (valores RCR) foi utilizada como sequência de referência [24]. O software MitoAnalyzer também foi utilizado para verificar que as mutações de ADNmt nas posições de nucleótidos diferentes, como descrito anteriormente [5], [8] .Somatic mutações foram identificadas como as alterações de pares de bases no mtDNA em comparação com a sequência normal de mtDNA encontrado em nódulos linfáticos livres de tumor. mutações de linhas germinativas foram identificadas como as alterações de pares de bases presentes nos linfócitos normais, bem como tecidos tumorais e /ou amostras de margem em comparação com a valores RCR [14]. Uma linha germinal variante de sequência foi designado como novo quando ausente no banco de dados mitocondrial humano e outros estudos relevantes nas mesmas haplogroups [14], [25]. Sequência variantes anteriormente relatados em diferentes doenças, incluindo câncer são designados como patogênico, [25].
Quantitative PCR em tempo real
Para examinar o conteúdo mtDNA, foi utilizado o sistema de detecção [14] 7900HT sequência (Applied Biosystems, Foster City, CA) para amplificar DNA nuclear (nDNA) codificado β-actina e mtDNA codificado citocromo C oxidase I (COI) usando o modelo de ADN genómico como descrito anteriormente [26].
a análise estatística
Student
t
-test foi realizada para determinar a significância estatística. valor de P inferior a 0,05 foi considerado significativo. Todos os valores P gerados eram dois lados.
Odds ratio
As probabilidades de 20 aleatórios mutações do mtDNA idênticos que ocorrem por acaso em dois tumores separados localizados nos pulmões opostos do mesmo paciente foram calculadas como [ ,,,0],(tamanho do genoma) x (mutações)] × [(tamanho do genoma) x (mutações)] seja [16,499:1 × 20] × [16,499:1 × 20] = 6,9 × 10
10:01 [27].