Abstract

Fundo

CD44 é um grande receptor celular para ácidos hialurônico. A estrutura de haste de CD44 codificado por dez exons normais pode ser ampliada por dez exons variantes (v1-v10) por splicing alternativo. Tivemos sucesso na preparação MV5 IgM totalmente humanos e o seu anticorpo ligado classe GV5 IgG monoclonal (mAb) que reconhece o domínio extracelular de uma isoforma CD44R1 que contém a região inserida codificada pela variante (V8, V9 e V10) exões e é expressa na superfície de várias células cancerosas epiteliais humanas.

métodos e principais conclusões

Nós demonstrou a inibição do crescimento de xenoenxertos de cancro humano por um IgG mAb GV5 remodeladas a partir de um MV5 IgM. O epítopo reconhecido por MV5 e GV5 foi identificado como uma região de codificação de V8 pela análise de ligação de mAb a várias proteínas CD44 recombinantes por ensaio imunossorvente ligado a enzima. GV5 mostrou reactividade preferencial contra várias células humanas malignas contra as células humanas normais avaliadas por citometria de fluxo e análise imuno-histológica. Quando as células de carcinoma do cérvix uterino humano ME180 foram inoculadas por via subcutânea a ratinhos atímicos com GV5, observou-se inibição significativa da formação de tumor. Além disso, as injecções intraperitoneais de GV5markedly inibiu o crescimento de tumores estabelecidos visíveis à HSC-3 células de carcinoma da laringe humano que tinham sido transplantadas subcutaneamente uma semana antes do primeiro tratamento com GV5. A partir de

in vitro

experimentos, citotoxicidade celular dependente de anticorpos e internalização de CD44R1 parecia ser possíveis mecanismos para

in vivo actividade anti-tumoral

por GV5.

Conclusões

CD44R1 é um alvo molecular excelente para a terapia de mAb de câncer, possivelmente superior a moléculas alvo de mAb terapêutica existente, como Trastuzumab e Cetuximab reconhecendo crescimento epidérmico família do receptor do factor humano

Citation:. Masuko K, Okazaki S, Satoh H, Tanaka L, Ikeda T, R Torii, et ai. (2012) efeito anti-tumoral contra o cancro xenoenxertos humano por um anticorpo monoclonal totalmente humano para uma variante de 8 epitopo de CD44R1 expressa em células-tronco do câncer. PLoS ONE 7 (1): e29728. doi: 10.1371 /journal.pone.0029728

editor: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapura

Recebido: 15 Agosto, 2011; Aceito: 02 de dezembro de 2011; Publicação: 17 de janeiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Masuko et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo Projeto “Academic Frontier”, da Universidade de Kinki (2005-2007) e do Projeto “Antiaging Center”, da Universidade de Kinki (2008-2012) para as Universidades Privadas: combinando subsídio fundo do MEXT (Ministério da Educação, Cultura, Esportes , Ciência e Tecnologia), e também apoiado pela “a-PASSO (Programa de Transferência adaptável e Seamless Tecnologia através Research Development)” Projecto (2009-2011): subsídio de fundo de correspondência do Japão Agência de Ciência e Tecnologia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Nesta investigação, o autor correspondente (TM) colaborou com Kohjin Bio Co., Ltd no estudo de ADCC, com Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd no uso de ratinhos KM, e com a link Genomics, Inc. no estudo de imuno-histoquímica. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

CD44 é um tipo I glicoproteína de superfície celular, que funciona como a maior adesão celular molécula para ácidos hialurónicos [1] – [3]. CD44 padrão (CD44s) codificadas pelos exões dez normais (ex1-5 e ex16-20) pode ser aumentado com as inserções codificados por várias combinações de exões variantes (ex6-15 ou V1-V10) de CD44 por splicing alternativo [3] , [4]. Embora o significado fisiológico do splicing alternativo do CD44 permanece pouco claro, algumas moléculas de CD44 (CD44v variantes) foram relatados a ser sobre-expressa em vários tumores de roedores e sistemas humanos [5] – [8].

Entre muitos CD44v, CD44R1 [7], [8], que tem uma região inserida codificada por V8 (EX13), V9 (EX14) e V10 exões (EX15) é selectivamente expresso em vários cancros epiteliais humanos. Por exemplo, o ARNm CD44R1 é elevada em cancros do cólon, da bexiga, do pulmão, da laringe e da mama humanos [8], e a análise imuno-histológica (HAI) também revelaram que a proteína CD44R1 foi sobre-expresso em amostras pleurais pulmão em comparação com o que, em tecidos normais adjacentes, utilizando anticorpos policlonais de coelho produzidos contra a proteína CD44 recombinante [8]. Além disso, temos demonstrado recentemente que homólogo de rato de CD44R1 humana é expressa em regiões pré-cancerosas, possivelmente contendo células-tronco cancerosas (CSCs) ou células iniciadoras de tumores, durante a carcinogênese gástrica do rato [9], [10].

no entanto, uma vez que os anticorpos totalmente humanos específicos monoclonais (mAbs) que reconhecem o domínio extracelular de CD44R1 humano expresso em células vivas de tumor não estiveram disponíveis, até agora, a avaliação exacta do efeito terapêutico de anti-CD44R1 mAb em malignidades humanas continua a ser realizada. Neste estudo, relatamos a inibição do crescimento de xenoenxertos de cancro humanos em ratinhos atímicos por localmente ou sistemicamente administrada mAb completamente humano reconhecendo CD44R1, e discutir a especificidade, a mecanismos anti-tumorais e utilidade de CD44R1 anti-mAb plenamente humano na terapia do cancro.

resultados e Discussão

CD44, que se liga hialuronatos, é uma molécula de marcador credível para os CSCs [11] – [16], e está significativamente envolvida na metástase de células tumorais [16] – [ ,,,0],19]. Assim, CD44 é considerado para ser um alvo molecular promissor para a terapia do cancro utilizando o mAb. Desde CD44s é expressa em vários tecidos normais [20], temos nos concentrado em proteínas CD44v tumor-seletiva emenda-variantes. Entre mais de 1000 proteínas emenda variante CD44v teoricamente possíveis [21], CD44R1 tendo a inserção codificados por v8, exons v9 e v10 é expresso selectivamente em várias células cancerosas epiteliais [8].

Temos recentemente preparou cinco anti CD44 -sangue humano mAb plenamente humano IgM (MV1 contra CD44s e MV2, MV3, MV4 e MV5 contra CD44R1) a partir de fusão de células entre as células de mieloma e células de baço de ratinhos Kirin-Medarex (KM) [22] imunizadas contra proteínas CD44 humanos recombinantes produzido em

Escherichia coli

. Neste artigo, apresentamos a preparação de comutação de classe anti-CD44R1 IgG humana mAb (GV5), especificidade de MV1, MV5 e GV5, e

in vivo

e

in vitro

anti- tumoral de GV5.

totalmente humano IgM e IgG mAb contra proteínas CD44 humanos foram produzidos

Cinco CD44 anti-humano plenamente humano IgM mAb (MV1, MV2, MV3, MV4 e MV5) foram produzido contra um CD44 recombinante (R 1a; Δex5-v8-v9-v10-Δex16) proteína produzida no

Escherichia coli

[8]. MV1 RH7777 feito reagir com células de hepatoma de rato expressando CD44s ou CD44R1, e MV2, MV3, MV4 e MV5 reagiu especificamente com as células RH7777 que expressam CD44R1 (dados não mostrados). Para avaliar a reactividade do mAb humano com

In vivo

tumores, foi realizada IHA (Fig. 1). MV1 e MV5 definitivamente manchada membranas celulares de

in vivo

tumor do ME180 uterino humano câncer do colo desenvolvido em ratinhos atímicos, e CD44R1 foi heterogênea expressa em xenoenxertos de cancro humanas, embora MV2, MV3 e MV4 apresentaram reações relativamente fracos em comparação com MV5 (Fig. 1). Portanto, temos reformulado (classe-comutado) MV5 IgM humano para GV5 IgG humana. Reatividade de GV5 com

In vivo

tumores de ME180 também foi positiva na membrana celular destas células de tumor (Fig. 2), e CD44R1 foi expressa heterogeneamente no tumor como no caso com a coloração do ME180 tumor por MV5. Em contraste, a expressão de HER2 reconhecido com trastuzumab foi relativamente uniforme no tumor ME180, e a expressão de CD20 reconhecida pelo rituximab foi completamente negativo.

As secções de tecido de tumores ME180 humanos desenvolvidos em ratinhos atímicos foram fixadas com PFA , e foram sequencialmente incubadas com o mAb humano, específico das espécies biotinilado anti-humano IgG + IgM (H + L), o reagente ABC e solução de substrato contendo DAB e H

2O

2. Os núcleos foram corados com hematoxilina.

As secções de tecido de tumores ME180 humanos desenvolvidos em ratinhos atímicos foram fixadas com acetona fria, e foram sequencialmente incubadas com mAb primário, espécie-específicos biotinilado anti-IgG humana Fcy, ABC reagente e de solução de substrato contendo DAB e H

2O

2. Os núcleos foram corados com hematoxilina. Superior ou painéis inferiores mostram, respectivamente, baixa ou alta ampliação dos tecidos manchados.

Foram determinados

A especificidade e epitopo de totalmente humano MV1 e MV5 IgM e IgG GV5 mAb contra CD44 comutação de classe

Especificidades de MV1, MV5 e GV5 foram comparados quanto à reactividade com células de rim embrionárias humanas que expressam HEK293F CD44R1 ou CD44s (Fig. 3A), como descrito noutro local [10], [23]. MV5 e GV5 reagiu especificamente com a proteína fluorescente CD44R1-verde (GFP) células -expressing de forma GFP-dependente de expressão; No entanto, estes mAb não reagiram com células expressando GFP-CD44s, demonstrando que GV5 mantém a especificidade de MV5 e reconhece especificamente uma proteína CD44R1 humano por citometria de fluxo (FCM). Em contraste, MV1 reagiram com células expressando HEK293F CD44s-GFP ou GFP-CD44R1. A especificidade de mAb humano também foi fundamentada por análise de FCM usando células de rato RH7777 transfectadas com ADNc de CD44s humanos ou CD44R1 (dados não mostrados). Em seguida, MV1, MV5 e GV5 foram avaliados quanto à reactividade com CD44 várias proteínas recombinantes humanos fundidos com glutationa-S-transferase (GST) (Fig. 3B). R1a é um imunogénio para a produção de anti-CD44 mAb humano, e R1b contém polipéptidos mais curtos em regiões eX5 e V8 que R1a. O epitopo definido com mAb totalmente humano foi localizado a uma região codificante para EX5 MV1, e uma região codificante para V8 MV5 e GV5 por ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA). O epitopo péptido definido com MV5 ou GV5 parecia ser expostos em células humanas porque estes mAb definitivamente e, especificamente, feito reagir com células HEK293F expressando CD44R1, embora CD44R1 é fortemente glicosilada e a expressão desses epitopos poderia ser afectada pela glicosilação que varia entre tipos celulares ou condições celulares.

(a) MV1 (esquerda), MV5 (meio) e GV5 (direita) foram comparados quanto à reactividade com células que expressam HEK293F humano CD44R1-GFP (superior) ou CD44s-GFP humanos (inferior) pela FCM. (B) A reactividade de anticorpos contra várias proteínas recombinantes CD44 fundida com GST (R 1a e R 1b; Δex5-V8-V9-V10-Δex16, V8, V9, V10 e EX5) fundida com GST foi determinada por ELISA. Diferença no comprimento de Δex5 e Δex16 entre proteínas recombinantes R1a e R1b é descrito em “Materiais e Métodos”.

Anti-CD44R1 GV5 plenamente humano reage seletivamente com linhas de células de carcinoma humano, mas não com vários células normais humanos

Alguns dos mAb terapêutica existente são direcionados para o receptor de crescimento epidérmico humano (HER) da família [24] – [27]. Comparou-se a reactividade de GV5, Cetuximab (anti-HER1) e trastuzumab (anti-HER2) com células HCT116 do cancro do cólon humano, queratinócitos epidérmicos humanos normais (NHEK) e células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) (Fig. 4A, C) . GV5, Cetuximab e Trastuzumab foram definitivamente reativa com células de câncer humano HCT116. GV5 reagiu fracamente com NHEK, embora Cetuximab fortemente e Trastuzumab reagiu moderadamente com NHEK. Além disso, GV5 foi quase não reactivo com HUVEC, embora Cetuximab e trastuzumab reagir substancialmente com HUVEC. Em seguida, examinámos a reactividade de GV5 contra várias linhas de células humanas adicionais (Fig. 4B). GV5 definitivamente reagiu com vários cancros epiteliais humanas cultivadas (peito BT20, estômago KATOIII, LS-174T cólon, colo do útero ME180, KPK-1 nos rins e KU-1 bexiga), embora este mAb não reagiu ou apenas fracamente reagiu com Molt-4 T leucemia, SK-MEL-37 de melanoma e linhas celulares não cancerosas de pele de um adulto (EK325), intestino fetal (Int407) e de rim de embrião (HEK293F). GV5 também reagiram com MKN-7 estômago e linhas celulares de carcinoma do cérvix uterino HeLa-S, mas não com L-2os osteossarcoma, células Jurkat, células Daudi e linhas de células de leucemia HL60 (Fig. 4C). Expressão de CD44R1 em muitas células de carcinoma era heterogénea (Fig. 4B), como nos casos de xenoenxertos humanos em ratinhos atímicos (Fig. 1, Fig. 2). Além disso, GV5 não reagem com pequenos linfócitos em repouso de todo; é também de interesse que não reagiu com linfócitos estimulados com recombinante humano da interleucina-2 (IL-2) durante 48 h ou 12

O

tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) mais de Ca ionóforo ( A23187) durante 24 h, indicando que os linfócitos T e B activadas não são reactivos com GV5 (Fig. 4C). A especificidade de GV5 CD44R1 indica que é uma molécula-alvo de tumor-selectiva e superior em comparação com HER1 ou HER2. De facto, a toxicidade grave da pele foi observada no tratamento de cetuximab contra doentes com cancro do cólon, provavelmente por causa de se ligar a HER1 em queratinócitos de pele. No contexto da expressão de HER2, GV5 reagiu fortemente com uma linha celular de cancro da mama triplo negativo BT20 que não expressam receptores de estrogénio e de progesterona e HER2, embora este mAb não reagiu com a expressão de HER2-sobre-SK-BR-3 A linha celular de cancro da mama (Fig. 4B, C). Portanto, esperamos que o anti-CD44R1 mAb terapêutico poderia compensar anti-HER2 mAb na terapia de câncer de mama.

GV5, Cetuximab e Trastuzumab foram comparados para a reactividade com HUVEC, NHEK e HCT116 pelo FCM (histogramas ) com um fluxo de Accuri C6 citómetro (A). Reatividade de GV5 com várias células humanas foi analisada por FCM, e descrito como histogramas (B) usando um BD-LSR citometria de fluxo e como ΔMFI (C) usando um fluxo Accuri C6 citômetro.

CD44R1 foi especificamente detectado em tecidos de cancro epiteliais humanas

primeiro, a distribuição de CD44s CD44R1 e em cancros humanos foi analisada com o mAb de rato (RV7 e RV9) contra o CD44 humano, uma vez que a imunocoloração de tecidos humanos com GV5 seguido por anti-humano imunoglobulinas não resultar no resultado óbvio (dados não mostrados). Em IHA em tecidos da mama e do cólon humano (Fig. 5), ambos os CD44s definida-RV7 e CD44R1 (V8) foram definitivamente expressa na membrana celular de células da mama e cancro do cólon, apesar de CD44s mas não CD44R1 também foi expressa em definido pelo RV9 células do estroma. Expressão de CD44R1 em células epiteliais normais da mama era baixa e foi negativa em células epiteliais do cólon. Além disso, CD44R1 foi expressa heterogeneamente em células de cancro, como no caso com a coloração de xenoenxertos de cancro humano (Fig. 1 e Fig. 2) e linhas celulares de cancro (Fig. 4B) por GV5 anti-CD44R1 mAb humano. Em IHA em amígdalas humanas, RV9 anti-CD44R1 (V8) mAb fracamente coradas do epitélio, especialmente as células na camada basal, mas não coraram as células linfoblastóides no centro germinal do tecido tonsilar, embora RV7 anti-CD44s mAb células definitivamente coradas nesta região, em adição às células em todo o epitélio (dados não mostrados). Estes resultados coincidem com a bem unreactivity de GV5 com linfócitos humanos activados (Fig. 4C). Estes resultados de FCM e IHA demonstraram excelente especificidade de cancro-CD44R1, sem dúvida, superior à de CD44s. A seguir, examinou a reactividade dos GV5 biotinilado com amostras de tecidos humanos. GV5 reagiu definitivamente com carcinomas escamosos de colo uterino (câncer primário), pele (câncer primário) e pulmão (cancro metastático aos tecidos moles), adenocarcinomas do estômago e cólon, mas não com nódulos linfáticos agregados de apêndice vermiforme (Fig. 6). Assim, a expressão de CD44R1 é limitado a cancros epiteliais, e não é elevado no processo de activação dos linfócitos

In vitro

ou

In vivo

, embora a expressão de um dado oncoproteína intrínseca em linfócitos é muitas vezes sobre-regulada por vários estímulos de ativação [28], [29].

A reactividade de CD44s anti-humanos ou CD44R1 mAb de rato anti-humano (v8) com seções de mama e de tecido do cólon de espécimes cirúrgicos humanos foi analisados ​​com imunoperoxidase coloração ABC. Secções de PFA-fixo e tecidos da mama e do cólon humanos embebidos em parafina foram tratadas com microondas em tampão de citrato para a recuperação de antigénios, e incubadas com mAb RV7 ou RV9 rato. Depois de ter sido lavada em PBS, as secções de tecido foram sequencialmente incubadas com IgG-espécies específicas de burro biotinilada anti-rato (H + L), o reagente ABC e solução de substrato contendo DAB e H

2O

2. Os núcleos foram corados com hematoxilina. tecidos não-cancerosas ou câncer: espécimes de um paciente idênticos.

As secções de PFA-fixo e tecidos humanos embebidos em parafina foram tratados com microondas em tampão citrato para a recuperação de antígenos, e incubadas com biotinilado GV5. Depois de ter sido lavada em PBS, as secções de tecido foram incubadas com solução de substrato e reagente ABC contendo DAB e H

2O

2. Os núcleos foram corados com hematoxilina.

Anti-CD44R1 mAb humano GV5 exibiu

in vivo

efeito terapêutico em carcinomas humanos em modelos de xenotransplante

GV5 foi avaliada para anti- efeito tumoral contra tumores humanos em ratinhos atímicos. O tamanho de cada tumor foi periodicamente medido formado, como descrito noutro local [30] – [32]. Em primeiro lugar, foi examinado GV5 para o efeito sobre a formação do tumor por células do cancro do colo do útero humano ME180 em um modelo de tumor de neutralização [33]. Este modelo para avaliar o efeito local de anticorpos contra o crescimento do tumor historicamente originado a partir do teste de Winn [34] destinado a avaliar o efeito anti-tumoral de linfócitos T citotóxicos. As células cancerígenas foram inoculadas por via subcutânea a ratinhos atímicos com ou sem GV5 (50 ug /sítio), e o crescimento do tumor em GV5 treatedmice foi significativamente inibida comparada com a dos ratinhos de controlo (Fig. 7). Em seguida, foi examinada para GV5 efeito anti-tumoral contra um cancro da laringe humano HSC-3 num modelo de tumor estabelecido [35]. Neste administração sistémica do mAb a ratinhos portadores de tumor, que deliberadamente adoptada por via intraperitoneal mas não injecção intravenosa para a administração de uma quantidade exacta de mAb para cada ratinho. Sete dias após a HSC-3 células foram inoculadas por via subcutânea a ratinhos atímicos e um tumor visível em cada ratinho foi confirmada, controlo de veículo GV5or foi intraperitonealmente injectada duas vezes com um intervalo de uma semana. Neste modelo experimental, o crescimento do tumor em GV5 treatedmice foi novamente significativamente inibida comparada com a dos ratinhos de controlo (Fig. 8).

foi adoptada modelo de tumor de neutralização. células de tumor humano ME180 (1,0 × 10

6), com ou sem mAb (50 ug /sítio) em 200 ul de PBS foram inoculadas subcutaneamente no flanco dorsal direito de cada animal. O tamanho de cada tumor formado foi medido periodicamente, e o volume do tumor (mm

3) foi calculada pela fórmula 0,4 × (comprimento) x (largura)

2. Os resultados foram analisados ​​estatisticamente pelos testes ANOVA de duas vias com medidas repetidas.

modelo de tumor estabelecida foi adotada. Sete dias após a HSC-3 células de tumor derivadas de carcinoma da laringe humano (1,0 × 10

6) em 200 ul de PBS foram inoculadas por via subcutânea a ratinhos atímicos e tumor visível em cada ratinho foi confirmada, a 500 ul de PBS com ou sem GV5 (100 ug) foi inoculado por via intraperitoneal no dia 7 e no dia 14 (setas verticais). O tamanho de cada tumor formado foi medido periodicamente, e o volume do tumor (mm

3) foi calculada pela fórmula 0,4 × (comprimento) x (largura)

2. Os resultados foram analisados ​​estatisticamente pelo Student dos dois lados

t

testes (superiores), e pelos testes ANOVA de duas vias com medidas repetidas (inferior). As barras verticais mostram desvios-padrão.

GV5 induzida internalização de CD44R1 e ADCC

in vitro

Para analisar os mecanismos da

in vivo

efeito anti-tumoral de GV5 contra xenoenxertos de cancro humano em ratinhos atímicos, internalizações de CD44R1, citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e citotoxicidade dependente de anticorpos celular (ADCC) pela GV5 foram examinados. Uma vez que a disfunção de CD44R1 pelo mAb pode levar a inibição do crescimento ou morte celular das células cancerosas através de uma falta de sinal a partir de um substrato de adesão, examinámos o efeito de GV5 sobre a distribuição de proteínas de superfície celular CD44. Através da adição de GV5 para a cultura de células HSC-3 durante 12 horas, aproximadamente 50% de proteínas CD44R1 desaparecido da superfície da célula (Fig. 9A). CDC usando GV5 combinado com rato, coelho ou soro humano não resultou na morte de células de tumor (Fig. 9B). Em ADCC, os esplenócitos de ratos atímicos foram pré-cultivados com IL-2 durante 12 h para aumentar a actividade de morte de células efectoras. Através da utilização de células efectoras-tratados com IL-2, GV5clearly aumentada a citotoxicidade contra HSC-3 células de tumor em ADCC (Fig. 9C, D).

(A) As células foram cultivadas HSC3 com ou sem GV5 ( 10 ug /ml) durante 12 h, e foram imunocoradas com GV5 seguido de burro conjugado com FITC anti-IgG humana (H + L). CD44R1 proteínas de superfície celular nessas células foram detectados por FCM. As experiências foram repetidas três vezes, e foram obtidos resultados semelhantes. (B) Depois de células HSC e 3-soros para o complemento e o mAb foram misturados e incubadas em cada poço de L com fundo de placa de 96 poços, durante 1 h, DAPI foi adicionado a cada poço. Percentagens de células DAPI-coradas (células mortas) foram calculados pela FCM. As experiências foram repetidas três vezes, e foram obtidos resultados semelhantes. (C) As células HSC-3 (1,5 x 10

5) foram misturadas com células efectoras de esplenócitos (3 × 10

6 ou 9 × 10

6) de ratinhos nus KNS, que foram pré-cultivadas durante a noite com IL-2, com ou sem mAb, em cada poço de L com fundo de placa de 96 poços, durante 5 h, e PI foi adicionado a cada poço. A citotoxicidade foi analisada utilizando um citómetro de fluxo Accuri. células alvo humanas R1, HSC3; R2, células efectoras de ratinho; R3, PI-coradas células mortas no R1; R4, células vivas PI-imaculado em R1. (D) morte celular (%) de células HSC-3 por células efectoras do rato (E /T = 0, 20 ou 60), com ou sem GV5 foi representada graficamente. E /T significa efector para alvo ratio.

GV5 induzida ADCC eficiente com células efetoras humanos

Uma vez que confirmou a actividade de ADCC GV5 com células de rato efetoras, nós próxima examinados actividade de ADCC GV5 com células efectoras humanas. GV5 mostraram actividade ADCC significativa contra HSC-3 células de tumor com linfócitos de IL-2-estimulados humanos de sangue periférico (PBL), como células efectoras, mesmo a um baixo efector /alvo (E /T) proporção de 2,5 (Fig. 10A). A uma razão E /T de 10, GV5 demonstraram um aumento de citotoxicidade contra células HCS-3 em comparação com células efectoras humanas sozinhas, em todos os pontos de tempo entre 2 h e 7 h (Fig. 10B).

3-HSC As células foram marcadas com calceína-AM, e as células (2 x 10

5) foram misturadas com células efectoras de PBL humano (5 × 10

5 ou 2 × 10

6), que foram pré-cultivadas durante a noite com IL-2 com ou sem mAb em cada poço de L com fundo de placa de 96 cavidades durante 7 h. A citotoxicidade foi avaliada pela libertação de calceína-AM por células tumorais mortas para o meio, e os resultados foram registados automaticamente usando um VP microfluorocytometer Terascan em intervalos de 1 h durante 7 h. Os resultados foram analisados ​​estatisticamente pelos testes ANOVA de duas vias com medidas repetidas (a) e por Student dos dois lados

t

testes (A e B). Manchas e barras verticais mostram, respectivamente, médias e erros padrão.

Neste estudo, temos produzido com sucesso mAb GV5 totalmente humano que reconhece especificamente CD44R1, e demonstrou a inibição do crescimento de xenoenxertos cancerosas humanas em ratinhos atímicos por GV5 . Quanto aos mecanismos anti-tumor contra xenotransplantes humanos por GV5 em camundongos atímicos, tentaremos propor a contribuição de internalização induzida de CD44R1 por GV5 e citotoxicidade aumentada no ADCC por células efetoras rato com GV5. Esperamos também que GV5can exibir um efeito terapêutico mediada por ADCC em malignidades humanas, uma vez que GV5has mostraram atividade ADCC com PBL humano como células efetoras. Efeitos do anti-CD44R1 mAb sobre a incorporação de hialuronato estão agora sob investigação; No entanto, já confirmado que GV5 poderia induzir a internalização de CD44R1 partir da superfície celular, o que sugere possíveis efeitos sobre a incorporação de hialuronato e efeito anti-tumoral aumentada deste mAb, para além de actividade de ADCC.

Recentemente, mAb quimérico ou humanizado específico contra os domínios extracelulares de HER2 [24], [25], HER1 [26], [27] e CD20 [36] – [38] foram introduzidos para o tratamento de cancro da mama, cancro colo-rectal ou B malignidades de células, respectivamente. Apesar de fase I de ensaios clínicos com anti-CD44v6 mAb quimérico contra carcinomas de células escamosas recentemente foram realizados [39] – [41], a toxicidade cutânea grave foi observada, provavelmente por causa da ligação a CD44v6 em queratinócitos da pele [39], [40]. Neste contexto, a reactividade dos GV5 com queratinócitos humanos normais de pele foi negativo ou desprezável (Fig. 3A), sugerindo baixa toxicidade para a pele do nosso anti-CD44R1 (V8) mAb totalmente humano.

evidência acumulada tem mostrado que CD44 é caracteristicamente expressa em CSCs de várias origens de tecidos [11] – [16]. Agora vamos nos concentrar nossa atenção em CD44v (CD44R1), mas não CD44s expressa na superfície das CSCs na região pré-cancerosas de adenocarcinomas gástricos de

K19-Wnt1 /C2mE

camundongos transgênicos [9], [10]. Reatividade de GV5 com ME180 ou HSC-3 parecia relativamente heterogêneo; No entanto, a formação de tumores ou crescimento do tumor foi quase completamente inibida por GV5, sugerindo que CSCs são compostas principalmente de CD44R1

células GV5 reactivos elevados, mas não da CD44R1

células de baixa GV5-não reactivos. Neste contexto, os nossos dados recentes forneceram evidências de que a expressão de CD44R1 e sua associação com xCT antiporter cisteína-glutamato, uma cadeia subunidade luz do CD98 oncoproteína [10], [23], [30] – [32], [42 ], [43], bloquear as espécies de oxigénio reactivas (ROS) de stress induzida por sinalização que resulta na paragem do crescimento, diferenciação celular e senescência, e, assim, promover a proliferação de células de cancro e a formação de tumores gastrointestinais letais [44]. Dado que CSCs CD44R1 expressam desempenhar um papel central na resistência à terapia do câncer, ele deve ser postulado que mAb terapêutico poderia ter como alvo a

população celular de alta CD44R1 no câncer.

Nosso presente analisa fortemente indicam que a terapia do cancro com anti-CD44R1 mAb totalmente humano é promissora, especialmente contra vários cancros epiteliais humanos, tais como adenocarcinomas da mama, estômago e cólon, carcinoma de células de transição da bexiga e carcinoma renal, além de carcinomas de células escamosas de várias regiões do corpo.

Materiais e Métodos

células e células de cultura de condições

As linhas celulares de carcinoma humano laringe (ca) (HSC-3), ca mama (BT20, SK-Br-3) , ca gástrica (GAS-1, MKN-7, MKN-28, KATOIII), ca colorectal (LS-174T, HCT116), colo uterino ca (ME180, HeLa-S), ca renal (KPK-1, TOS-1 ), bexiga CA (KU-1), melanoma (SK-MEL-37), osteossarcoma (L-2os), intestino fetal (Int407) e uma linha de células de hepatoma de rato (RH7777;. generosamente fornecida por Tanabe Mitsubishi Pharm) foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) suplementado com 7% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS; ICN Biomedicals, Aurora, OH, EUA) numa incubadora humidificada (5% de CO

2) a 37 ° C. GAS-1, MKN-28 ou TOS-1 foi, respectivamente, obtidos a partir de Kotanagi H (Universidade de Akita), Coleção japonesa dos recursos biológicos de investigação (JCRB) Cell Bank ou Satoh M (Universidade de Tohoku). leucemias de células T (Jurkat, Molt-4), leucemia de células-B (Daudi), leucemia promielocítica (HL60) de origem humana, de PBL humano com ou sem interleucina humana recombinante 2 (IL-2, 100 UI; Shionogi Co . Ltd., Osaka, Japão) e esplenócitos de ratinho com IL-2 (100 IU) para o ADCC, mielomas de ratinho (SP2, X63) e as células de hibridoma estabelecidas foram cultivadas em meio RPMI 1640 (RPMI; Sigma-Aldrich) suplementado com 7% inactivado pelo calor FBS sob as condições acima mencionadas. Para se obter linfócitos humanos activados por FCM, PBL também foram cultivadas e estimuladas com IL-2 (100 UI) durante 48 h ou 12

O

tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA, 20 ng /ml; Sigma -Aldrich) mais de Ca ionóforo (A23187, 0,3 uM; Calbiochem, La Jolla, CA, EUA) durante 24 h em meio RPMI com 7% de FBS. HUVEC (Takara Bio Inc., Otsu, Japão) foram mantidas em meio EGM-2 (Lonza, Walkersville, MO, EUA) e utilizou-se terceira a quinta passagens. NHEK (Takara Bio Inc.) foram cultivadas em HuMedia-KG2 (Lonza) e utilizado na terceira e quarta passagens. HEK293F células embrionárias de rim humano (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e uma linha de células derivadas de queratinócitos da epiderme humana (EK325) estabelecidas por nós foram cultivadas em meio de expressão FreeStyle293 (Invitrogen) numa incubadora humidificada (5% de CO

2 ). GFP foi geneticamente fundido com o terminal carboxilo citoplasmático de CD44s humanos ou CD44R1 em um vector de expressão pAcGFP (BD Biosciences, Mountain View, CA, EUA), e células HEK293F e RH7777 foram, respectivamente, transfectadas com estes plasmídeos CD44-GFP por 293fectin (Invitrogen) ou Lipofectamine 2000 (Invitrogen), em conformidade com as instruções do fabricante, seleccionado usando meios de cultura contendo G418 (Nacalai Tesque, Quioto, Japão) diluído para 400 ug /ml, e para a fluorescência verde celular usando um classificador de células JSAN classificados-clone (Bay Bioscience, Kobe, Japão). Estas linhas de células estabelecidas HEK293F e RH7777 que expressam as proteínas CD44-GFP foram mantidas em meio de expressão FreeStyle293 com G418 (400 ug /ml). As células foram obtidas de American Type Culture Collection (ATCC), a menos que indicado de outra forma. A maioria das linhas celulares contendo HSC-3 foram mencionados em outros lugares [45].

existente anticorpos monoclonais terapêuticos

Anti-HER1 quimérico Cetuximab (Merck Serono, Rockland, MA, EUA), anti-HER2 humanizado Trastuzumab e anti-CD20 quimérico Rituximab (Roche-Chugai, Tóquio, Japão) foram usadas para a coloração de células ou tecidos humanos.

Preparação de um recombinante totalmente humano que reconhece o mAb IgG1 CD44R1

MV1, MV2, MV3, MV4 e MV5 totalmente IgM humano de mAb foram preparados a partir da fusão celular entre células de baço de Kirin-Medarex ratinhos (KM) (22) imunizados contra um Δex5-V8-V9-V10-Δex16 proteína (R1a) recombinante (8) fundido com glutationa S-transferase (GST) e as células de mieloma de ratinho SP2. O procedimento para a fusão das células e criação de hibridomas foi realizada como descrito na secção seguinte. Em proteínas recombinantes R1a, Δex5 ou Δex16 respectivamente corresponde a um curto peptídeo parcial (Δex5, 19 aminoácidos; Δex16, 8 aminoácidos) adjacentes a v8 ou v10. cDNAs de transcritos de modo inverso a partir da região variável das cadeias pesadas e leves, que foram clonadas a partir de ARN total de células de hibridoma que segregam IgM (μ, mAb humano κ contra CD44R1 (MV5), foram geneticamente reformulado para ADNc de IgG1 humana (γ1, κ