Sumário
epitelial-mesenquimal transição (EMT) está associada com a perda da molécula de adesão célula-célula E-caderina e ruptura das junções célula-célula, assim como com a aquisição de propriedades migratórias incluindo reorganização do citoesqueleto de actina e de activação da GTPase RhoA. Aqui, mostramos que a despolimerização do citoesqueleto de actina de várias linhas de células de cancro metastático com citocalasina D (Cit D) reduz os níveis de tamanho de célula e F-actina e induz a expressão de E-caderina, tanto a nível de ARNm e de proteína. Indução de E-caderina foi dependente da dose e em paralelo perda dos marcadores mesenquimais N-caderina e vimentina. níveis de E-caderina aumentada 2 horas após a adição de Cit D em células que apresentam uma resposta de ARNm da E-caderina, mas só depois de 10-12 horas em HT-1080 fibrossarcoma e células MDA-MB-231, em que o nível de ARNm da E-caderina eram apenas minimamente afectada pelo tratamento Cyt Cyt D. D induziu a translocação nuclear de factores citoplasmático /2/3 transcrição SNAI 1 e EMT-Smad1 associados. Em células MCF-7 de cancro da mama não-metastático, que expressam E-caderina e representam um modelo de células de câncer de EMT, despolimerização da actina com Cit D induzida elevada E-caderina, enquanto a estabilização de actina com jasplaquinolida reduziu os níveis de E-caderina. níveis de E-caderina elevados devido à Cit D foram associados com a ativação reduzida de Rho A. Expressão de Rho dominante negativo Um aumento e dominante-ativa Rho mutante Um mutante diminuição dos níveis de E-caderina e indução também impediu Cit D da caderina-E. Reduzido Rho A activação a jusante da remodelação da actina, portanto, induz a E-caderina e inverte EMT em células cancerosas. tratamento Cit D inibiu a migração e, em concentrações mais elevadas, induziu citotoxicidade de ambas as células de fibrossarcoma HT-1080 e fibroblastos normais HS27, mas apenas induzida transição mesenquimais-epiteliais em células de cancro HT-1080. Nossos estudos sugerem que a actina remodelação é um regulador a montante da EMT em células cancerosas metastáticas
Citation:. Shankar J, Nabi IV (2015) Actin Regulamento citoesqueleto das epitelial mesenquimal Transição em células de câncer metastático. PLoS ONE 10 (3): e0119954. doi: 10.1371 /journal.pone.0119954
Editor do Academic: Jung Weon Lee, da Universidade Nacional de Seul, República da Coreia
Recebido: 18 de julho de 2014; Aceito: 26 de janeiro de 2015; Publicação: 10 de março de 2015
Direitos de autor: © 2015 Shankar, Nabi. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa Cancer Research Society (IRN), a Canadian Breast Cancer Foundation bolsa pós (JS) e uma Innovation Grant Research Institute Canadian Cancer Society (MR). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:. Ivan Nabi é um membro do Conselho Editorial PLOS e isso não altera os autores ‘ adesão a PLOS ONE políticas e critérios editoriais.
Introdução
epitelial-mesenquimal de transição (EMT) é um programa celular necessário durante os processos normais de desenvolvimento, tais como a embriogênese e tecido remodelação e também na progressão da doenças tais como o cancro [1]. Durante este processo, a perturbação de célula-célula e célula-matriz extracelular (ECM) aderências lançamentos células epiteliais do tecido circundante. As células libertadas transformar em mesenquimais, células migratórias com uma maior capacidade para se mover através da malha de ECM tridimensional. expressão localizada de fatores de crescimento como o TGF-β e EGF induz EMT através da ativação de Wnt e Notch vias de sinalização e activação a jusante de fatores de transcrição, como Smad, Caracol, ZEB e Twist. Expressão de proteínas de adesão célula-célula epitelial, tais como E-caderina é regulado para baixo enquanto que as proteínas de adesão célula-célula do mesênquima, tais como N-caderina, vimentina e o extracelular proteínas da matriz de fibronectina e colagénio, são regulados positivamente [1,2,3].
organização cortical dos filamentos de actina é uma característica marcante de células epiteliais enquanto que as fibras de stress de actina são encontrados em células mesenquimais. Actina do citoesqueleto remodelação é mediada pela Rho GTPases e representa um mecanismo básico crítico para a migração de células durante processos tais como a metástase do cancro. Com relação à EMT, a ativação da RhoA leva a remodelação do citoesqueleto de actina dependente-ROCK e ruptura de aderências celulares E-caderina base [4,5,6,7,8,9]. Várias proteínas associadas ao citoesqueleto de actina tais como α-actinina, cadeia leve de miosina, integrinas, tropomiosinas moesina e têm sido mostrados para ser regulado positivamente durante EMT [3,7,10,11,12,13,14]. reguladores do citoesqueleto de actina também foram identificados como determinantes críticos de progressão do linfoma em uma tela de modelos de tumor de rato [15] a perda de função de RNAi. Expressão de proteínas reguladoras de actina como Arp2 /3 e WAVE2 correlaciona-se com mau prognóstico em carcinomas da mama e do fígado que apoiam um papel para a dinâmica do citoesqueleto de actina e de organização como reguladores críticos da progressão do câncer [16]. Um estudo recente também implicado aumento miosina IIB expressão e miosina IIA cadeia pesada fosforilação no aumento da migração de células epiteliais mamárias e invasão em induzida por TGF-β EMT [17].
Nós mostramos anteriormente que reduziu a expressão de pseudopod- proteínas enriquecidas resultou na dinâmica do citoesqueleto de actina reduzidos e tamanho das células que foram associados com uma reversão de EMT em seis linhas celulares de cancro metastático [18]. Vamos agora mostrar que a despolimerização do citoesqueleto de actina das células cancerosas com citocalasina D (Cit D) induz a translocação nuclear-citoplasmática de fatores de transcrição EMT-associados, o aumento da expressão da caderina-E, a forma da célula reduzida e tamanho e ativação reduzida de RhoA. Em células MCF-7 de cancro da mama, a indução da E-caderina por despolimerização da actina requer RhoA inativação enquanto dominante RhoA activa induz E-caderina. Isto sugere que a remodelação do citoesqueleto de actina da sinalização a montante de RhoA desempenha um papel na EMT.
Materiais e Métodos
Anticorpos e reagentes
rato E-caderina (# 610182) e N anticorpos -cadherin (# 610920) eram de BD Transduction Laboratories; anti-β-actina era da Sigma, anti-vimentina (ab11256) foi de Abcam. Smad1 /2/3 (Sc-7960), SNAI 1 (SC-28199), RhoA (SC-418), (SC-789) anticorpos de c-myc foram de Santa Cruz. anticorpos secundários Alexa488-, Alexa568-, e Alexa647-conjugados e rhodamine- e Alexa568-faloidina conjugada eram de Molecular Probes. Os reagentes para PCR em tempo real foram da Applied Biosystems; o kit de isolamento de ARN era de Qiagen. Citocalasina D e jasplacinolida eram da Calbiochem (Millipore). plasmídeos RhoA foram um presente amável de Nathalie Lamarche (McGill University). grânulos RhoA, MLB tampão de lise e Rac1 mAb eram da Millipore (Upstate).
cultura celular, western blot e microscopia de imunofluorescência
Humano MDA-231, MDA-435, DU145, HT1080, U251 , U87F-7, MCF-7 e as linhas celulares foram HS27 a partir do American Type Culture Collection. MDA-231, MDA-435, e DU145 foram mantidas em RPMI 1640 completo e HT-1080, U251, U87, MCF-7 e células HS27 em DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal, 100 Ul /mL de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, 2 mmol /l de L-glutamina, e 25 mmol de tampão /L de HEPES para RPM1 e piruvato de sódio para DMEM, respectivamente a 37 ° C em 5% de CO
2 incubadora. Para as transferências Western, foram preparados lisados celulares, a concentração de proteína foi determinada utilizando o reagente de Bradford e quantidades iguais de proteína celular foram carregados. Para imunof luorescência, as células cultivadas sobre lamelas de vidro foram fixadas com paraformaldeído a 3% e o anticorpo marcado, como descrito anteriormente [18]. As imagens foram coletadas com × 60 × 100 ou objetivos planapochromat (abertura numérica, 1,35) de um microscópio confocal FV1000 Olympus.
Rho actividade GTPase ensaio
RhoA pull-down foi realizada de acordo com o fabricante do Protocolo (Millipore) e níveis de RhoA GTP e RhoA totais foram detectadas por western blotting utilizando anticorpo RhoA (Santa Cruz Biotechnology). Antes do tratamento com células Cit D foram transitoriamente transfectadas com plasmídeos RhoA utilizando Effectene (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante.
Ensaios
A migração celular e citotoxicidade
Aproximadamente 3 × 10
4 e HT1080 células HS27 foram transferidas para pastilhas não revestidas de cultura de células (migração) 8 mícrons (BD Falcon) em meio contendo 2% de soro. O conjunto foi colocado em placas de 24 poços contendo meio completo. As células foram deixadas ligar-se ao filtro durante 4-6 horas e, em seguida, tratado com diferentes concentrações de D Cit e, como um controlo de veículo, 1% de DMSO, durante 12 horas. Após 12 horas, as células não-migração foram removidos a partir do topo do filtro com uma cotonete e as células que migram na parte inferior do filtro fixadas e coradas com 0,5% de violeta cristal, para os ensaios de citotoxicidade, aproximadamente 7500 células tanto para HT-1080 e HS27 foram plaqueadas em placas de 96 poços durante a noite e tratadas com diferentes concentrações de D Cit ou 1% de DMSO durante 10 horas e depois de tetrazólio solúvel em água (reagente WST-1) foi adicionado às cavidades individuais. 2 horas após a adição do reagente, a absorvância foi lida a 450 nm. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.
-PCR em tempo real
O ARN foi isolado a partir de cada uma das linha de células utilizando o RNeasy Mini Kit Além disso (Qiagen) e foi transcrito reverso usando a alta capacidade kit cDNA Transcrição reversa (Applied Biosystems). A expressão de genes foi quantificado utilizando em tempo real da reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) em um sistema rápido ABI 7500 com sondas Taqman personalizado para cada gene utilizando ensaios de expressão de genes Taqman (Applied Biosystems). A expressão relativa foi determinada utilizando uma curva padrão e expressão gênica normalizado para 18S rRNA abundância.
A análise estatística
Os testes estatísticos foram realizados para determinar o nível de significância entre os grupos controle e tratado. Todos os resultados são apresentados como média ± SEM de pelo menos três experiências. Duas comparações grupo (controle vs tratados ou pontos de tempo em relação ao tempo 0) foram realizadas utilizando o teste t de Student não pareado (Fig. 1, 2, 3, 4 e 5). Para comparações múltiplas de grupo (Fig. 6), One-way ANOVA seguido pelo teste de comparação múltipla de Tukey foi realizada para gerar dados estatísticos.
(A) DU145, MDA-231, MDA-435, HT1080, U251 e as células U87 banhados durante 24 h não foram tratados (controlo) ou tratadas com 100 uM Cit D (D Cit tratados) durante 12 h, fixos e marcados para imunofluorescência de e-caderina (verde) e F-actina (vermelho). Escala: 10 um. (B) DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, as células U251 e U87 foram tratadas com diferentes concentrações de Cit D (0, 10, 50, 100, 200 ^ M) e o tamanho e F significa -actina conteúdo das células foram determinadas usando o software Morfologia Explorador Bioapplication de um Cellomics ArrayScan HCS VTI leitor. **
p Art 0,01 e *
p Art 0,05; em relação às células de controlo (não tratadas).
(A), DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, as células U251 e U87 foram tratadas durante a noite com várias concentrações de Cit D (0, 10, 50, 100, 200 ^ M) e os lisados celulares riscados para e-caderina, N-caderina, vimentina e β-actina. (B) PCR em tempo real para o ARNm da E-caderina foi realizada em ARN total isolado a partir do DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, as células U251 e U87 tratadas com diferentes concentrações de cit D. cit D tratamento aumentou a expressão do mRNA da caderina-e em todas as células, exceto para HT1080 e MDA-231, onde não havia ou expressão mínima. **,
p Art 0,01, *
p Art 0,05; em relação às células de controlo (não tratadas).
(A), DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, as células U251 e U87 foram tratados com Cit D para a indicada vezes e os lisados celulares riscados para e-caderina, N-caderina, vimentina e β-actina. (B) PCR em tempo real para o ARNm da E-caderina foi realizada em ARN total isolado a partir do DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, as células U251 e U87 tratadas em intervalos de tempo diferentes com Cit D . Cit D aumentou tratamento de e-caderina nível de expressão de mRNA em todas as células, excepto para HT1080 e MDA-231 em que não houve ou expressão mínima. **,
p Art 0,01, *
p Art 0,05; em relação ao tempo 0.
(A), DU145, MDA-MB-231, MDA-MB-435, HT-1080, as células U251 e U87 foram tratados (controlo) ou tratadas com 100 uM Cit D (D Cit tratados) durante 12 h e rotulado para imunofluorescência Smad1 /2/3 e SNAI 1, bem como a Hoechst 33342 para coloração nuclear. Imagens representativas para as células MDA-MB-231 são mostrados. (B) As células foram contadas para distribuição nuclear de Smad1 /2/3 e SNAI 1 em controlo e as células tratadas Cit D. Os resultados são apresentados como percentagem do total de células que mostra a distribuição nuclear para essas duas proteínas. Escala: 10 um; **,
p Art 0,01, *
p Art 0,05; em relação ao controlo não tratado para cada linha celular.
células MCF-7 foram tratadas com 100 uM Cit D durante 12 h (A) ou 0-400 nM jasplacinolida (JP) durante 12 h. (B) e os lisados foram transferidas para E-caderina e β-actina. (C) RhoA GTP e RhoA nível total foram determinados em células MCF-7 de células tratadas com 100 uM Cit D durante 12 h. ***
p Art 0,001; relativamente ao controlo. (D) As células MCF-7 foram transfectadas com negativo dominante (DN), do tipo selvagem (WT) e dominante-activo (DA) RhoA durante 48 h, após o que os lisados celulares foram sondadas para c-Myc, E-caderina e β- actina. (E) não transfectadas células MCF-7 ou células MCF-7 transfectadas com RhoA dominante-activo activo foram tratadas com 100 uM Cit D durante 12 h e os lisados de células sondadas para c-Myc, E-caderina e β-actina.
(a) células HT-1080 e HS27 foram tratadas durante a noite com várias concentrações de Cit D (0, 50, 100, 200 uM) e DMSO 1% como controlo do veículo e os lisados de células transferidas para e-caderina , N-caderina, vimentina e β-actina. (B) Para os ensaios de migração, as células semeadas em inserções de células 8 uM para 4-6 horas foram tratadas com as concentrações indicadas de Cit D durante 12 horas e o número de células a migração através do filtro contados. (C) Para avaliar a citotoxicidade de Cit D, as células foram plaqueadas a noite e depois tratadas com as concentrações indicadas de Cit D durante 10 h. Reagente WST-1 foram adicionados a cada poço e depois de duas horas a absorvância foi lida a 450 nm. *
p Art 0,05, **
p Art 0,01 e ***
p Art 0,001; DMSO células tratadas em relação às células não tratadas; Cit D células em relação a células tratadas DMSO tratada.
Resultados
O agente de despolimerização da actina Cit D induz a célula encolhendo e MET
Anteriormente, informou que reduziu citoesqueleto de actina dinâmica sobre a depleção de pseudópode enriquecido AHNAK, Septin 9, eIF4E e S100A11 em células de cancro metastáticas levaram a um aumento da expressão do marcador de e-caderina epitelial e perda de marcadores mesenquimais N-caderina e vimentina, essencialmente invertendo transição epitelial-mesenquimal (EMT) [ ,,,0],18]. Para determinar se alterando a dinâmica do citoesqueleto de actina poderia afetar diretamente EMT nós tratamos seis linhas de células humanas de câncer metastático (próstata DU145, mama MDA-MB-231 e MBA-MB-435, U251 glioma e U87 e fibrosarcoma HT-1080) com a despolimerização da actina agente Cit D. As células expostas a Cit D (100 uM) durante 12 horas mostrou uma dimensão reduzida e coradas positivamente para e-caderina (Fig. 1A). DU145, MDA-MB-435, células HT-1080 e U87 mostrou localização juncional de E-caderina, enquanto as células U251 e MDA-231 apresentou uma mais intracelular localização de E-caderina (Fig. 1A). Concentrações crescentes Cit D de 10 a 200 uM resultou numa diminuição progressiva das células e teor reduzido de F-actina, detectada por marcação fluorescente com Alexa-568 faloidina e análise quantitativa com um Cellomics ArrayScan VTI automatizado gerador de imagens de fluorescência (Fig. 1B).
concentrações mais elevadas de Cit D aumento da expressão de e-caderina e resultou em perda de marcadores mesenquimais vimentina e N-caderina em todas as seis linhas celulares (Fig. 2A). Foi observado o efeito mais pronunciado em 100 e 200 ^ M Cit D e foi acompanhado por aumento de E-caderina ARNm, determinada por qPCR, na maioria das linhas celulares, embora em menor grau nas células HT-1080 e não em MDA MB-231 células (Fig. 2B). O curso de tempo da proteína E-caderina e ARNm de indução em resposta a 100 uM Cit D variou entre as linhas de células. Para DU145, U251, MDA-MB-435 e, em menor grau, U87, a expressão da proteína E-caderina foi induzida em 2 h, e associada com o aumento da E-caderina ARNm (Fig. 3). As células HT-1080 MDA-MB-231 e mostrou pouca ou nenhuma expressão de E-caderina ao nível do ARNm e a expressão de proteína só foi induzida após 8-10 h (Fig. 3). Actina despolimerização por Cit D, portanto, leva ao aumento da expressão da caderina-E, tanto a nível de proteína mRNA com indução de mRNA da caderina-E associada com a indução mais rápida da proteína caderina-E.
Smad1 /2/3 e SNAI1 são factores de transcrição nuclear cuja expressão está associada a EMT [19] e estão localizadas ao núcleo nas células metastáticas estudados [18]. O tratamento de células MDA-MB-231 com 10 uM Cit D resultou na redistribuição drástica das SNAI 1 e Smad1 /2/3 para o citoplasma (Fig. 4 A). Semelhante redistribuição Cit D-dependente destes dois factores de transcrição associada-EMT a partir do núcleo para o citoplasma, foi observado para todas as seis linhas de células metastáticas estudado (Fig. 4 B).
Actina despolimerização regula RhoA activação
a ruptura do citoesqueleto de actina, por conseguinte, induz uma transição epitelial em células de cancro metastáticas. Em seguida, testamos o papel da dinâmica do citoesqueleto de actina em EMT em epiteliais, células MCF-7 de cancro da mama não metastáticas que expressam E-caderina e foram bem caracterizados como um modelo para EMT em células de cancro da mama [20]. Tal como observado para as linhas de células metastáticas, o tratamento de células MCF-7 com níveis de E-caderina elevadas Cit D induzidas (Fig. 5-A). Em contraste, a estabilização do citoesqueleto de actina com concentrações nanomolares de jasplaquinolida, níveis reduzidos de E-caderina (Fig. 5 B). dinâmica de actina, por conseguinte, os impactos E-caderina expressão em células MCF-7. Activado RhoA desencadeia EMT [4,5,9] e indução da E-caderina por meio de tratamento Cit D níveis reduzidos de RhoA activa em células MCF-7 (fig. 5c). Consistentemente, a transfecção de células MCF-7 com a expressão de E-caderina dominante-activo RhoA activa reduzida, enquanto a transfecção com RhoA dominante-negativo aumento da expressão de E-caderina (Fig. 5D). níveis Além disso, em células que expressam dominante RhoA activa, Cit D não impactadas E-caderina (Fig. 5 E). RhoA estado de activação a jusante da dinâmica do citoesqueleto de actina é um regulador chave da expressão de E-caderina em essas células cancerosas.
Cit D não induz MET em fibroblastos normais
Para testar a especificidade de células de cancro de cit indução D de e-caderina, que trataram células de fibrossarcoma HT-1080 e a linha celular de fibroblastos HS27 humano normal, com concentrações diferentes de cit D (50, 100 e 200 um), bem como com 1% de DMSO, como um controlo de veículo, durante 12 horas. Conforme observado antes, o tratamento com D Cit leva à indução de E-caderina em HT-1080 com perda concomitante de N-caderina e vimentina a 50 uM Cit D. Curiosamente, o tratamento com D Cit em HS27 não afectou a E-caderina, N-caderina ou expressão de vimentina sugerindo que a indução Cit D de MET é específico para células cancerosas (Fig. 6A). O tratamento com 10 uM Cit D reduziu significativamente tanto a migração de células HT1080 e HS27 em relação ao DMSO a 1% utilizado como um controlo de veículo (Fig. 6B), sugerindo que a migração celular é mais sensível a perturbações do citoesqueleto de actina. Os ensaios de citotoxicidade demonstrou que Cit D era tóxico para as células a 100 e 200 um, mas não a 10 e 50 uM, em comparação com DMSO a 1% (Fig. 6C).
Discussão
organização é Actina crítico para vários processos celulares, tais como a motilidade celular, divisão celular, movimento organela, sinalização celular e o estabelecimento e manutenção de junções celulares e forma da célula [21,22]. Durante EMT, mudanças na organização da actina são observados e a expressão de muitos genes reguladores de actina é regulada [3,7,10,11,12,13,14]. Descrevemos previamente que a perda de componentes proteicos da pseudopodia ricos em actina de células de cancro metastáticas altera a dinâmica do citoesqueleto de actina, reduz o tamanho das células e induz a expressão de E-caderina e MET [18]. Aqui mostra-se que um agente de despolimerização da actina, D Cit, reduz o tamanho das células e forma, inactiva RhoA e induz a expressão de E-caderina, que define o citoesqueleto de actina como um regulador a montante de EMT em células de cancro metastáticas. Consistente com estes dados, foi anteriormente relatado que a indução de MET através da perda de proteínas enriquecido em pseudópode AHNAK, septina-9, eIF4E, e S100A11, foi associada com a perda de F-actina e maior estabilidade de fibras de F-actina residuais [18] . Importante, Cit D não induziu MET em fibroblastos normais, sugerindo que estes efeitos são específicos para células cancerosas. Se a indução de Met por despolimerização da actina é especificamente relacionadas com a desregulação de pseudopodia célula tumoral permanece a ser determinada.
interacção domínio citoplasmático de E-caderina com complexos de adesão célula-célula e ct-catenina β formando ancorada ao citoesqueleto de actina é fundamental para o estabelecimento de junções célula-célula homotípicas [23]. Tem sido relatado que o tratamento de células com concentrações mais elevadas de Cit D diminui a permeabilidade celular e estabiliza junções apertadas [24]. Foi evidenciado ainda que a montagem de ligações de junção apertados à indução E-caderina sugerindo que a estabilização e formação destes cruzamentos regular os níveis de expressão de E-caderina [25]. Anteriormente, também foi mostrado que a despolimerização da actina com Cit B e induz latrunculin Uma superfície expressão de E-caderina e N-caderina diminuiu e expressão de vimentina no βcells de rato [26]. O tratamento com Cit D também foi mostrado para reduzir a expressão de vimentina em células de cancro pancreático [27]. No nosso estudo, o tratamento de células com Cit D induz a expressão de E-caderina em todas as seis linhas de células metastáticas e também reduz drasticamente o tamanho e forma das células (Figs. 1, 2). O tratamento com Cit D aumentou significativamente nível de transcrição E-caderina em todos, mas as células MDA-231 sugerindo que a regulação do citoesqueleto de actina dos níveis de E-caderina ocorre no mRNA e os níveis de proteína. Mais importante, foi observada uma indução mais rápida de E-caderina nas células que também apresentaram níveis elevados de ARNm da E-caderina que definem um papel crítico para a biossíntese de novo de E-caderina em MET. Na verdade, o aumento dos níveis de Zeb2, um repressor da transcrição da caderina-E, para baixo-regula E-caderina, tanto a nível de ARNm e proteínas e induz EMT [28].
Enquanto foi observada a indução mais robusta do TEM a concentrações superiores de Cit D (100 e 200 uM), que foram associados com a toxicidade celular de 10-20%, que consistentemente observada a indução de MET a 50 uM Cit D, que não foi associado com toxicidade celular significativa e, em células MDA-231 , a 10 uM Cit D. a migração celular foi inibida em 10? M Cit D e as concentrações mais elevadas Cit D que induziram TEM também foram associados com o aumento da inibição da migração e reduziram os níveis de F-actina (Fig. 1B). Nós não observamos indução de MET em fibroblastos normais HS27 em quaisquer concentrações Cit D, indicando que a indução de marcadores epiteliais por despolimerização da actina é célula de câncer específico. A migração celular é, portanto, mais agudamente sensível a despolimerização de actina de reversão de EMT sugerindo que estas duas respostas celulares à base de actina são diferencialmente regulados pelo citoesqueleto de actina.
activação RhoA pode iniciar EMT através da promoção de E-caderina degradação [4 , 5,6,9,29]. Consistentemente, observou-se que a ativação RhoA está associada com níveis E-caderina reduzidos. No entanto, relatos sugerem que a reduzida actividade de RhoA é necessário para EMT no carcinoma do cólon de progressão [30]. Em contraste com um estudo anterior que relatou ativação da RhoA por Cit tratamento D no Swiss 3T3 [31] observou-se redução da atividade RhoA na não-metastáticos MCF 7-células após o tratamento Cit D, que foi acompanhada por um aumento da expressão de E-caderina (Fig . 5). As observações de contraste pode ser devido a diferentes linhas de células utilizadas, fibroblastos vs epiteliais As células MCF-7, ou as concentrações mais elevadas e tempos de incubação mais longos utilizados no nosso estudo. Com efeito, no seu tratamento de estudo foi de 6 h, com 0,5? G /mL (1 uM), em contraste com a nossa tratamento durante a noite com 100