Abstract

miRNA regular a expressão gênica ao nível pós-transcricional e afinar os processos biológicos fundamentais, incluindo a progressão do câncer. Aqui, demonstramos o envolvimento de miR-200b na metástase do câncer de próstata. Foram identificados miR-200b como um alvo a jusante do receptor de androgénio e sua expressão ligada à diminuição da capacidade metastática e tumorigenicidade das células cancerosas da próstata. A sobre-expressão de miR-200b em células PC-3 inibiu significativamente a sua proliferação e a formação de tumores subcutâneos. Além disso, num modelo ortotópico, miR-200B bloqueou a metástase espontânea e angiogénese por células PC-3. Esta diminuição do potencial metastático foi provavelmente devido à inversão da transição epitelial-mesenquimal-a, tal como foi evidenciado pelo aumento da E-caderina marcador pan-epitelial e os marcadores específicos do epitélio da próstata, citoqueratinas 8 e 18. Em contraste, marcadores mesenquimais, fibronectina e vimentina, foram significativamente reprimidos por miR-200b. Nossos resultados sugerem um papel importante para miR-200b na progressão do cancro da próstata e indicar a sua utilidade potencial para a terapia do cancro da próstata

Citation:. Williams LV, Veliceasa D, Vinokour E, Volpert OV (2013) miR-200b Inibe prostate Cancer EMT, Crescimento e metástase. PLoS ONE 8 (12): e83991. doi: 10.1371 /journal.pone.0083991

editor: Hari K. Koul, Louisiana State University Health Sciences Center, Estados Unidos da América

Recebido: 23 Setembro, 2013; Aceito: 11 de novembro de 2013; Publicação: 31 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Williams et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Herman L . Fundo Kretschmer, via Northwestern University Departamento de Urologia (OV), o SPORE no Prêmio piloto do cancro da próstata P50 CA090386 (OV), a diversificação do Ensino Superior Faculdade de Illinois Fellowship Grant (LVW). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

MicroRNA (miRNA) são curtos, (21-22 nucleotídeos) não-codificantes RNA que se ligam ao mRNA e reprimir expressão gênica por mRNA degradação /desestabilização ou através da tradução prejudicada [1]. MicroRNA são primeiramente transcrito como 100 pb primárias estruturas em gancho de cabelo de miARN, que são subsequentemente clivados por Drosha em pré-miARN e exportados a partir do núcleo para o citoplasma para processamento adicional [2], [3]. A clivagem da pré-miARN por proteínas Dicer produz 22 pb moléculas de cadeia dupla, da qual um filamento é carregado selectivamente sobre as proteínas Argonaute, que facilitam a miARN ligação a sequências alvo de ARNm no 3’UTR. Mirna têm um papel central em vários processos de desenvolvimento e patológicos, incluindo o cancro da mama, pele, pulmão e colo do útero [4] – [9].

O miRNA hsa-miR-200b pertence a uma família que inclui miR-200a, miR-200c, miR-141 e miR-429. A desregulação do miR-200b tem sido atribuído um papel crítico na epitelial para mesenquimal (EMT) e metástases em cancros, tais como cancro da mama, gástrico, pancreático e os carcinomas [10] – [12]. Human miR-200b participa de um duplo loop de feedback com os dois reguladores de transcrição da caderina-E, ZEB1 e ZEB2 [13]. Nas células epiteliais normais, o miR-200b é expresso em níveis elevados; alvejando as regiões 3’UTR de transcrição pró-metastático factores ZEB1 ZEB2 e que bloqueia a expressão e pára EMT [10]. Em contraste, em células mesenquimatosas, onde a expressão ZEB1 /ZEB2 é anormalmente elevada, eles suprimem o miARN de miR-200 família por bloquear a sua actividade de promotor de [13]. Vários estudos avaliar a função miR-200b na EMT, embora haja algumas tentativas para resolver o seu papel no crescimento do tumor primário.

Aqui, nós demonstramos que o miR-200b possui uma actividade similar no câncer de próstata. Buscando identificar miRNA que contribuem para diminuição da agressividade e tumorigênese no câncer de próstata, foi realizada profiling miRNA de linhas de células com expressão induzível de receptor de andrógeno previamente desenvolvido em nosso laboratório. Descobrimos que o miR-200B foi significativamente regulada positivamente nas células AR-positiva PC3 mal tumorigénicas e que a sobre-expressão de miR-200b levou a uma diminuição do crescimento do tumor. Esta diminuição tumorigênese foi provavelmente devido à proliferação diminuída. Por outro lado, o miR-200b upregulated fortemente o marcador celular E-caderina epitelial em células APC, enquanto que os marcadores mesenquimais Fibronectina e vimentina foram concomitantemente reduzida. De acordo com as análises realizadas em outros tipos de tumores, ZEB1, um regulador da transcrição de E-caderina também foi diminuída após o miR-200b superexpressão. Além disso, o miR-200b reduziu o potencial invasivo das células CaP

in vitro

e diminuiu a metástase. Nossos resultados mostram que miR-200b diminui o crescimento do tumor e inverte EMT no câncer de próstata.

Métodos

Animal Welfare Assurances

Todos os estudos envolvendo animais de laboratório (ratos) foram aprovados pela Cuidados com a Universidade Northwestern animal e Comitê de Uso e realizada de acordo com as directrizes aprovadas e sugeridas pelos Institutos Nacionais de Saúde (número de garantia de animal A3283-01, data de validade 2014/05/31).

linhas celulares e Tratamento condições

células PC3 transfectadas com o receptor de tipo selvagem indutível de androgénio (AR) ou o plasmídeo de controlo foram estabelecidos anteriormente [14]. As células foram mantidas em meio RPMI suplementado com 10% livre de tetraciclina de Soro Fetal Bovino (FBS), 2% de penicilina /estreptomicina, 50 ng /ml de zeocina e 1 ug /ml de blasticidina. Para a expressão de AR, as células PC3-AR foram tratados durante 5 dias com 1 pg /ml de doxiciclina e 1 nM de metiltrienolona (R1881) em fenol meios RPMI sem vermelho suplementado com FBS a 10%, descascou-carvão a 2% de penicilina /estreptomicina, 50 ug /ml de zeocina e 1 ug /ml de blasticidina. As células PC3 parentais foram mantidas em RPMI com 10% de FBS e 2% de penicilina /estreptomicina. Todas as células foram cultivadas a 37 ° C e 5% de CO

2, num incubador humidificado.

imunotransferência

As células foram plaqueadas a uma densidade de 100.000 células por placa de 10 cm. As células foram recolhidas por raspagem em tampão fosfato salino (PBS) e centrifugado a 2.500 rpm durante 10 minutos a 4 ° C. O sedimento de células foi lisada em tampão RIPA (Sigma, St. Louis, MO) suplementado com 1X solução inibidor de protease /fosfatase (Thermo Scientific, Waltham, MA) e centrifugou-se a 12.000 rpm durante 20 minutos a 4 ° C. A concentração do sobrenadante foi determinada em triplicado por ensaio de proteína (DC Protein Assay, BioRad, Hercules, CA). Os lisados ​​foram sujeitos a electroforese em 4% -20% de gel de poliacrilamida Tris-HCl (Biorad, Hercules, CA). lisado de proteína foi transferido durante a noite para membranas de PVDF (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburg, PA). Cada membrana foi lavada em 1X solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBS-T) 0,1%, bloqueadas com 5% de leite magro em TBS-T, e sondadas com anticorpos, tal como indicado na Tabela S3.

ARN extração

Para a detecção de miRNA, o RNA total foi isolado com miRNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA). Para a extracção de ARNm, os tumores foram congelados instantaneamente em azoto líquido e transferidos para solução de estabilização de ARN (Ambion, Life Technologies, Grand Island, NY). Os tumores foram mantidos a -80 ° C e extracção de RNA foi realizada usando miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). A concentração ea pureza RNA foi medida com NanoVue Além disso espectrofotômetro (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburg, PA).

Tempo real RT-PCR

RNA foi transcrito de forma inversa com o Kit miScript II RT (Qiagen , Valência, CA) seguindo as instruções do fabricante. O cDNA resultante foi utilizado para a análise por PCR em tempo real utilizando o kit miScript SYBR Green PCR (Qiagen, Valencia, CA). Para miARN individuais quantificação utilizou-se miScript Primer Ensaios (Qiagen, Valencia, CA). Para a análise de reacção em cadeia da polimerase (PCR), directo e inverso, os iniciadores foram concebidos e adquiridos a Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) e as reacções realizadas utilizando SYBR Green Super Mix (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD). As reacções foram realizadas num Thermal iCycler (Biorad, Hercules, CA). Cada amostra foi testada em triplicado.

Análise matriz miARN

células PC3-AR foram tratadas com doxiciclina (Dox) e R1881 (como descrito acima) para a expressão e a activação do receptor andrógeno (AR) , respectivamente. O ARN foi extraído como descrito acima e 5 ug de cada amostra foi enviada para Ciências LC (Houston, TX) para análise de matriz. As amostras foram marcadas com Cy

3 ou Cy

5 e a relação da intensidade de cada um deles foi usado para determinar as alterações no nível de expressão de miARN. A 20 sequência de controlo de nucleótidos de RNA complementar a várias sondas de controlo manchados em cada chip foi incluído em cada amostra como controlo interno. Os microarrays foram realizadas em triplicado para as sequências humanas, de ratinho e de rato. O espectro de alvo potencial para selecionar miRNA foi definida utilizando Sanger miRBase 11.0. A significância estatística foi determinada utilizando o teste T de Student para p 0,10, p 0,05 e p . 0,01

miR-200b superexpressão

Shuttle vector sequência precursor codificação de HSA-miR-200b (pMIRNA1 pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP) e controle de vetores (pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP) do Sistema de Biociências (SBI, mountain View, CA) foram propagadas em meio Luria 50 ug /ml de ampicilina durante a noite a 30 ° C num agitador orbital. ADN plasmídico sem endotoxinas foi isolado utilizando Endo-free Maxi Prep Kit (Qiagen, Valencia, CA). partículas lentivirais foram produzidos para cada plasmídeo em células HEK293T usando o envelope pMD2.G e psPAX2 2

geração nd plasmídeos de embalagem (AddGene, Cambridge, MA). O título foi determinado por citometria de fluxo de células infectadas, tal como descrito anteriormente [15]. Para a transfecção, as células PC3 foram semeadas em placas de 6 poços em 10

5 células /poço. No dia seguinte, o meio foi substituído com 1 ml de 1X DMEM contendo o MOI apropriado de partículas lentivirais para miR-200b e controle do vetor vazio. Após 6 horas de incubação, as células foram alimentadas com meio RPMI com 10% de FBS e 2% de penicilina /estreptomicina e incubou-se durante mais 48 horas. células transduzidas que expressam níveis elevados de marcador RFP foram isolados e citometria de fluxo combinada com separação de células e mantidas em RPMI com 10% de FBS, penicilina /estreptomicina e 1 ug /ml de puromicina para selecção adicional.

Tumorigênese Ensaios

(1) inoculação subcutânea.

células PC3 parentais, as células PC3 transduzidas com células de controlo lentivírus e miR-200b foram cultivadas como acima descrito, colhidas e ressuspensas a 2 x 10> 7

6 células /ratinho) foram injectados por via subcutânea nos quartos traseiros traseiros de ratos machos atímicos (nu /nu, n = 5). Os tumores foram medidos com microcalipers três vezes por semana e o experimento foi encerrado aos 29 dias pós-implantação. Os tumores foram congelados instantaneamente em azoto líquido e armazenado a -80 ° C para análise subsequente.

Foi realizada

(2) implante ortotópico de células tumorais como descrito anteriormente [16].

Resumidamente , incisões medianas foram feitas, superior à área genital de camundongos atímicos macho anestesiado em decúbito dorsal (nu /nu). A bexiga foi exteriorizada e estendida com um cotonete de algodão para revelar as vesículas seminais e do dorso da próstata. As células tumorais em 50 ul de meio RPMI isento de soro (10

6 por animal) foram injectados na próstata e o músculo e pele foram fechados com suturas e clipes de metal, respectivamente. Todos os procedimentos foram realizados em ambiente estéril. Grampos metálicos foram removidos 2 semanas pós-injecção. O crescimento do tumor foi monitorizado por fluorescência de GFP, utilizando sistema de imagem pequena OV100 animais (Olympus). O experimento foi encerrado 20 dias após a implantação. Os tumores foram extirpados e snap-congelados para posterior análise. Para avaliar a metástase, a fluorescência residual foi medida após a remoção do tumor primário.

Ensaio de Proliferação

As células foram semeadas em triplicado em placas de 96 poços a 3 x 10

3 células /bem. Após 24, 48 e 72 horas, 10 ul de reagente WST-1 (Roche, Indianapolis, IN) foi adicionado a cada poço e incubou-se durante 2 horas. A absorvância foi medida para cada ponto de tempo no comprimento de onda de 450 nm usando o leitor de microplacas Biorad (Biorad, Hercules, CA).

In Vitro

Invasion Ensaio

Transwell inserções (Corning, Tewksbury, MA) foram revestidas com 100 uL de 1 mg /ml de vermelho de fenol factor de Crescimento livre reduzida Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) e deixou-se solidificar à temperatura de 37 ° C num incubador de cultura de tecido durante 24 horas . As células foram ressuspensas a uma densidade de 10

6 células /200 uL em meio RPMI isento de soro, semeadas em duplicado na parte de cima das inserções revestidas e incubadas a 37 ° C durante 24 horas, com 700 uL de 10% FBS adicionada à câmara inferior, como um quimioatractor. As células foram fixadas e coradas utilizando soluções DiffQuick fixadora (Dade Behring, Malvern, PA) e 6 campos foram fotografadas para cada condição experimental. A invasão foi calculada como células invadidas por cento. A experiência foi realizada duas vezes.

ciclo celular Análise

As células foram semeadas a 10

6 células /ml em RPMI suplementado com 0,2% de FBS. Após 48 horas as células foram tratadas com tripsina, lavadas duas vezes em PBS frio, fixadas em 10 ml de etanol a 75% arrefecido em gelo e mantida durante a noite a -20 ° C. As células foram lavadas duas vezes em 1X PBS a 4 ° C, ressuspendidas em 2,0 mL de solução de coloração DAPI (0,1% Triton X 100 em 10 ml de PBS, 100 ul de 1 mg /ml de DAPI) e analisadas por FACS.

Análise estatística

Todos os dados quantitativos foram gerados a partir de pelo menos duas experiências independentes agrupados em conjunto, com cada ponto de dados individual realizada em triplicado. Desvio Padrão (SD) foram calculados utilizando o software Microsoft Excel. Para determinar a significância estatística dos difffrences observadas, temos realizado comparação pareada dos conjuntos de dados, usando T-teste unilateral de Student. A significância estatística foi fixado em valor P não superior a 0,05.

Resultados

miR-200b é regulada pela AR

Os dados anteriores de nosso grupo mostrou que receptor androgênico (AR) inibe propriedades tumorigénicas da linha celular de cancro da próstata AR-negativa, o PC-3 [14]. MicroRNA são modificadores importantes funções biológicas, incluindo o crescimento do tumor. Nós procuramos o miRNA que são controlados por AR e envolvida na regulação negativa da progressão do câncer de próstata. Para esta finalidade, foi realizada perfis miARN da linha celular previamente gerado com AR expressão indutível por tetraciclina ([14], a Fig. 1a). As células foram tratadas com doxiciclina (Dox) para assegurar a expressão do AR e com R1881, para induzir a translocação nuclear de AR e a actividade de transcrição.

(A) Western blot para confirmar a expressão induzível de AR nas células PC3-AR. células PC3-AR foram tratados 5 dias com doxiciclina para induzir a expressão AR e com R1881 para induzir a ativação de AR e translocação nuclear. A comparação é o controlo não tratado. Os lisados ​​celulares totais foram usadas para análise. (B). mapa de calor de expressão em células PC3 miARN-AR e de controlo. O ARN total a partir de células em A foi usado para a análise de microarray e cada amostra analisada em triplicado. A significância estatística para as mudanças de expressão mostrado foi determinada utilizando o teste-T de Student. P valores 0,05 foram atribuídos significância estatística

análise Microarray revelou expressão estatisticamente significativa diferencial de 837 miRNA indivíduo em resposta à ativação AR. (P 0,05, conforme determinado pelo teste T de Estudantes), da quais 116 foram mostrou P-valores abaixo de 0,01 (Figura 1b, Tabelas S1 e S2). Foram selecionados miRNA que foram alterados mais de 2 vezes e analisados ​​os seus objectivos e funções potenciais usando Sanger miRBase versão 11.0 e Diana Micro T versão 3.0. Oito miRNA foram selecionados com base no seu potencial envolvimento na progressão do cancro como foi determinado pela

in silico

análise e estudos publicados. Cinco da miARN seleccionada regulada positivamente nas células PC3-AR menos tumorigénicas também foram associados com a diminuição da tumorigénese em outros tipos de cancro (Tabela 1). MicroRNA do cluster de miR-200 (miR-200a, miR-200b) têm sido mostrados para agir como supressores tumorais na gástrico, do colo do útero, do pulmão, da mama e os cancros da próstata [9], [10], [17], [18] . níveis de miR-200C aumentados têm sido associados a uma diminuição de metástases em melanoma, carcinoma de células escamosas, e cancro da próstata [6], [18], [19]. miR-30a e miR-30 d expressão é significativamente reduzida na leucemia mielóide crónica, cancro do pulmão de células não pequenas, carcinoma de células renais, cancro da próstata e [20] – [23]. Em contraste, o miR-7 e miR-9 níveis foram reduzidos na linha celular de menos tumorigénico. Em acordo, o miR-7 foi identificada como um oncogene em carcinoma de células renais [24] e miR-9 atribuído um papel na leucemogênese [25] – [27]. Baixos níveis de miR-196.º foram observados em melanoma maligno [28] (Tabela 2).

Temos validado selecione microRNA identificado por análise de matriz usando PCR em tempo real. Com efeito, o miR-200b, 30a, 30d e foram aumentados, e miR-9 diminuiu, e estas alterações eram estatisticamente significativa (p £ 0,05) (Figura 2a). Foram selecionados miR-200b para análise posterior, uma vez que apresentou a maior alteração vezes e por causa de seu papel conhecido no EMT e metástase [10], [13].

(A). expressão miARN foi normalizada com a das células de controlo (Ctrl). células de controlo PC3-AR e foram tratados 5 dias com doxiciclina para induzir a expressão AR e com R1881 para induzir a ativação de AR e translocação nuclear e RNA total coletado para análise. A comparação é o controlo não tratado e RNU1A_1 ARN não codificadora é usada como um controlo interno. O significado estatístico das diferenças observadas em comparação com o controlo é * p £ 0,05, e ** p≤0.01 como foi determinado por uma cauda t-teste de Student. Os valores médios são calculados para duas experiências independentes realizadas em triplicado. (B) a ativação AR regula positivamente miR-200b. células PC3-AR (barras cinzentas) foram tratados com 5 dias tanto a doxiciclina para induzir a expressão do AR e com R1881 para induzir a activação de AR e a translocação nuclear. A comparação é o controlo não tratado. Flutamida foi adicionado onde indicado para bloquear a actividade de AR. Controle de células (ctrl) PC3-AR foram deixados sem tratamento. ARN não codificante RNU1A_1 foi usada como um controlo interno. *, P 0,05; **, P 0,01 como determinado pelo teste t de Student. Os valores médios foram calculados para dois experimentos independentes realizadas em triplicado.

Medimos os níveis de miR-200b em células PC3-AR tratados com a combinação de doxiciclina, um andrógeno sintético R1881 eo flutamida anti-andrógeno , um inibidor competitivo da função de AR. MiR-200B foi aumentada significativamente em resposta a R1881 e este aumento foi abolido por flutamida de uma forma dependente da dose, sugerindo uma regulação da transcrição directa por AR (Figura 2b).

miR-200b suprime o crescimento de cancro da próstata xenotransplantes

a seguir, procurou o efeito da expressão de miR-200b na tumorigênese do câncer de próstata. Nós overexpressed miR-200b em células PC3 por transdução com lentivírus de título elevado, utilizando o vector vazio (pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP) como controlo negativo, e confirmou a expressão de miR-200b por em tempo real de RT-PCR (Figura 3a). As linhas celulares resultantes e as células PC3 parentais foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus atímicos machos. Mais importante, os tumores formados por células que expressam o miR-200b foram significativamente menor, em seguida, os tumores formados pela PC3 parentais e as células transduzidas com vector de controlo (Figura 3B). Importante, a expressão de miR-200B foi mantida durante a duração da experiência, tal como foi verificado por: em tempo real de RT-PCR (Figura 3c). Uma vez que as interacções com o seu microambiente do tumor desempenham um papel fundamental na progressão tumoral, foi realizada implante ortotópico do PC3-200b e controlar linhas celulares como previamente descrito [16] na próstata dorsal de ratinhos atímicos macho. Nós levou vantagem do marcador RFP incorporado no vector lentiviral bicistr�ica para executar

in vivo

imagem longitudinal. A fluorescência em geral pré-dissecção foi significativamente menor em ratinhos portadores de PC3 miR-200b tumores positivos em comparação com o grupo de controlo do vector (Figura 3D, e). Assim, a expressão de miR-200B era suficiente para reduzir o crescimento do tumor. Além disso, a imagem latente do abdômen após a remoção do tumor revelou significativamente menor fluorescência devido a lesões secundárias, sugerindo que miR-200b diminuiu tanto o crescimento primário e metástase pelas PC-3 células de PCA (veja abaixo).

A) Forçado expressão de miR-200b em células PC3. células PC3 foram trasduced com um vector de transporte lentiviral bicistr�ica (pMIRNA1 pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP) codificação de HSA-miR-200b e controle do vetor vazio (ctrl). O ARN total foi isolado e expressão miR- 200b medida utilizando em tempo real de RT-PCR. Os valores representam três experiências independentes realizadas em triplicado. *, P≤0.01. (B) o miR-200b reduzida tumorigénese por células PC-3. células PC3 parentais, as células PC3 trasduced com miR controlo (Ctrl) e miR-200b foram injectados por via subcutânea nos quartos traseiros traseiros de ratinhos atímicos machos (n = 5). O peso do tumor no dia 29 pós-injeção é mostrado. *, P ≤ 0,05; **, P≤0.01. (C) Os tumores mantida expressão de miR-200b. Relativa expressão de miR-200B foi medido pelo tempo real de RT-PCR em tumores a partir do painel (B). * P ≤ 0,05. (D). miR 200b diminuição do crescimento do tumor num modelo ortotópico de cancro da próstata. PC3-ctrl RFP-marcados e células PC3-200b foram implaned nas próstatas de ratos do sexo masculino atímicos. A fluorescência média foi medida 20 dias após a injecção. (E) Fluorescência por animal foi determinada utilizando imagem de corpo inteiro, com o sistema Olympus OV100. *, P ≤ 0,05. (F) O crescimento celular foi medida pelo ensaio de WST-1. células PC3-ctrl ou PC3 miR-200b foram semeadas a 3000 células por poço numa placa de 96 poços. A absorvância foi medida em pontos de tempo indicados utilizando um leitor de microplacas BioRad Modelo 680. Os resultados representam a média de três experiências independentes realizadas em triplicado. *, P ≤ 0,05 pelo teste t de Student. (G, H) secções de tumores foram coradas para o Ki-67, para avaliar a proliferação. Nota uma diminuição significativa nos núcleos Ki-67-positivas, na presença de miR-200b. *, P . 0.001

miR-200b suprime a proliferação das células CaP

Procurando fatores que contribuem para o crescimento do tumor diminuiu, foi realizada a análise do ciclo celular de controle PC3 e PC3 miR- 200b células e observou-se um ligeiro aumento em células positivas miR-200b sugerindo parada do ciclo celular (Figura S1) fase G2 /M om. Com efeito, WST-1 para ensaio de células viáveis ​​revelou uma ligeira mas significativa redução no número de células em que as células positivas de miR-200b, em comparação com controlo de vector (Figura 3 g, h). Combinado com diminuição significativa em Ki-67 núcleos positivos nos tumores PC-3 quando da expressão de miR-200b (Figura 3F), os nossos resultados sugerem que a diminuição observada no crescimento do tumor foi causado pela proliferação diminuída.

miR- 200b inverte epiteliais para Mesencymal Transição em células CaP

em estudos anteriores, a expressão de miR-200b na mama, gástrico e carcinoma de células renais se correlaciona com o estado mais diferenciado, e re-introdução de miR-200b inverte EMT [ ,,,0],10], [11], [29]. Essas alterações podem, em última análise contribuir tanto para diminuir o crescimento de tumores e metástases. Portanto, foram analisados ​​os níveis de marcadores de diferenciação e EMT conhecidos expressos pelas células PC-3, na presença ou ausência de miR-200b. Primeiro, a análise de transferência de Western demonstrou um aumento significativo nos marcadores de diferenciação típicos do epitélio da próstata e citoqueratina CK8 CK18 por miR-200b, sugerindo um estado mais diferenciado de células positivas para miR-200b (Figura 4).

(A ). CK 8 e CK 18 foram analisados ​​por western blot de lisados ​​de proteína total a partir de células PC3-ctrl e PC3 miR-200b. (B) A análise quantitativa da experiência (A) com o programa Image J. O gráfico representa média de dados de dois experimentos independentes. *, P ≤ 0,05 e ** p . 0,01 pelo teste t de Student

Em acordo, os níveis de E-caderina, também foram aumentadas (Figura 5a), sugerindo uma mudança no sentido fenótipo epitelial . Além disso, vimentina, um marcador mesenquimais, foi submetido a uma diminuição estatisticamente significativa na expressão de miR-200b. Outro marcador mesenquimais, f ibronectina (FN) exibiu uma tendência semelhante, embora a diminuição não foi estatisticamente significativa (Figura 5b). Uma vez que em estudos anteriores miR-200b controlada E-caderina e EMT pela repressão do factor de transcrição ZEB1, avaliámos ambos os níveis de proteínas totais ZEB1 e RNA em células de miR-200b-positivos e de controlo de PC-3. Observou-se uma diminuição significativa e reprodutível em proteínas ZEB1 e mRNA em resposta a miR-200b (Figura 5c, d). Este resultado é consistente com o aumento (Figura 5a) expressão de E-caderina. Os nossos resultados demonstram claramente que a expressão de miR-200b promove as características de células epiteliais e mesenquimais suprime funções em células PC3.

marcadores (a) Afectadas por miR-200b em células PC-3. E-caderina, fibronectina, e vimentina foram detectadas em lisados ​​de células inteiras a partir de células Ctrl PC3 e miR-200b PC3 por western blot. (B) A análise quantitativa da experiência mostrada em (A) realizada com o programa Image J. *, P 0,05 e, **, p≤0.01 como determinado pelo teste t de Student. Dois experimentos independentes foram reunidas. (C) para transferência de Western e ZEB1 quantificação realizada como acima (a média de duas experiências é mostrado). (D) do ponto final de PCR para ZEB1. (E)

In vitro

transpoço ensaio de invasão: a comparação de células PC3-ctrl e PC3 miR-200b. 10% de FBS foi usado como quimioatractor e a experiência foi realizada em duplicado. *, P 0,05 pelo teste t de Student. (F) O

In vivo

metástases espontâneas de células PC3-ctrl e PC3 miR-200b. As células foram implantadas ortotopicamente nas próstatas ventrais de ratinhos nus do sexo masculino. Os ratos foram submetidos a exames de corpo inteiro para massas RFP-positivos usando imagem Surface. No fim do experimento, os animais foram sacrificados, a cavidade peritoneal aberta e metástase visualizadas por imagiologia de fluorescência após a remoção de um tumor primário no interior da cavidade peritoneal e na parede frontal do abdómen (cavidade peritoneal). Campo brilhante (BF) e fluorescência (RFP, proteína fluorescente vermelha) são mostrados. (L) Quantificação da experiência apresentada na (F). As metástases foram contadas e a fluorescência total por metástase calculada (esquerda). fardo metastático bruta foi estimada como fluorescência total por rato. Ctrl indica controle e 200b indica miR-200b. **, P≤0.01 pelo teste t de Student.

miR-200b Diminui invasão e metástase de células PC-3

Porque miR-200b causado reversão EMT em CaP PC- 3 células, era razoável esperar um potencial invasor também diminuiu. Utilizando um procedimento padrão para medir a invasão de células, observou-se um decréscimo significativo na percentagem de células invadidas devido à expressão de miR-200b, em comparação com o controlo (Figura 5e). Esta invasão diminuiu provável subjacente à metástase diminuiu regional através PC3 miR-200b células

in vivo

.

injeção ortotópico de células PC-3 e de controle de vetores parentais para as próstatas dorsal de ratos do sexo masculino atímicos resultaram na metástase espontânea, tal como foi detectado após a remoção de tumores primários (Fig. 5f e Fig S2). A fluorescência total, devido a metástases foi drasticamente diminuída em ratinhos implantados com as células PC-3 que sobre-expressam o miR-200b (Figura 5F, G e A Figura S2). Assim, nossos dados sugerem que miR-200b diminui significativamente características mesenquimais em células de câncer de próstata e, portanto, reduz as suas características invasoras e potencial metastático.

miR-200b Reduz Tumor Angiogenesis

Outra característica que pode permitir a metástase é a angiogénese e EMT é muitas vezes acompanhado pelo aumento da angiogénese. A expressão de miR-200b apareceu para reverter interruptor angiogénica em células PC-3 como foi evidenciado pela diminuição da densidade microvascular nos tumores miR-200b positivos em comparação com os tumores de controlo de PC-3 ou vector parental (Fig. 6).

Secções de tumores formados por controlo e miR-200b positivos PC-3 tumores foram coradas para o marcador CD31 endotelial e o número de microvasos por campo determinados em dez campos 10 ×. *, P . 0,01

Discussão

A família miR-200 é uma família tumor-supressora de microRNA que desempenham papéis críticos na supressão da EMT. Embora o papel da família miR-200 em cancros da mama e outros cancros epiteliais está bem estabelecida, existem poucos resultados que ligam o miR-200 com cancro da próstata. Um estudo em pequena escala (20 pacientes) sugere uma associação entre a recidiva bioquímica após prostatectomia radical e os baixos níveis de miR-200c [30]. Um estudo por He

et ai.

Demonstra que os baixos níveis de miR-200b-3p em células independente de androgénios são causados ​​pela diminuição da expressão da proteína p73-P-53 relacionadas e contribuir para o aumento da proliferação [31] . Os dois conjuntos que codificam família miR-200 encontram-se nos cromossomas 1 e 12, com miR-200b, 200a-miR, e miR-429 no cromossoma 1 e miR-200c e miR-141 no cromossoma 12. MicroRNA 200c é pensado para ser -epitelial específica e a sua expressão é reprimida por hipermetilação da ilha CpG proximal nos fibroblastos e nas linhas celulares de cancro da mama [32]. No PC-3, mas não em células LNCaP e DU145 APC, hipermetilação semelhante da ilha CpG coincide com os baixos níveis de miR-200c e miR-141 [32]. Consistente com os nossos resultados, neste estudo, as células PC3 negativos para miR-200c e miR-141, apresentam um fenótipo mesenquimal clara e a capacidade de invasão e metástase [32]. Dois estudos indicam o papel de miR-200 na tumorigênese pelas células-tronco APC. Em células estaminais-CaP como a expressão de Sox2, Nanog, Oct4, Lin28B e /ou de Notch1 é consistente com a sobrevivência clonogénica melhorada e a capacidade para formar esferóides (prostaspheres). Estas características tronco-estão ligados, para a diminuição da expressão de miR-200b /c e /ou de deixar-7 família em que a re-expressão de miR-200 inibe a formação prostasphere e reduz Notch1 e Lin28B, os condutores de auto-renovação [33] . Num estudo relacionado, os clones invasivos tumorigénicas derivadas da hiperplasia prostática benigna (BPH) -1 linha de células cronicamente expostas a TGF-beta de exibição EMT características proeminentes com níveis elevados de SNAI2, ZEB1, e ZEB2, todas confirmadas miR-200 alvos; no entanto, os basais miR-200 níveis nestas células permanecem inalterados sugerindo um mecanismo divergentes [34].

As características estaminais-como aumentados sugerem tumorigenicidade aumentada. De facto, vários grupos demonstraram que o miR-200b altera a taxa de crescimento de tumores experimentais pelas células cultivadas CaP [35]. Nossos dados corroboram claramente estas observações.