da arte abstracta

Apesar dos avanços na detecção e terapia, o câncer de próstata resistente à castração continua a ser um grande problema clínico. A actividade aberrante das vias de células-tronco, e sua regulação pelo receptor de andrógeno (AR), tem o potencial de fornecer informações sobre novos mecanismos e caminhos para prevenir e tratar avançado, cancros da próstata castrar-resistente. Para este fim, foram investigados o papel de regulador de células estaminais embrionárias Sox2 [SRY (sexo região determinante Y) -Box 2], em células epiteliais de próstata normais e malignas. Na próstata normal, Sox2 é expresso em uma porção das células epiteliais basais. tumores de próstata eram ou Sox2-positivo ou Sox2-negativos, com a porcentagem de tumores Sox2 positivo aumentando com o escore de Gleason e metástases. Na linha celular de cancro da próstata resistente à castração CWR-R1, a expressão endógena de Sox2 foi reprimido por sinalização AR, AR e cromatina-PI mostra que a RA se liga o elemento potenciador do promotor dentro do Sox2. Do mesmo modo, em células epiteliais de próstata normais e de células estaminais embrionárias humanas, o aumento da sinalização AR também diminui a expressão Sox2. Resistência aos resultados MDV3100 anti-andrógeno em um aumento marcado na expressão Sox2 dentro de linhas de células de cancro da próstata de três, e em LAPC-4 linha celular de cancro da próstata sensível a expressão ectópica de castração Sox2 foi suficiente para promover a formação de tumor resistente à castração. A perda da expressão Sox2 na linha celular de cancro da próstata CWR-R1 resistente à castração inibiu o crescimento celular. -Regulação de Sox2 não foi associada com aumento da expressão CD133, mas foi associado com o aumento da FCF5 (5 Factor de Crescimento de Fibroblasto) a expressão. Estes dados propor um modelo de expressão Sox2 elevada devido à perda de repressão mediada por AR durante a castração e consequente castração-resistência através de mecanismos que não envolvem a indução de vias de células-tronco embrionárias canônicos

Citation:. Kregel S, Kiriluk KJ , Rosen AM, Cai Y, Reyes EE, Otto KB, et al. (2013) Sox2 é um gene receptor andrógeno-reprimida que promove o câncer de próstata resistente à castração. PLoS ONE 8 (1): e53701. doi: 10.1371 /journal.pone.0053701

editor: Jindan Yu, da Universidade Northwestern, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Agosto, 2012; Aceito: 03 de dezembro de 2012; Publicação: 11 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Kregel et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento para este trabalho foi generosamente fornecidos por: The University of Chicago Departamento de Cirurgia, a Seção de Urologia; da Universidade de Chicago Comprehensive Cancer Center (UCCCC); uma concessão Piloto do National Cancer Institute (NCI) SPORE P50 CA090386 no cancro da próstata no Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center da Universidade do Noroeste e do Centro de Pesquisa do Câncer da Universidade de Chicago; um American Cancer Society Institutional Research Grant (ACS-IRG, # IRG-58-004); um técnico de suporte Grant Cancer Center (CA14599 P30); A Fundação Brinson; o Fundo Família Baum Alvin; e da Universidade de Conselho da Mulher Cancer Research Foundation de Chicago. S. Kregel é apoiado por um HHMI: Med-em-Grad Fellowship (56006772) e Biologia do Câncer Formação Grant (T32-CA09594); E. Reyes é apoiado por um treinamento Grant Imunologia (AI07090-31). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Relapse de câncer de próstata maligno após a terapia hormonal é um problema clínico significativo e são necessárias novas estratégias para prevenir e tratar câncer de próstata resistente à castração. terapia de privação de andrógeno (ADT) tem sido o pilar do tratamento de câncer de próstata desde a descoberta por Charles Huggins e Clarence Hodges em 1941 que a castração pacientes significativamente ajudados com câncer de próstata avançado [1]. No entanto, existe a progressão da doença inevitável devido ao crescimento de células de cancro da próstata de castração-resistente. Há uma série de mecanismos para o desenvolvimento de cancro da próstata resistente à castração (CRPC), a maioria dos quais giram sobre o receptor andrógeno (AR) [2]. Assim, inibindo a sinalização intracelular AR dentro de células de cancro da próstata tem sido um dos principais focos da investigação do cancro da próstata, o que resulta em uma variedade de inibidores químicos de segmentação de sinalização AR que são usados ​​em clínica [3]. Infelizmente, enquanto todos esses inibidores de produzir uma resposta terapêutica inicial, este é comumente seguido de recidiva e progressão da doença.

As recentes descobertas de reprogramação de células somáticas usando genes definidos para criar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) demonstra profundamente que a expressão de alguns genes de células estaminais são capazes de provocar alterações em larga escala na expressão de genes e o comportamento das células, muitos dos quais são propriedades das células malignas [4]. oncogenes Na verdade, tais fatores de reprogramação de células-tronco são estabelecidos (c-Myc e KLF4) ou estão a emergir como oncogenes (Sox2, Oct4 e Nanog) em uma variedade de cânceres [5], [6], [7]. Os fatores de transcrição Sox2, Oct4 e Nanog constituem o núcleo máquinas fator de transcrição embrionária com células-tronco e são essenciais para a manutenção da pluripotência e impedindo a diferenciação [8]. Em estudos utilizando linhas de células, esses genes não só promovem a proliferação celular e sobrevivência, mas também prejudicar processos de diferenciação normais; ambos os quais são características de tumorigênese e progressão da doença [5], [7], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]. Em alguns casos, a expressão de tais genes está pensado para marcar haste cancro raro /iniciar células [12], [16]. Assim, a função desses fatores de transcrição em células cancerosas adultos é pensado para inibir a diferenciação e promover mecanismos de pluripotência das células estaminais e de sobrevivência semelhante à sua função essencial em células-tronco embrionárias.

Sox2 [SRY (sex região determinante Y) -Box 2] é um factor de transcrição que é essencial para manter a sobrevivência e pluripotência das células-tronco indiferenciadas embrionárias, e tem um papel a emergir como um factor de reprogramação epigenética e oncogene [5], [17], [18], [19] , [20]. Em células estaminais embrionárias humanas Sox2 regula a expressão de genes de 1259, muitos dos quais são co-regulados com Oct4 e /ou Nanog [21]. Na próstata, Sox2 expressão foi observada em células no interior da camada de células basais-epitelial dos epitélios glandulares normais [22], e em tumores da próstata [22], [23]. A expressão de Sox2 em tumores da próstata tem sido pensado para promover um fenótipo de tumor mais agressivo, promovendo uma “de células-tronco como” fenótipo tumoral. Na verdade, expressão de matriz gene análises mostraram que uma assinatura de celular como iPS está presente dentro de uma parte dos tumores benignos da próstata e agressivas, e essa assinatura confere uma doença pior prognóstico [24]. O nosso grupo previamente identificado como sendo Sox2 altamente expresso em células epiteliais prostáticas normais quando comparadas com as células epiteliais a partir de vesículas seminais: um órgão com função similar e origem do desenvolvimento que, ao contrário da próstata, é raramente um local de tumorigénese [25]. Colectivamente, estes dados dão para a hipótese de que as funções Sox2 em células epiteliais normais e malignas adultos para regular a expressão de muitos dos mesmos genes alvos regulados por Sox2 dentro de células embrionárias humanas, promovendo assim um fenótipo tumoral em células estaminais embrionárias menos diferenciadas; Além disso expressão Sox2 poderiam ser restrito a haste câncer raro /células que conferem um prognóstico da doença pior início. Alternativamente, Sox2 poderiam ter uma função muito diferente em células epiteliais adultos. Estes dados também sugerem que podem promover Sox2 castração resistência ao diminuir a dependência de células de cancro da próstata em sinalização AR para o seu crescimento e sobrevivência.

Aqui mostramos que Sox2 é expresso na maioria das células epiteliais prostáticas normais basais , e é expresso uniformemente em um subconjunto de tumores da próstata. Além disso, Sox2 é expresso na grande maioria de lesões da próstata metastático resistente à castração. Em células normais epiteliais da próstata, células estaminais embrionárias humanas, e células cancerígenas da próstata resistente à castração, a activação pelo ligando de AR promove uma diminuição na expressão Sox2, que é um resultado da ligação directa do AR para o cis-região potenciador da Sox2. Expressão de Sox2 também é aumentada dentro de células de cancro da próstata que são resistentes ao MDV3100 anti-androgénio. Em células de cancro da próstata sensível a castração, expressão Sox2 é suficiente para promover a formação de tumor resistente à castração. A expressão de Sox2 em células de câncer de próstata, no entanto, não resulta em alterações na expressão específica de diferenciação PSA, um aumento de haste do cancro putativo CD133-positive /células que iniciam, ou a expressão de células estaminais embrionárias humanas conhecidas (hESC) -associated sox2 genes alvo. Assim, Sox2 parece promover a resistência à castração através de mecanismos que não envolvem a re-expressão de genes de células-tronco Sox2-alvo embrionárias ou aumentos de tronco tumor raro /início de populações de células.

Materiais e Métodos

Linhas Celulares e Materiais

R1881 e Actinomicina D foram adquiridos a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), e MDV3100 foi comprado de Selleck Chemicals (Houston, TX), e armazenadas a -20 em etanol . Todas as linhas celulares de cancro da próstata humano foram cultivadas como anteriormente descrito [26], [27]. Todas as culturas foram rotineiramente rastreados quanto à ausência de contaminação por micoplasma usando o ATCC Universal Mycoplasma Detection Kit (Manassas, VA). PC-3, linhas celulares VCAP, NCCIT e foram adquiridos a partir da ATCC, e do DU145, LNCaP, LAPC-4, C4-2, CWR22Rv1, CWR-R1, MDA-PCa2B, e linhas celulares E006AA foram generosamente fornecidos pelo Dr. John Isaacs na Universidade Johns Hopkins e tenham sido previamente caracterizada [28]. A linha de células estaminais embrionárias humanas WA01 (H1) foi adquirida da WiCell (Madison, WI) e cultivadas utilizando o protocolo independente de alimentador usando a mídia mTeSR1 (Stem Cell Technologies, Vancouver, aC). As células ES foram usadas dentro de dez passagens de descongelamento. Secretado PSA total e testosterona foram medidos usando Antigen Roche Elecsys total Prostático Específico (PSA) e testosterona (T) Ensaios. O crescimento celular foi medida utilizando o Kit de Ensaio de Proliferação Celular Vybrant MTT (Invitrogen Sondas /Moleculares; Eugene, OR).

Lentivirus Sox2, vectores de AR, e de controlo (pReceiver-Lv105) foram adquiridos a GeneCopoeia (Rockville, MD ). Lentivirus transactivador de tetraciclina (LV-rtTA) e induzível vetor lentiviral Sox2 do laboratório Hochedlinger foram adquiridos através Addgene [29]. Quando necessário, a expressão, Sox2 foi induzida utilizando 1 ug /mL de doxiciclina (Sigma). Knockdown de expressão Sox2 usando expressão shRNA foi conseguida utilizando o Sox2 shRNA conjunto de genes anti-humano, que consiste em 4 diferentes sequências lentivirais direccionados contra Sox2 e um controlo não-silenciamento [HSH017628-HIVH1 (Sox2) e CSHCTR001-HIVH1 vectores (controlo) contendo um GFP e puromicina-resistência componentes; Genecopoeia]. De título elevado lentivírus foi feita por co-transfecção com ViraPower Lentivrial mistura de embalagens (Invitrogen; Grand Island, NY) e Lenti-X Concentrador. (Clontech; Mountain View, CA) de acordo com as instruções do fabricante

não malignas culturas epiteliais foram estabelecidas a partir de tecidos da próstata humanos frescos adquiridos a partir de amostras cirúrgicas como previamente descrito [25]. Estes tecidos foram adquiridos ao abrigo de um protocolo acelerado aprovado pela Universidade de Chicago Institutional Review Board (IRB). As amostras de tecido foram geridos pela Universidade de Chicago Human Tissue Resource Center instalação de núcleo; a necessidade de consentimento do paciente foi dispensada como amostras adquiridas foram de-identificados. 4 mm de punções de tecido não-tumoral foram tomadas a partir de tecidos da próstata e das vesículas seminais de pacientes submetidos a prostatectomia radical; metade deste tecido foi fixado e analisadas por um patologista para confirmar a ausência de tumor. A dissociação de tecido da próstata e crescimento de células epiteliais foi previamente descrito [30], [31], e os mesmos métodos foram utilizados para estabelecer próstata combinados (PrEC) e vesícula seminal (SVEC) culturas de células epiteliais. As culturas foram cultivadas utilizando meios definidos Keratinoctye Serum-free suplementados com fatores de crescimento (GFs) (padrão K-SFM, Invitrogen Life Technologies) e podem ser cultivadas até 8 passagens antes de senescência celular notável [32]. Para nossos experimentos, todas as culturas foram analisadas em ou antes de sua quarta passagem.

Western Blot, imunohistoquímica e imunofluorescência

lisados ​​de células total colhido de 100.000 células foram utilizadas por pista. Os anticorpos utilizados foram: anti-AR (N-20, Santa Cruz, Santa Cruz, CA); anti-beta actina (Sigma-Aldrich); anti-ΔNp63 (4A4, Santa Cruz); anti-Sox2 (D6D9 XP, Cell Signaling Technology, Beverly, MA); anti-Nanog (D73G4 XP, Cell Signaling Technology); anti-Oct4 (C30A3, Cell Signaling Technology); e anti-desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH, Cell Signaling Technology). anticorpos conjugados com peroxidase de rábano secundária eram de Cell Signaling Technologies, e HRP detectada usando SuperSignal Oeste Femto Substrato quimioluminescente (Peirce /Thermo Scientific; Rockford, IL). Alternativamente, os anticorpos secundários de Rockland (Gilbertsville, PA) foram utilizados e os dados capturados usando um sistema de Licor Odyssey (Lincoln, NE)

imunocoloração para Sox2 (D6D9 XP, Cell Signaling Technology; monoclonais de coelho). Foi realizada em , (FFPE) secções embebidas em parafina fixadas em formalina geridos pela Universidade de Chicago Human instalação de Núcleo de Recursos Tissue ou a Northwestern University /Universidade de Chicago programa de próstata SPORE e seu programa de Specimen Procurement. Após desparafinização e re-hidratação, os tecidos foram tratados com o tampão de recuperação de antigénios (S1699 da Dako; Glostrup, Dinamarca) num vaporizador durante 20 minutos. Aplicou-se anticorpo anti-Sox2 (diluição 1:25) durante 1 hora à temperatura ambiente numa câmara de humidade. Na sequência de lavagem TBS, foi detectada a ligação antígeno-anticorpo com o sistema Envision + (DAKO, K4001 para anticorpos do rato primários) e DAB + Chromogen (Dako, K3468). As secções de tecido foram brevemente imerso em hematoxilina de contracoloração e foram escorregou-cover. Os tecidos foram analisados ​​por um patologista Genitourinary treinados e pontuados em porcentagem de células com coloração nuclear positiva (0 = nenhuma coloração, as células positivas 1 = 1-10%; células positivas 2 = 11-50%; e 3 = 50% positiva células); , bem como a intensidade da coloração (0 = nenhuma coloração coloração; 1 = fraco; coloração 2 = moderada; coloração 3 = forte). Para imagens, as lâminas foram digitalizadas usando um scanner de slides Whole Pannoramic Scan (Cambridge Research e Instrumentação; Hopkinton, MA) e as imagens capturadas usando o software versão Pannoramic Visualizador de 1.14.50. (3DHistech; Budapeste, Hungria)

Para imunofluorescência, os tecidos foram desparafinizadas, re-hidratadas, e tratou-se com tampão de recuperação de antigénio. ligação de Sox2 anticorpo (D6D9, Cell Signaling Technology; Alexa-Fluor 555 conjugado, diluição 1:50 em TBST) e p63 (4A4, Santa Cruz Biotechnology; Alexa-Fluor 647 conjugado, diluição 1:50 em TBST) foram conduzidos com 1 h à temperatura ambiente. Os tecidos foram contra-coradas com DAPI e montado usando Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL). imagens fluorescentes foram capturadas usando um microscópio Leica TCS SP2 AOBS confocal de varrimento laser.

quantitativo em tempo real PCR (Q-RT-PCR) e PCR análises de matriz

RNA foi purificado usando o Qiagen RNeasy Mini kit com o kit opcional DNAse digestão (Qiagen, Valencia, CA) e qualidade testada usando um Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Para Q-RT-PCR convencional, extraiu-se ARN foi convertido em cDNA por transcrição reversa utilizando SuperScript® III Transcriptase Reversa (Invitrogen). Níveis de Sox2, PSA, FCF5 e transcrição GAPDH foram quantificados utilizando

Power

SYBR® Mix Verde Master (Invitrogen) usando primers personalizados para Sox2 [5′-AACCCCAAGATGCACAACTC-3 ‘(para a frente), 5′-CGGGGCCGGTATTTATAATC- 3] (reverso); PSA [5’-TCATCCTGTCTCGGATTGTG-3 ‘(para a frente), 5′-ATATCGTAGAGCGGGTGTGG-3′ (inverso)]; FCF5 [5’-AGTCAATGGATCCCACGAAGC-3 ‘(para a frente), 5′-TGAACTTGGCAG TTGCATGGA-3′ (inverso)]; e GAPDH [5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3 ‘(para a frente), 5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3’ (inverso)]. As curvas padrão foram utilizadas para avaliar a eficiência do iniciador e variação média de ciclo limiar (ΔCT valores) foi determinada para cada uma das amostras em relação aos níveis endógenos GAPDH e comparado com o controlo de veículo (ΔΔCT). Os experimentos foram realizados em triplicado para determinar erro padrão da média, e t-testes do estudante realizada com normalização para controlar a obter valores de p.

Para os tronco embrionárias humanas Cell PCR Arrays, o RT

2 First Strand kit (SA Biosciences; Valencia, CA) foi utilizado para a transcrição reversa do ARN para ADNc. RT

2 qPCR Master Mix (SA Biosciences) e tronco embrionárias humanas Cell RT

2 Profiler ™ matrizes de PCR (Cat # HAP-081, SA Biosciences) foram usados ​​para examinar as transcrições das 84 principais genes envolvidos na manutenção de pluripotência eo status de auto-renovação das células-tronco embrionárias. As matrizes foram realizadas com réplicas biológicas em triplicado para cada condição. A RT

2 software de análise de dados de matriz Profiler ™ PCR foi utilizado para avaliar variação média nos valores do ciclo limiar (ΔCT) para cada uma das amostras em relação ao controlo do veículo (ΔΔCT), determinar o erro padrão e obter valores de p através do estudante t -test.

AR cromatina Immunoprecipication

protocolos da cromatina-IP foram adaptados a partir de métodos previamente relatados [33]. As células foram cultivadas até 70-90% de confluência e tratadas durante 24 horas com 1 nM R1881. As células foram fixadas com formaldeído a 1% à temperatura ambiente durante 15 minutos; a reticulação foi neutralizada com 0,125 M de Glicina em PBS, durante 15 minutos à temperatura ambiente e lavadas com PBS arrefecido em gelo. Depois as células foram raspadas em PBS mais 1 × cocktail inibidor de protease (Roche Molecular Biochemicals; Penzberg, Alemanha), os sedimentos celulares foram recolhidos por centrifugação e extraídos de células núcleos por centrifugação a 14000 rpm a 4 ° C durante 15 minutos. núcleos de células foram re-suspenso e lavado em tampão de nuclease microcócica (Tris [pH 7,4] 10 mM, NaCl 15 mM, KCl 60 mM, espermina 0,15 mM, espermidina 0,5 mM, CaCl2 1 mM) e depois incubadas com 10,000 U de nuclease microcócica para 20 minutos a 37 ° C com thermomixing suave. Os núcleos foram então recolhidas e re-suspensas em tampão de RIPA-PIC [cloreto de sódio 150 mM, 1,0% de Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich), 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, Tris a 50 mM, pH 8,0 /1 × protease cocktail inibidor (Roche)] e sonicado (Fisher Scientific; Hampton, NH; modelo FB-120 de sonic Dismembrator). cromatina extractos sonicados foram então pré-apagada durante a noite a 4 ° C por incubação com proteína G-agarose grânulos tratados com IgG de coelho normal (Cell Signaling Technology), e fragmentos de cromatina foram imunoprecipitadas com anticorpos específicos durante a noite a 4 ° C. Para uma solução da cromatina diluído de 1 ml, 50 ug dos anticorpos seguintes foram usados: IgG normal de coelho (Cell Signaling Technology) como um controlo negativo; Histona H3 (Abcam, Cambridge, MA) como um controlo positivo; e AR (N-20, Santa Cruz), para as condições experimentais. As esferas foram então recolhidas e lavadas em TSE I buffer [0,1% de Triton X-100, 2 nM de EDTA, 150 mM de NaCl, Tris-HCl a 20 (pH 8,1)], tampão TSE II [0,1% de SDS, 1% Triton X-100, EDTA a 2 mM, NaCl 500 mM, Tris-HCl a 20 (pH 8,1)], tampão de Brown III [0,25 LiCl, 1,0% de Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich; St Louis, MO), 1% de desoxicolato, 1 mM EDTA, 10 mM de Tris-HCl (pH 8,1)], e duas vezes com tampão TE [1 mM de EDTA, 10 mM de Tris-HCl (pH 8,1)]. Os fragmentos de cromatina imunoprecipitados foram eluídos fora das esferas de agarose usando tampão de eluição de Brown [1% de SDS, 0,1 M de NaHCO3, 1 mM de DTT, 1 × cocktail inibidor de protease (Roche)] e incubou-se durante 10 minutos a 95 ° C com vigorosa thermomixing. cromatina e entradas eluído foi então incubada durante a noite a 65 ° C com thermomixing suave para reverter ligações cruzadas. As amostras foram, em seguida, tratou-se com 2 ug com ARNase A (Novagen; Darmstadt, Alemanha) a 37 ° C durante 15 minutos, em seguida, com 2 ug de Proteinase K a 55 ° C durante 30 minutos (Cell Signaling Technology). Finalmente, os fragmentos de ADN immunoprecipiated foram extraídos por fenol-clorofórmio (Sigma-Aldrich) e submetido a extracção Q-RT-PCR utilizando disponíveis comercialmente SimpleChIP ™ Sox2 Humana do promotor intensificador de cis-iniciadores (Cell Signaling Technology).

Em vivo formação de tumores

Todos os estudos com animais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Universidade de Chicago Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC, números de protocolo 72.066 e 72.231). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia ketamina /xilazina, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

In vivo

formação de tumores de xenoenxertos LAPC-4 e células CWR-R1 foram conduzidos através de uma inoculação sub-cutânea de um milhão de células em 4-6 semanas ratinhos nus atímicos macho de idade (Harlan, Indianapolis, IN) utilizando uma 75% Matrigel e 25% de solução HBSS (BD Biosciences). Para medir a tomada de tumores num hospedeiro castrado, os ratinhos foram castrados cirurgicamente hospedeiras uma semana antes da inoculação de célula. Para medir a progressão para a resistência à castração, hospedeiros animais foram castrados quando os tumores atingiram 0,5 cm

3. Para analisar circulando PSA total do implante do tumor e para confirmar a depleção de testosterona em hospedeiros castrados, foi retirado sangue por punção cardíaca no ponto final experimental.

Citometria de Fluxo

Todas as incubações de anticorpos, lavagens, e As análises de citometria de fluxo foram realizadas utilizando tampão de separação de células gelada (1 × PBS, 0,5% de albumina de soro bovino (BSA), 2 mmol /L de EDTA) em luz mínima, utilizando protocolos relatados anteriormente [26], [31]. As células foram coradas com o Live /Dead fixável verde Kit Dead Cell Stain (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. Após lavagem, as células foram incubadas com reagente bloqueador de FcR (Miltenyi Biotec, Colónia, Alemanha, diluição de 1:20 durante 10 minutos), e em seguida marcado com CD133 /2 (293C3) -APC-conjugado de anticorpo monoclonal humano (Miltenyi Biotec) ou isotipo controlo IgG2b de ratinho-APC (Miltenyi Biotec) a uma diluição de 1:10 durante 30 min. As células foram então lavadas e fixadas durante 15 minutos com 3,2% ultra pura EM Grau formaldeído (Polysciences, Inc .; Warrington, PA). Após a fixação, as células foram lavadas e coradas com violeta FXCycle (Invitrogen, 1:1000 diluição). A análise foi realizada numa Becton Dickinson LSR II, e um mínimo de 250.000 contagens foi adquirida para cada condição experimental. FACSDiVa Software foi usado para aquisição de dados e software FlowJo foi utilizado para análise.

Floating Spheroid Cultura Ensaio

In vitro

esferóides flutuantes foram cultivadas a partir de 1 × 10

5 LAPC-4 e LNCaP transduzidas com qualquer Sox lentivirais e vetores GFP ConFtrol [pReceiver-Lv105; GeneCopoeia (Rockville, MD)]. As células foram cultivadas em ultra-baixa de fixação 25 cm

2 frascos de cultura de células (Corning; Corning, NY, EUA) e cultivadas em suspensão, durante 5 dias. Esferóides formados após 5 dias foram transferidos para 10 cm

2 pratos (Corning; Corning, NY) durante 24 horas para permitir a ligação. Os esferóides foram então coradas com solução de violeta cristal (Sigma-Aldrich), lavadas e contadas. formação Sphere foi realizada em triplicado.

Análises Estatísticas

Em todos os dados instâncias foi reproduzido utilizando várias repetições biológicos e técnicos. Os dados foram analisados ​​usando SigmaPlot 11.0 software utilizando uma ANOVA de uma via com vários procedimentos de comparação de pares (método de Holm-Sidak).

Resultados

Sox2 é expressa em normal da próstata células basais epiteliais e no um subconjunto de próstata tumores

Para avaliar a prevalência e padrão de expressão de proteína Sox2 na próstata, foi realizada uma avaliação imunohistoquímica de uma série de tecidos da próstata humanas e tumores. Estas análises mostram que em hiperplásicas normal e benigna (BPH) tecidos da próstata expressão Sox2 é restrita a células epiteliais basais (Figura 1A). As análises de tumores da próstata demonstra que Sox2 ou é uniformemente expresso uniformemente ou ausente (Figura 1A). A maior parte (12 de 14) das metástases resistente à castração analisadas também expressam Sox2 (Figura 1B e C). A percentagem de Sox2-positivos tumores aumenta com Gleason Score, com um pequeno subconjunto de favoráveis-prognóstico Gleason Score 6 tumores e a maioria dos pobres-prognóstico Gleason Pontuação 10 e resistente à castração metástases positivo (Figura 1C). Curiosamente, a análise de neoplasia intra-epitelial prostática pré-maligna (PIN) lesões documentado um basal misto e coloração de células epitelial luminal (Figura 1C). Estes dados são consistentes com o tumor a observação feita por Jia et al. utilizando um anticorpo diferente Sox2 que mostra que a expressão correlaciona-se com Gleason Grau [23]. Os nossos dados contrasta com este relatório, no entanto, como se observa forte coloração basal epitelial em tecidos não-malignas, bem como forte expressão uniforme Sox2 numa pequena percentagem de tumores, em vez de um aumento na intensidade de coloração graduada [23]. Estes dados documentar que Sox2 é uniformemente expresso em um subconjunto de tumores de próstata, e indica que a expressão Sox2 confere um tumor única sub-tipo que não parece ser restrita a cancro raro iniciar /células-tronco como em tumores de próstata.

a) coloração imuno-histoquímica de Sox2 demonstrando coloração representante nuclear basal epitelial (vermelho escuro) nas glândulas normais (Região 3) # e duas regiões tumorais distintas que são ou uniformemente Sox2-positve (Região # 2) ou Sox2-negativo ( região # 1). B) Expressão de Sox2 em lesões metastáticas resistente à castração representativos. A caixa na 8 × ampliação corresponde à região mostrado na imagem 40 ×. C) Percentual e distribuição da expressão Sox2 entre os estados de doença da próstata. Em tecidos HGPIN normal, BPH, e, Sox2 é expresso em células basais-epitelial (barras cinzentas). A expressão positiva é definida por mais de 50% das células cancerosas positivas com uma intensidade relativa de uma ou mais numa escala de 0-3. Em tecidos e metástases do câncer, Sox2 ou é uniformemente expressa ou ausente, ea porcentagem de tumores Sox2-positivos aumenta com a escala de Gleason (barras pretas). BPH: hiperplasia benigna da próstata; HGPIN: alto grau de próstata neoplasia intra-epitelial; GS: Gleason Score (N = número de espécimes individuais dos pacientes analisados)

Sox2 é co-expressa dentro de uma parte da p63-positivas basais epiteliais Células

A expressão de Sox2 in. células basais epiteliais-AR-negativa implica que Sox2 pode funcionar para promover a sobrevivência de células estaminais da próstata e amplificando-transientes basais, ou mantê-las num estado indiferenciado. Na próstata normal, a interacção parácrina entre células estromais e epiteliais é androgénio dependentes, em que as células do estroma AR-positiva produzir uma série de factores de crescimento, colectivamente designadas por “andromedins” que sinal para as células epiteliais próximas de promover a proliferação de AR-negativa, células epiteliais luminais -positivas células epiteliais basais p63-positivas ea sobrevivência de AR-positivo /Prostate Specific Antigen (PSA) [34]. Para determinar qual a proporção de células basais-epitelial foram Sox2-positivos, foi realizada a coloração co-imunofluorescência de Sox2 e p63. Estes dados mostram que 75% das células epiteliais da próstata basal localizados na zona periférica da próstata expressam tanto Sox2 e p63, enquanto os restantes 25% de células p63 expressa mas não Sox2 (Figura 2A). Esta observação sugere que a expressão Sox2 delineia duas populações de potenciais células epiteliais basais; estas células também podem ter características fenotípicas únicas e pode derivar tumores distintos [35].

a) a co-coloração de imunofluorescência de Sox2 (verde), com o marcador específico p63-basal (vermelho), demonstrando que 75% de células basais normais-epitelial são positivas tanto para Sox2 e p63 (amarelo), enquanto que os restantes 25% são Sox2-negativas (vermelhas). DAPI destaques coloração núcleos (imagens representativas do epitélio da próstata normal, adquiridos a partir de três amostras de pacientes individuais diferentes). B) Western blotting de uma série de próstata derivadas do paciente (PrEC) e epitelial (Vender culturas Vesícula Seminal (SVEC) PrEC) demonstra que uma parte destas culturas expressar Sox2 detectável, enquanto a outra e todas as culturas PrEC SVEC não. C) coloração imunocitoquímica de Sox2 mostrando a expressão uniforme nuclear Sox2 em PrECs Sox2-positivas e falta de células Sox2 positivo dentro PrECs Sox2-negativo (imagens representativas de três experiências independentes).

Com base nisso, nós estabelecemos uma série de culturas não-maligna de células epiteliais da próstata (Prec) a partir de tecido da próstata recém-dissociados e analisá-los para a expressão Sox2. Tais culturas PrEC não expressam níveis detectáveis ​​de proteína de AR, uma vez que consistem de células transientes-amplificando principalmente p63-positivos, juntamente com populações menores de CD133-positivo de células estaminais, células intermediárias PSCA-positivas e células neuroendócrinas cromogranina A-positivos [ ,,,0],26], [31]. Como um controle adicional, foram isoladas de pacientes culturas de correspondência vesícula seminal de células epiteliais (SVEC) usando os mesmos métodos. análises de Western blot documentado que as culturas PrEC eram ou Sox2-positivo ou Sox2-negativos, e correspondentes culturas SVEC foram consistentemente negativo (Figura 2B) [25]. As populações de células heterogéneas dentro de tais culturas PrEC Sox2 sugeriu que pode ser altamente expresso num pequeno subconjunto de células. imunocitoquímicos análises de expressão Sox2, no entanto, os documentos de que a maioria das células dentro das culturas PrEC Sox2-positivas expressam Sox2; enquanto existem poucas, se alguma, as células que expressam Sox2 detectáveis ​​nas culturas PrEC Sox2-negativas (Figura 2C). Assim, em culturas PrEC não malignas, Sox2 expressão não é restringido a uma única população de células, tais como células estaminais da próstata CD133-positivos.

Aumento receptor andrógeno (AR) de sinalização Diminui Sox2 Expressão em células normais da próstata epiteliais ( PrECs) e células estaminais embrionárias humanas (hESCs)

foi previamente demonstrado experimentalmente que a ativação da sinalização da AR por andrógeno obrigatório em células epiteliais da próstata induz a paragem do crescimento e eventual diferenciação terminal em células secretoras-luminal [36] [37], [38]. A expressão de Sox2 em células epiteliais basais e a falta de expressão Sox2 nas células epiteliais luminais AR-positivo não-maligna sugeriu que a RA pode reprimir a expressão Sox2. Utilizando culturas PrEC Sox2-positivo, foi avaliada a resposta de expressão Sox2 a expressão exógena e a indução de ligando do tipo selvagem AR. GAPDH foi usada como um controlo de carga. p-actina foi utilizado como um controlo de carga. p-actina foi utilizado como um controlo de carga. p-actina foi utilizado como um controlo de carga. GAPDH foi usada como um controlo de carga. GAPDH foi usada como um controlo de carga.