Abstract

Embora muitas estratégias quimioterápicos contra o câncer têm sido desenvolvidos, o câncer de pâncreas é um dos tipos mais agressivos e difíceis de malignidades. Por conseguinte, novas estratégias e agentes anti-cancro são necessárias para o tratamento desta doença. A metformina é um medicamento amplamente usado para a diabetes tipo 2, e também é conhecido como um agente anti-câncer promissor candidato a partir de estudos recentes

in vitro

e

in vivo

. No entanto, os mecanismos de efeitos anti-câncer de metformina não foram elucidados. Nós demonstramos que a metformina suprimiu a expressão de miR-221, um dos microARNs oncogénicas mais bem conhecidos, em células de cancro pancreático PANC-1 humana. Além disso, mostrámos que a sub-regulação de miR-221 pela metformina causada paragem na fase G1 através da sobre-regulação de p27, um dos alvos directos de miR-221. factor de indução de apoptose relacionado com o ligando (TRAIL) de necrose tumoral é também um agente promissor para o tratamento do cancro. Embora estudos recentes mostraram que o tratamento com apenas TRAIL não foi eficaz contra as células cancerosas do pâncreas, os presentes dados mostraram que as células de câncer de pâncreas mutante p53-metformina sensibilizados a trilha. Metformina induzida a expressão de receptor de morte 5 (DR5), um receptor para TRAIL, e Bim com uma função pró-apoptótico na jusante de TRAIL-DR5 via. Sugere-se que a sobre-regulação destas proteínas pode contribuir para a sensibilização de apoptose induzida por TRAIL. A terapia de combinação de metformina e TRAIL poderia, portanto, ser eficaz no tratamento de câncer pancreático

Citation:. Tanaka R, Tomosugi M, Horinaka M, Sowa Y, Sakai T (2015) Metformina Causas G1-Phase Detenção via Down-Regulamento de miR-221 e aumenta TRAIL Sensibilidade através DR5 Up-regulamento em células de cancro do pâncreas. PLoS ONE 10 (5): e0125779. doi: 10.1371 /journal.pone.0125779

Editor do Academic: A R M Ruhul Amin, Winship Cancer Institute, da Universidade de Emory, Estados Unidos

Recebido: 08 de dezembro de 2014; Aceito: 25 de março de 2015; Publicado em: 08 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Tanaka et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por JSPS KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/index.html) Número Grant 24689031. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO dE iNTERESSES:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é um câncer refratário e a quarta principal causa de morte por câncer nos Estados Unidos [1]. O único tratamento curativo para este tumor maligno é a cirurgia ea sobrevivência relativa de cinco anos de pacientes com câncer de pâncreas foi 2-6% nos Estados Unidos de 1975 a 2009. A gemcitabina foi estabelecida como a quimioterapia de primeira linha na década de 1990. [2] . Folfirinox (oxaliplatina, irinotecano, leucovorina, e fluorouracilo) ou terapia de combinação de gemcitabina e erlotinib, um inibidor selectivo da tirosina-cinase EGFR, parcialmente melhorado a sobrevivência global, mas não o suficiente [2-4]. Portanto, são necessários medicamentos eficazes ou mais terapias de combinação para cancros pancreáticos.

Metformina tem sido amplamente utilizado como uma droga para a diabetes tipo 2 durante muito tempo [5]. Hoje, a metformina é considerada a primeira escolha para o tratamento oral para diabetes tipo 2, porque não existem maiores contra-indicações e o custo do medicamento é baixa [6]. Enquanto isso, relatórios recentes têm mostrado que a metformina é útil na prevenção e no tratamento do cancro [7]. Vários estudos clínicos de metformina em doentes com cancros estão em curso [8, 9]. A metformina reduz a produção de glicose no fígado, activa a cinase de fígado B1 (LKB1) /cinase eixo AMP (AMPK) e inibe o alvo da rapamicina em mamíferos complexo 1 (mTORC1). É também inibe o crescimento de insulina factor-1 (IGF-1) [10-13]. Além disso, a metformina regula várias expressões de microRNA [14] e tem como alvo as células-tronco do câncer [12, 15]. Um tratamento com metformina inibiu o crescimento de células cancerosas através da indução de paragem na fase G1 por meio de sobre-regulação de p27 [16]. No entanto, os mecanismos exactos através dos quais a metformina-regula p27 permanecem obscuros.

de necrose tumoral relacionada factor de ligando indutor de apoptose (LIART /Apo2L) não induz a apoptose em células normais, mas selectivamente em células tumorais malignas [17 -19]. TRAIL humana recombinante e anticorpos agonistas para os receptores de TRAIL são agentes anti-câncer atraentes e vários ensaios clínicos baseados em TRAIL estão em curso [20]. TRAIL induz apoptose em várias células de cancro por meio de receptor de morte 5 (DR5; também chamado TRAIL-R2), um dos receptores de TRAIL cinco [21-23]. No entanto, há um problema importante que algumas células cancerígenas pancreáticas são insensíveis a apoptose mediada por TRAIL [24, 25]. Recentemente, microARNs específicos têm sido relatados para ser relacionado com a resistência de TRAIL em células cancerosas [26]. MicroRNAs são uma classe de pequenos RNAs não-codificantes que regulam a expressão dos genes alvo de repressão translacional e clivagem mRNA. MicroRNAs têm demonstrado desempenhar um papel importante no processo da carcinogénese [27]. O papel de microARNs foi estudado em diversos tipos de tumores, incluindo cancros pancreáticos. Entre eles, o miR-221 está envolvida no desenvolvimento de tumores por regulação da proliferação celular e que contribui para a resistência TRAIL [28-31]. A expressão de miR-221 é aumentada em células de cancro pancreático humano [32]. Curiosamente, um estudo recente mostrou que o miR-221 foi elevada nas artérias torácicas internas de sujeitos com diabetes do tipo 2 e houve uma correlação inversa significativa entre a dose oral de metformina e o nível de miR-221 [33].

um estudo recente mostrou que a metformina sobre-regulada e DR5 aumentada a sensibilidade TRAIL em células cancerosas de p53 de tipo selvagem [34], o que indica que ele é um candidato promissor para superar a resistência TRAIL em células cancerosas. No entanto, mais de metade dos tumores malignos possuem inativação de mutações no gene p53 [35, 36], e, portanto, precisamos examinar se a metformina aumenta a sensibilidade à TRAIL em células cancerosas p53 mutante.

No presente estudo, verificou-se que a metformina reduziu miR-221 expressão causando paragem na fase G1 através do aumento da regulação do p27, um alvo direto de miR-221. Além disso, mostramos que a metformina maior sensibilidade TRAIL via-regulação de DR5 em células de câncer de pâncreas p53 mutante.

Materiais e Métodos

Reagentes

A metformina foi adquirido a Sigma (St. Louis, MO, EUA). Solúvel de TRAIL humano recombinante /Apo2L foi adquirido a partir de Pepro Tech (Londres, Reino Unido). O DR5 humano recombinante (TRAIL-R2) /quimera Fc e inibidor pan-caspase, zVAD-fmk, foram adquiridos de R . D Systems (Minneapolis, MN, USA)

cultura celular

células de cancro pancreático humano PANC-1 e AsPC-1 foram obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD, EUA). As células humanas do cancro do pâncreas MiaPaCa-2 foram adquiridos a partir de humano pesquisa da ciência Banco de Recursos (Osaka, Japão). células PANC-1 e MiaPaCa-2 foram cultivadas em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 4 mM, 50 U /mL de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina. células AsPC-1 foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 2 mM, 50 U /mL de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina. Todas as células foram incubadas a 37

° C em atmosfera humidificada contendo um 5% de CO

2.

crescimento celular ensaio

O número de células viáveis ​​foi determinado utilizando o kit de contagem celular -8 ensaio de acordo com as instruções do fabricante (Molecular Tecnologia Dojindo, Kumamoto, Japão). Após incubação das células durante 72 horas com as concentrações indicadas de TRAIL ou metformina, kit de reagente WST-8 foi adicionado ao meio e incubou-se durante mais 4 horas. A absorvência de amostras (450 nm) foi determinada utilizando um espectrofotómetro de varrimento com múltiplas cavidades.

tripano de corante azul de exclusão ensaio

As células foram plaqueadas em placas de 12 poços (1 x 10

4 /bem). No dia seguinte, as células foram tratadas com metformina nas concentrações indicadas, durante 72 horas. A viabilidade celular foi medida pelo ensaio de exclusão de azul de tripano de corante.

Análise da progressão do ciclo celular e de detecção de apoptose

As células foram incubadas com ou sem metformina ou TRAIL nas concentrações indicadas e colhidas. Após lavagem com PBS, as células foram suspensas em PBS contendo 0,1% de Triton X-100, tratadas com RNase A (Sigma), e os núcleos foram coradas com iodeto de propídio (Sigma). O teor de ADN foi medida utilizando FACS Calibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA). Para cada experiência, foram analisadas 10000 células. software celular Quest (Becton Dickinson) e o pacote de software V2.0 ModFit LT (Verity Software House, Topsham, ME, EUA) foram utilizados para analisar os dados.

análise de Western blot

Células foram lisadas em tampão de lise (Tris-HCl a 50, 1% de SDS, 2 ug /mL de leupeptina, 2 ug /mL de aprotinina, PMSF 0,5 mM, e DTT 1 mM). O lisado foi sonicada e centrifugada a 15000 g durante 20 min a 4 ° C, e o sobrenadante foi recolhido. O extracto de proteína foi carregada para um 7,5, 10, 12,5% ou um gel de SDS-poliacrilamida para electroforese e transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (Millipore, Bedford, MA, EUA). Policlonal de coelho anti-DR4, anti-DR5 (Prosci, Poway, CA, EUA), e anti-CDK4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), e anticorpo monoclonal de coelho anti-Bim (Epitomics, San Diego, CA, anticorpos EUA), e monoclonal de ratinho anti-ciclina D1 (MBL, Nagoya, Japão) e anti-β-actina (Sigma) foram utilizados como os anticorpos primários. As manchas foram incubadas com o anticorpo secundário conjugado com HRP apropriados (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA), e os sinais foram detectados utilizando um kit de um Chemilumi-quimioluminescente (Nacalai Tesque, Quioto, Japão).

Determinação de expressão do receptor de TRAIL

As células foram recolhidas por tripsinização, lavadas uma vez com PBS gelado e ressuspensas em 100 ul de PBS com 1% de BSA. Em seguida, adicionou-rato marcado com PE anti-humano de DR4 ou DR5 mAb (eBioscience, San Diego, CA, EUA). Para avaliar a coloração inespecífica, foram aplicados isotipos PE-rotulados de controle de IgG (eBioscience). Após uma incubação de 30 minutos em gelo, 20.000 células foram analisadas por FACSCalibur.

análise de RNA

O ARN total a partir das células foi extraído usando um kit de isolamento de miRvana miARN (Applied Biosystems, Foster, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Para quantitativo em tempo real de RT-PCR, o ARN total (2 ug) foi transcritos de modo inverso em ADNc num volume de reacção de 20 uL utilizando um kit de ADNc de alta capacidade Transcrição Reversa (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante. As sondas TaqMan para DR5 e β2-microglobulina (β2MG) foram adquiridos de Applied Biosystems. Os níveis de expressão de mRNAs foram quantificados usando o sistema de PCR em Tempo Real Applied Biosystems 7300 de acordo com as instruções do fabricante. O nível de ARNm de DR5 expressão foi normalizada em relação ao nível de ARNm β2MG na mesma amostra.

análise de expressão microARN foi realizada utilizando ensaios de miARN TaqMan (Applied Biosystems) para avaliar o miR-221. O ARN total (10 ng) foi transcritos de modo inverso em ADNc num volume de reacção de 15 uL utilizando iniciadores específicos e cada kit TaqMan MicroRNA Transcrição Reversa (Applied Biosystems). Os níveis de expressão de microRNAs foram quantificados usando o sistema de PCR em Tempo Real 7300 (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante. Os resultados foram normalizados relativamente ao gene de ARN RNU48

imita microRNA transfecção

As células foram transfectadas com 5 nM Imita miRIDIAN microRNA (miR-221 ou # 1 Controlo negativo;. Dharmacon, Lafayette, CO , EUA) utilizando Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Após 24 horas da transfecção, as células foram tratadas com ou sem 40 mM de metformina. As células foram colhidas 24 horas após o tratamento para análise FACS e Western blotting.

Análise estatística

Os dados são as médias ± S.D. de três determinações. Os dados foram analisados ​​usando o Student

foram considerados significativos t-

teste e as diferenças na P . 0,05

Resultados

A metformina suprime o crescimento celular de células de câncer de pâncreas

Para investigar o efeito da metformina sobre células de cancro pancreático humano, nós examinamos se a metformina suprimiu o crescimento celular utilizando um ensaio de exclusão com corante azul de tripano. PANC-1, Mia PaCa-2, e as células AsPC-1 foram tratados com as concentrações indicadas de metformina durante 72 horas, e as células viáveis ​​foram contadas por ensaio de exclusão do corante azul tripano. Como mostrado na Fig 1, a metformina diminuiu o crescimento destas células cancerosas de uma maneira dependente da dose.

, (B) AsPC-1 (A) células PANC-1 MIA PaCa-2, e (C) foram tratados com as concentrações indicadas de metformina. Após incubação durante 72 horas, as células foram contadas por ensaio de exclusão do corante azul tripano. Os dados são as médias ± desvio padrão de 3 determinações. * P 0,05, ** P . 0,01

Metformina induz paragem na fase G1 em células de câncer de pâncreas através de infra-regulação de miR-221

A seguir, realizada a análise do ciclo celular utilizando citometria de fluxo após o tratamento com as concentrações indicadas de metformina para 48 horas de células de cancro pancreático humano. Como mostrado na Fig 2A, e S1, S2 e S4 Figs, metformina causada paragem na fase G1 de um modo dependente da dose. Além disso, examinou-se o efeito da metformina sobre a expressão de proteínas relacionadas com a fase G1. Como resultado, a metformina a 40 mM aumentou a expressão de proteína p27 (Fig 2B). Lee

et al

. previamente identificado um número de expressões microARNs com o aumento, incluindo o miR-21, -221, -301, -376a, -155, bem como outros em células de cancro pancreático humano [32]. Além disso, a proteína p27 foi regulado negativamente por miR-221 em células de cancro pancreático humano [37]. Portanto, examinámos o efeito da metformina sobre a expressão de miR-221. Como mostrado na Fig 2C, a metformina reduz a expressão de miR-221 de uma forma dependente da dose.

(A) células PANC-1 foram tratadas com as concentrações indicadas de metformina durante 48 horas. A percentagem de células em cada fase do ciclo celular foi determinada por citometria de fluxo. (B), (C) células PANC-1 foram tratadas com as concentrações indicadas de metformina durante 48 horas. (B) transferência de Western para p27. β-actina é um controlo de carga. (C) em tempo real de RT-PCR de quantificação de expressão de miR-221. O controle interno foi RNU48. Os valores são a mudança vezes na expressão de miR-221 /RNU48 em comparação com controlo não tratado. (D), as células (E) PANC-1 foram transfectadas com 5 nM de miR-221 mímica ou 5 nM de controlo negativo. Após 24 horas, as células foram incubadas com ou sem metformina 40 mM durante 48 horas. (D) A percentagem de células em cada fase do ciclo celular foi determinada por citometria de fluxo. (E) Western Blot para p27. β-actina é um controlo de carga. Seta, uma banda inespecífica. Os dados são as médias ± desvio padrão de 3 determinações. ** P . 0,01

Para examinar se a alteração na expressão do miR-221 está associada com a indução de p27 e paragem na fase G1 por tratamento com metformina, que transfectadas células PANC-1 com um miR -221 mímica antes do tratamento com metformina e fluxo realizada citometria e análise Western blot. A transfecção de miR-221 mímico reduziu a população de células em fase G1 e a expressão de proteína p27 induzida pela metformina, embora a população fase G1 em células de metformina não tratado foi também diminuída (figura 2D e 2E; S3 figura). Colectivamente, estes resultados sugerem que a paragem na fase G1 induzida pela metformina a 40 mm pode ser causado pela indução de p27 parcialmente através da regulação negativa de miR-221.

A metformina aumenta a apoptose induzida por TRAIL em TRAIL células de cancro do pâncreas resistentes ao

recentemente, foi relatado que a sobre-regulação do receptor de morte 5 (DR5) pela metformina aumentada apoptose induzida por TRAIL de células tumorais malignas p53 de tipo selvagem [34]. Portanto, examinámos o efeito da metformina na sensibilização TRAIL em células de cancro do pâncreas TRAIL-resistente p53 mutante e. Três linhas celulares, PANC-1, ASPC-1, e MIA PACA-2, foram testados quanto à sua susceptibilidade a TRAIL e /ou metformina. No primeiro, as células tratadas com TRAIL humano recombinante exógena com as concentrações indicadas, durante 72 horas, e as células viáveis ​​foram contadas por um ensaio de WST-8. O crescimento das linhas de células não foi marcadamente inibida com TRAIL (Fig 3A; S4A figura). A seguir, investigou o efeito de TRAIL ou metformina na indução de apoptose através da medição da população sub-G1. Metformina ou TRAIL sozinho ligeiramente induzida apoptose nestas três linhas celulares de cancro do pâncreas (Fig 3B e 3C; S4B e S4C Figs). No entanto, o tratamento combinado com metformina e TRAIL marcadamente aumentou a apoptose em todas as linhas celulares testadas (Fig 3D; S4B S4C e figos).

células PANC-1 (A) foram tratados com as concentrações indicadas de TRAIL. Após incubação durante 72 horas, as células viáveis ​​foram avaliadas usando uma contagem celular Kit-8. (B), (C) PANC-1 As células foram tratadas com as concentrações indicadas de TRAIL (B) ou metformina (C) durante 48 horas. populações sub-G1 foram analisadas por citometria de fluxo. (D) Os efeitos combinados de metformina 40 mM e /ou 10 ng /ml de TRAIL durante 48 horas. populações sub-G1 foram analisadas por citometria de fluxo. Os dados são as médias ± desvio padrão de 3 determinações. * P 0,05, ** P . 0,01

Metformina up-regula a expressão de DR5 em células de câncer de pâncreas

Para investigar os mecanismos pelos quais a metformina aumenta a apoptose induzida por TRAIL , examinámos as proteínas relacionadas com a apoptose que foram regulados por metformina utilizando análise de Western blot. células PANC-1 foram tratados com metformina, durante 48 horas, e foi examinada a expressão de receptores de TRAIL, DR4 e DR5 e várias proteínas que sensibilizam as células cancerosas para TRAIL. Como mostrado na Fig 4A, metformina significativamente sobre-regulada a expressão de proteínas de DR4, DR5 e BIM. Em seguida, examinaram a expressão da superfície celular de DR4 e DR5 em células PANC-1 por citometria de fluxo. Metformina aumentou a expressão de superfície de célula única de DR5 (figura 4B e 4C). Além disso, examinou-se o nível de ARNm de DR5 por quantitativo em tempo real de RT-PCR após o tratamento com metformina, nas concentrações indicadas, durante 48 horas. Como mostrado na Fig 4D, metformina aumentou significativamente a expressão do ARNm de DR5.

(A) células PANC-1 foram tratadas com as concentrações indicadas de metformina durante 48 horas. Western blotting de DR4, DR5 e Bim foi realizada. β-actina é um controlo de carga. Seta, banda inespecífica. (B), as expressões (C) na superfície celular de DR4 e DR5 em células PANC-1 tratadas com ou sem 40 mM de metformina durante 48 horas. As células foram coradas com IgG de controlo de isotipo e os anticorpos monoclonais contra DR4 e DR5. Os dados foram analisados ​​por citometria de fluxo. (B) histograma cinzento, sem tratamento; histograma branco, o tratamento com metformina. (C) O eixo Y representa os valores médios geométricos das populações de células nos histogramas. barra cinza, nenhum tratamento; barra branca, o tratamento com metformina. (D) quantitativo em tempo real de RT-PCR de ARNm de DR5 em células PANC-1 tratadas com as concentrações indicadas de metformina durante 48 horas. O controle interno foi β2MG. Os valores são a mudança vezes na expressão de ARNm de DR5 ARNm /β2MG em comparação com controlo não tratado. Os dados são as médias ± desvio padrão de 3 determinações. ** P . 0,01

O aumento da apoptose induzida por TRAIL pela metformina depende de caspases e DR5, mas não miR-221

Para analisar o envolvimento de caspases e DR5 em a apoptose induzida por TRAIL reforçada pela metformina em células PANC-1, examinamos o efeito do pan-caspase inibidor zVAD-fmk ou proteína quimera DR5 /Fc com a função dominante negativo contra DR5. A apoptose induzida pela combinação de metformina e TRAIL foi marcadamente reduzido através da adição da quimera de DR5 /Fc ou zVAD-fmk (Figura 5A). Estes resultados indicam que a apoptose induzida por TRAIL reforçada pela metformina foi disparado pelo menos em parte, de uma forma dependente da caspase e a interacção entre TRAIL e DR5. Em seguida, testámos se a sub-regulação de miR-221 pela metformina contribuiu para a apoptose induzida por TRAIL. Nós transfectadas células PANC-1 com um miR-221 imitar antes de co-tratamento com metformina e TRAIL. Como mostrado na Fig 5B, a transfecção de miR-221 não pode reduzir a população de apoptose por co-tratamento. Estes resultados indicam que o miR-221 não é responsável para o aumento da apoptose induzida por TRAIL pela metformina.

células PANC-1 (A) foram tratados com 40 mM de metformina e /ou 10 ng /ml de TRAIL para 48 horas, com ou sem a 1 ng /ml de DR5 /Fc quimera, ou o inibidor da pan-caspase zVAD 20 uM-fmk. populações sub-G1 foram analisadas por citometria de fluxo. células (B) PANC-1 foram transfectadas com 5 nM miR-221 mímico ou 5 controle nM negativo. Após 24 horas, as células foram incubadas com ou sem 40 mM de metformina e /ou 10 ng /ml de TRAIL durante 48 horas. populações sub-G1 foram analisadas por citometria de fluxo. Os dados são as médias ± desvio padrão de 3 determinações. ** P . 0,01

Discussão

A metformina, o medicamento “clássico” para o diabetes tipo 2, atraiu recentemente a atenção como um agente antitumoral [5-7]. Além disso, os nossos dados mostram novas funções de metformina contra as células cancerígenas pancreáticas.

Tem sido relatado que a paragem na fase G1 metformina induzida com indução da expressão de p27 como um dos mecanismos em células de cancro humano [16]. Da mesma forma, nos nossos resultados, a metformina induzida paragem na fase G1 (Figura 2A), e sobre-regulada a expressão da proteína p27 (Fig 2B) em células de cancro pancreático PANC-1 humana. Foi relatado que a sub-regulação de miR-221 inibiu o crescimento de células de cancro do pâncreas através de sobre-regulação de PTEN, p27, p57, e PUMA [38]. Entre estas moléculas alvo de miR-221, P27 é um inibidor de CDK, que induz a paragem na fase G1 em células de cancro [39]. Portanto, a hipótese de que a metformina poderia regular negativamente a expressão de miR-221, resultando na indução de p27 com a paragem na fase G1 em células de cancro pancreático. Neste estudo, verificou-se que a metformina regulada a expressão de miR-221 em células de câncer de pâncreas (Fig 2C). Além disso, tanto a paragem na fase G1 e a indução de p27 por metformina foram suprimidos por um imitador de miR-221 em células de cancro pancreático (figura 2D e 2E). A partir dos resultados, que mostram pela primeira vez que a paragem na fase G1 induzida por metformina é pelo menos parcialmente causada pela indução de p27 por sub-regulação de miR-221. Enquanto isso metformina diminuiu expressão das proteínas ciclina D1 e CDK4 a 10 mM ou mais (Fig S5), consistente com relatos anteriores [16, 40]. Portanto, a sub-regulação da ciclina D1 e expressões proteína CDK4 pode contribuir para a paragem na fase G1 pela metformina em doses mais baixas. Foi relatado que miR-221, um dos OncomiRs mais conhecidos, foi regulado para cima em várias malignidades, incluindo o câncer de pâncreas [32]. Portanto, o miR-221 é considerado como sendo um alvo atraente para o tratamento selectivo contra o cancro [27-29]. Curiosamente, o estudo anterior demonstrou que o miR-221 foi elevada nas artérias torácicas internas de sujeitos com diabetes do tipo 2 e houve uma correlação inversa significativa entre a dose oral de metformina e o nível de miR-221 [33], levantando a possibilidade que os nossos resultados podem ser fisiológico.

por outro lado, estudos prévios relataram que o miR-221 também contribui para a resistência TRAIL em células de cancro humano [28-31]. Por conseguinte, a hipótese de que a metformina pode ser capaz de melhorar a sensibilidade de TRAIL através de sub-regulação de miR-221 em células de cancro do pâncreas. Para confirmar esta hipótese, primeiro examinamos o efeito da metformina sobre a sensibilidade de TRAIL em células de cancro pancreático humano. No câncer pancreático células PANC-1 humano (Fig 3D), AsPC-1 células (S4B FIG) e células PaCa-2 MIA (S4C FIG), metformina melhorou a sensibilidade de TRAIL. A seguir, analisou se miR-221 foi envolvido no aumento da sensibilidade TRAIL pela metformina. No presente estudo, o imitador de miR-221 não suprimiu a apoptose induzida pela combinação de metformina e células do cancro do pâncreas TRAIL humano PANC-1 (Figura 5B). À medida que a possível razão da diferença a partir de estudos anteriores [28-31], especula-se que a via anti-apoptótica de miR-221 pode não existir em células de cancro pancreático humano testadas. Portanto, sugere-se que a sub-regulação de miR-221 pela metformina está envolvida na paragem da fase G1, mas não a apoptose mencionados acima.

Em seguida, analisamos os mecanismos moleculares que reforcem TRAIL-sensibilidade, e descobriram que metformina induziu a expressão de DR5, um dos receptores de TRAIL (figura 4; S6 figura), e a expressão de Bim (Fig 4A). Não há relatos de que a metformina-regulada a expressão da proteína Bim em células cancerosas humanas. Bim tem uma função pró-apoptótica a jusante da via de TRAIL-DR5. O aumento da regulação do Bim também foi relatado para ser responsável pelo aumento da sensibilidade TRAIL [41]. Nossos dados sugerem, portanto, que DR5 e Bim-regulação pela metformina pode contribuir para a sensibilização da apoptose induzida por TRAIL.

Truong

et al

., Mostrou que a metformina-regulada DR5 por meio de um p53 via dependente [34]. Em contraste, os nossos dados actuais demonstraram claramente que a metformina sobre-regulada de DR5 no cancro pancreático p53 mutante PANC-1 (Figura 4), AsPC-1 e MIA PaCa-2 células (S6 figura), indicando que a metformina se-regula DR5 expressão de uma forma independente de p53. Além disso, a apoptose induzida pela combinação de metformina e TRAIL foi marcadamente reduzida pelo DR5 /Fc quimera (Figura 5A), indicando que a sensibilidade aumentada causada por TRAIL metformina era, pelo menos, parcialmente dependente de DR5. Curiosamente, Ozawa

et al

. demonstraram que os níveis de expressão de proteína de DR5 em amostras de cancro pancreático foram 5,1 vezes maiores (P 0,01). do que o tecido pancreático normais [24]

tem sido relatado que a metformina tem várias funções [6, 7 , 10-16]. Recentemente, os ensaios clínicos de combinações com metformina e vários agentes anticancerígenos estão em curso do ponto de vista do reposicionamento de drogas [8, 9]. No estudo anterior, Gritti

et al

. mostrou que a metformina 40 mM não afecta a viabilidade das células estaminais mesenquimais derivadas de cordão umbilical humano, e descrito que a metformina induz especificamente efeitos anti-tumorais, sem interferir com a viabilidade das células normais [42]. Nós demonstramos aqui que a combinação de metformina e TRAIL é muito eficaz contra as células cancerosas pancreáticas humanas, levantando a possibilidade de uma estratégia de combinação no tratamento de câncer no pâncreas.

Informações de Apoio

S1 Fig. Metformina induz a paragem na fase G1 em células PANC-1.

(A), (B) Os histogramas representativos da Figura 2A. (A) sem tratamento. (B) metformina 40 mM

doi:. 10.1371 /journal.pone.0125779.s001

(TIF)

S2 Fig. Metformina induz a paragem na fase G1 em células MIA PaCa-2.

Células MIA PaCa-2 foram tratadas com as concentrações indicadas de metformina durante 24 horas. A percentagem de células em cada fase do ciclo celular foi determinada por citometria de fluxo. Os dados são as médias ± desvio padrão de 3 determinações. * P 0,05, ** P 0,01

doi: 10.1371 /journal.pone.0125779.s002

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S3 Fig.. Metformina induz a paragem na fase G1 em células PANC-1 a sub-regulação de miR-221.

Os histogramas representativos da Figura 2D. (A) Mock. (B) 40 mM de metformina. (C) imitar o controle negativo. (D) imitar controle negativo e metformina 40 mM. (E) miR-221 mímico. (F) miR-221 mímico e 40 mM metformina

doi:. 10.1371 /journal.pone.0125779.s003

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S4 Fig. Metformina sensibiliza PaCa-2 pancreáticas células cancerosas ASPC-1 e Mia a TRAIL.

Células (A) AsPC-1 foram tratados com as concentrações indicadas de TRAIL. Após incubação durante 72 horas, as células viáveis ​​foram avaliadas usando uma contagem celular Kit-8. células (B) AsPC-1 foram tratadas com a de 10 ng TRAIL /mL e /ou metformina, 40 mM durante 48 horas. células (C) MIA PaCa-2 foram tratadas com a 4 ng /ml de TRAIL e /ou metformina, 40 mM durante 24 horas. populações sub-G1 foram analisadas por citometria de fluxo. Os dados são as médias ± desvio padrão de 3 determinações. * P 0,05, ** P 0,01

doi: 10.1371 /journal.pone.0125779.s004

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S5 Fig.. Metformina sub-regula a expressão de ciclina D1 e CDK4.

Células PANC-1 foram tratadas com as concentrações indicadas de metformina durante 48 horas. Western blotting para ciclina D1 e CDK4 foi realizada. β-actina é um controle de carga

doi:. 10.1371 /journal.pone.0125779.s005

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S6 Fig. Metformina regula-se proteínas p53 de DR5 em células de cancro do pâncreas mutantes.

Células (A) AsPC-1 foram tratadas com as concentrações indicadas de metformina durante 48 horas. células (B) MIA PaCa-2 foram tratadas com as concentrações indicadas de metformina durante 24 horas. Western blotting de DR5 foi realizada. β-actina é um controle de carga

doi:. 10.1371 /journal.pone.0125779.s006

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