Abstract
O câncer de pâncreas é a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos. O prognóstico continua sombrio com pouco avanço no tratamento. A metformina é um fármaco amplamente utilizado para o tratamento de diabetes tipo II. Dados epidemiológicos recentes revelaram que a administração oral de metformina está associada com um risco reduzido de cancro do pâncreas, sugerindo o seu potencial como um novo medicamento para esta doença. Muitos estudos têm demonstrado a
in vitro
ação anticancerígena de metformina, mas as concentrações normalmente utilizadas foram muito maiores do que o
in vivo
concentrações plasmáticas e nos tecidos atingidos com doses terapêuticas recomendadas de metformina, e baixa concentrações de metformina teve pouco efeito sobre a proliferação de células de cancro do pâncreas. Nós examinamos o efeito de baixas concentrações de metformina em diferentes subpopulações de células de cancro do pâncreas e descobriram que estes inibiu seletivamente a proliferação de CD133
+ mas não CD24
+ CD44
+ ESA
+ células. Nós também examinou o efeito de baixas concentrações de metformina sobre a invasão celular e
in vivo
formação do tumor, demonstrando
in vitro
e
in vivo
ação anticancerígena. A metformina foi associada com uma redução de fosfo-Erk e fosfo-Akt de mTOR independente e fosforilação da AMPK. CD133
+ células de cancro pancreático são consideradas ser células estaminais cancerosas que contribuam para recidiva, metástase e resistência a terapias adjuvantes para o carcinoma pancreático. Nossos resultados fornecem uma base para a combinação de metformina com as terapias atuais para melhorar o prognóstico desta doença
Citação:. Gou S, Cui P, Li X, Shi P, Liu T, Wang C (2013) baixas concentrações de metformina seletivamente Inibição CD133
+ proliferação celular em câncer de pâncreas e têm Anticancer Acção. PLoS ONE 8 (5): e63969. doi: 10.1371 /journal.pone.0063969
editor: Joseph Najbauer, Universidade de Pécs Medical School, Hungria
Recebido: 10 de fevereiro de 2013; Aceito: 10 de abril de 2013; Publicado em: 08 de maio de 2013
Direitos de autor: © 2013 Gou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (No. 81.001.064) (website: https://www.nsfc.gov.cn). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de pâncreas é um dos mais agressiva de tumores sólidos. A cada ano, 43,920 pacientes são diagnosticadas com a doença, resultando em 37,390 mortes por ano nos Estados Unidos e fazer câncer de pâncreas a quarta principal causa de morte relacionada com câncer em ambos os homens e mulheres [1]. Tem havido pouco avanço no tratamento e o prognóstico permanece sombrio [2], [3], [4], [5], com uma taxa de sobrevivência de 5 anos de apenas cerca de 3% e uma sobrevivência média de menos de 6 meses. Entre os pacientes que se submetem à ressecção potencialmente curativa, 5 sobrevivência ano é inferior a 24% por causa da recorrência local e metástases [1], [6], [7]. estratégias terapêuticas novas são, portanto, urgentemente necessários para esta doença altamente maligno.
A metformina é um fármaco amplamente utilizado para o tratamento de diabetes tipo II. Recentemente, dados epidemiológicos revelaram que a metformina, mas não outros medicamentos antidiabéticos, diminui a incidência de câncer de pâncreas em pacientes com diabetes mellitus [8], [9]. Curiosamente, não houve correlação entre o efeito protetor e os níveis de açúcar no sangue dos pacientes [9]. Também foi observado um efeito protector num modelo de tumorigênese hamster gordura de câncer pancreático utilizando N-nitrosobis- (2-oxopropil) amina [10]. Vários
in vitro
estudos estabeleceram uma acção directa de metformina em muitos tipos de células cancerosas, incluindo os de câncer pancreático [11], [12]. A metformina pode, portanto, ser um agente terapêutico potencial no tratamento do cancro do pâncreas, embora o seu mecanismo de acção anti-cancro é ambígua.
In vitro
experimentos revelaram um efeito dependente da dose de metformina sobre a proliferação de células cancerígenas. As concentrações normalmente usadas em tais estudos é 5-30 mm, o que é muito mais elevada do que as concentrações de plasma e tecidos medidos em indivíduos que tenham recebido doses terapêuticas recomendadas, e menos do que 1 mM de metformina tem pouco efeito sobre a proliferação de células de cancro [13] , [14].
Aqui, mostra-se que as baixas concentrações de metformina tem efeitos sobre diferentes sub-populações de células de cancro do pâncreas de acordo com a sua expressão de marcadores de superfície diferencial. CD133
+ e CD24
+ CD44
+ ESA
+ células são consideradas as células-tronco do câncer de pâncreas, ea proliferação de CD133
+ mas não CD24
+ CD44
+ ESA
+ células foi inibida selectivamente por baixas concentrações de metformina. Metformina foi associado com reduções de fosfo-Erk e fosfo-mTOR independente da Akt e AMPK fosforilação. Embora baixo metformina concentração não teve efeito sobre a capacidade proliferativa das células de câncer de pâncreas, em geral, a sua
in vitro
capacidades invasivas e
in vivo
câncer pancreático crescimento xenoenxerto foram significativamente inibido.
Materiais e Métodos
cultura celular
Obtivemos AsPC-1 e células SW1990 da American Type Culture Collection. ASPC-1 células de adenocarcinoma do pâncreas foram derivados das ascite de um paciente fêmea caucasiano de 62 anos de idade com adenocarcinoma do pâncreas; células de adenocarcinoma do pâncreas SW1990 foram derivadas de metástases no baço de um paciente do sexo masculino caucasiano de 56 anos de idade com adenocarcinoma do pâncreas. Ambos os tipos de células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA), suplementado 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Gibco, Billings, MT) e penicilina /estreptomicina (Invitrogen) a 37 ° C com 5% CO
2.
a citometria de fluxo
Para a detecção do marcador de superfície, as células foram ressuspensas em solução salina equilibrada de Hank com 100 uL de 1% de FBS (Gibco). Para o isolamento de CD133
+ células para análises de Western Blot, as células foram ressuspensas em solução salina equilibrada de Hank com 100 uL de 1% de FBS. Ligação ao Receptor de Fc inibidor (eBioscience, Inc., San Diego, CA) foi adicionada e a amostra foi incubada durante 5 min a 4 ° C. Depois de duas lavagens, anti-CD133 isotiocianato de fluoresceína (ITCF) (Biorbyt, Cambridge, UK), Anti-CD24 FITC (eBioscience), Anti-CD44 PE-Cy5 (eBioscience) ou Anti-ESA PE (eBioscience) foi adicionado e a amostra foi incubada durante 30 min a 4 ° C. Depois de duas lavagens, as proporções de células subpopulação que expressavam os marcadores de superfície diferentes foram determinadas utilizando um sistema FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA) e triagem celular de CD133
+ células foi feita utilizando um sistema de FACSAria (BD Biosciences) . dispersão lateral e dispersão para a frente perfis foram utilizados para eliminar dupletos celulares.
Para a análise da apoptose, as células foram tratadas durante 48 h com metformina (0,2 mM para AsPC-1, 0,1 mm para SW1990) ou sem metformina. Em primeiro lugar, as amostras foram incubadas com o inibidor de ligação ao receptor Fc durante 5 min a 4 ° C, em seguida, foi adicionado anti-CD133 FITC e a amostra foi incubada durante 30 min a 4 ° C. Após duas lavagens, a APC Anexina V e iodeto de propídio foi efectuada rotulagem para citometria de fluxo, que foi realizada utilizando um kit de ensaio de Anexina V de acordo com as instruções do fabricante.
Para a análise do ciclo celular, as células foram tratadas durante 48 h com metformina (0,2 mM para AsPC-1, 0,1 mM durante SW1990) ou sem metformina. Após a fixação das células em 70% de metanol, foi adicionado Fc inibidor da ligação ao receptor e a amostra foi incubada durante 5 min a 4 ° C. Anti-CD133 FITC foi então adicionada e a amostra foi incubada durante 30 min a 4 ° C. Após duas lavagens, a amostra foi tratada com RNase e exposto a iodeto de propídio por citometria de fluxo.
proliferação celular ensaio
ensaios de proliferação celular foram realizadas utilizando CCK-8, de acordo com as instruções do fabricante. As células foram semeadas numa placa de 96 poços e cultivadas em 100 ul de DMEM suplementado com FBS a 10%. Após 24 h, as células semeadas foram tratados com 0,02, 0,05, 0,10, 0,20 ou 0,50 mm metformina adicionada ao meio de cultura, ou não receberam metformina. Nos pontos de tempo indicados, o meio foi trocado por 110 ul de DMEM com CCK-8 de reagente e as células foram incubadas durante 2 h. A absorvância foi medida para cada poço a um comprimento de onda de 450 nm utilizando um leitor de microplacas automático.
Crescimento curva
Primeiro, as células foram cultivadas em DMEM isento de soro durante 12 h. As células foram então destacadas por tripsinização e plaqueadas em placas de seis poços em DMEM suplementado com FBS a 10% com metformina (0,2 mM para AsPC-1, 0,1 mM durante SW1990) ou sem metformina a uma concentração de 1 × 10
3 células /poço. O número de células foi avaliada seguinte tripsinização; As amostras de células foram contadas em um hemocitómetro em intervalos de 24 h. Os resultados foram representados graficamente como uma curva de crescimento.
invasão celular ensaio
Um ensaio de invasão de células foi executada em uma câmara de 24 poços Transwell (Corning, Inc., Corning, NY). Em primeiro lugar, a inserção de membrana de policarbonato de poro de 8 um foi revestida com 100 mL de Matrigel (BD Biosciences). Antes do ensaio foi realizado, as células foram tratadas com metformina (0,2 mM para AsPC-1, 0,1 mM durante SW1990) durante 48 h ou não dado metformina. As câmaras foram então colocados em placas de 24 poços; 1 × 10
4 células em DMEM suplementado com 0,2% de FBS foram colocadas em cada uma das câmaras superior, e DMEM suplementado com FBS a 10% com metformina (0,2 mM para AsPC-1, 0,1 mM durante SW1990) ou sem metformina foi adicionado a as câmaras inferiores. Após incubação a 37 ° C durante 48 h, as células que tinham invadido para o lado oposto da superfície da membrana foram coradas com violeta de cristal.
Xenoenxerto experimento
fêmea
nu
/
nu
ratinhos foram obtidos a partir do Centro Experimental animal da União Hospital, Wuhan, China. Para cada experiência, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente em grupos iguais (quatro ratos por grupo) que não foram tratados ou tratados com metformina. Para os grupos tratados, 800 mg /L de metformina foi diluída na água de beber por dia durante a duração da experiência; 72 h mais tarde, toda a população de células de cancro pancreático foram injectadas no flanco direito de cada ratinho. Os tumores foram medidos a cada 3 dias após a injecção e o volume inicial do tumor (V) foi calculado de acordo com V = (comprimento x largura
2) /2. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal do Hospital Union, Huazhong Universidade de Ciência e Tecnologia (Permit Number: 2009-096).
Western blot
A citometria de fluxo classificadas As células foram lavadas em PBS e ressuspensas em tampão RIPA, 1 mM de PMSF, 1 mM de na
3VO
4, e um cocktail de inibidores de protease × durante 3 min em gelo. O lisado foi centrifugado a 14000 × g durante 15 min a 4 ° C e o sobrenadante foi utilizado para a transferência de Western. Os lisados de proteína foram fervidas em tampão de carregamento (Beyotime, Jiangsu, China), resolvidas por electroforese em 8% de gel de SDS-poliacrilamida e transferidos para membranas de PVDF (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, Reino Unido). As membranas foram sondadas durante a noite a 4 ° C com AMPKα, fosfo-AMPKα (Thr172), Akt, fosfo-Akt (Thr308), ERK1 /2, fosfo-Erk (Thr202 /Tyr204), mTOR, e fosfo-mTOR (Ser2448) primário anticorpo (Cell Signaling, Danvers, MA), com β-actina (Cell Signaling) como o controlo. Peroxidase de rábano conjugada com IgG (Beyotime) foi utilizado para detectar proteínas específicas. Finalmente, a imunodetecção foi realizada utilizando substratos quimioluminescentes (Amersham Pharmacia Biotech).
Análise estatística
para citometria de fluxo e ensaios de invasão celular, as experiências foram realizadas em triplicado. O experimento foi realizado de xenoenxerto em quadruplicado. Para os ensaios de proliferação celular e curvas de crescimento, as experiências foram realizadas em seis. Os dados foram apresentados como a média ± desvio padrão, analisados por análise de uma via de variância e comparados entre os grupos usando Student não pareado
t
-teste. Um limiar de significância
P Art 0,05 foi utilizado. Os dados foram analisados usando SPSS v.11 software estatístico (SPSS, Inc.).
Resultados
Baixas concentrações de metformina não inibir a proliferação de células de câncer de pâncreas
Para investigar o efeito de baixas concentrações de metformina sobre a proliferação de células de cancro do pâncreas, foi realizado um ensaio CCK-8 utilizando células AsPC-1 e SW1990. Metformina tem sido mostrado para ter pouco efeito sobre a proliferação de células de cancro do pâncreas em baixas concentrações. Como mostrado na Fig. 1, em que as células de estudos presentes foram tratados com metformina 0,01-0,2 mM durante 72 h, mas a sua sobrevivência não foi inibida.
células AsPC-1 e SW1990 foram incubadas com diferentes concentrações de metformina durante 72 h e números de células viáveis foram determinados por CCK-8 de ensaio. Os resultados são apresentados como a percentagem de células viáveis em relação ao controlo. Não se observou qualquer diferença em células viáveis entre as células tratadas com baixas concentrações de metformina (≤0.5 mM) e controlos. As barras de erro representam o desvio padrão.
Baixas concentrações de metformina diminuiu proporção de CD133
+ células
Para investigar o efeito de baixas concentrações de metformina sobre a proliferação de diferentes subpopulações células de cancro do pâncreas, foi realizado um ensaio de citometria de fluxo utilizando células AsPC-1 e SW1990. As células foram tratadas com metformina 0,01-0,2 mM durante 72 h e a sua expressão de marcadores de superfície analisada. Como mostrado na Fig. 2, baixas concentrações de metformina diminuiu CD133
+ células de uma forma dependente da dose, mas não afetou CD24
+, CD44
+, ESA
+ ou CD24
+ CD44
+ ESA
+ células (CD24
+ CD44
+ ESA
+ células não são detectáveis entre as células ASPC-1).
células ASPC-1 e SW1990 foram incubadas com diferentes concentrações de metformina durante 72 h e as proporções de células que expressam diferentes marcadores de superfície foram determinadas por citometria de fluxo. Os resultados são apresentados como as proporções das diferentes sub-populações de células. As proporções de CD24
+, CD44
+, ESA
+ e CD24
+ CD44
+ ESA
+ células (detectáveis apenas em células SW1990) não foram alteradas pelo tratamento com baixas concentrações de metformina (≤0.2 mm). A proporção de CD133
+ células foi reduzido de uma maneira dependente da dose; metformina 0,2 mM durante AsPC-1 e células metformina 0,1 mM para as células SW1990 diminuiu a proporção de CD133
+ células por meia. Barras de erro representam o desvio padrão.
*
P Art 0,05 (em comparação com o controle)
baixas concentrações de metformina inibiu a proliferação de CD133
+ células por G1 S prisão /Tablet
Para investigar o efeito de baixas concentrações de metformina sobre a proliferação de CD133
+ células de cancro do pâncreas, AsPC-1 e células SW1990 foram tratados com 0,2 mM ou 0,1 mM de metformina, respectivamente. Os números de células foram contadas a cada 24 h e citometria de fluxo foi realizada para determinar os números e as proporções de CD133
+ e CD133
– células nos pontos de tempo indicados. Como mostrado na Fig. 3, a proliferação de CD133
+ células foi inibida selectivamente. Apoptose e análise do ciclo celular foram realizadas 48 horas após as células foram tratadas com metformina (0,2 mM para AsPC-1, 0,1 mM durante SW1990) ou sem metformina; estas baixas concentrações de apoptose induzida em nenhum CD133
+ nem CD133
+ células, mas o ciclo celular da CD133
+ células foi alterada pelo tratamento. Baixa metformina concentração aumentou a proporção de CD133
+ células na fase G0 /G1 e diminuiu a de células em fase S significativamente. O CD133
– ciclo celular não foi afetada (Fig. 4)
A, curvas de crescimento para as células de câncer de pâncreas tratados com baixas concentrações de metformina.. células AsPC-1 e SW1990 foram incubadas com 0,2 mM ou 0,1 mM de metformina, respectivamente, e os números contados em cada ponto de tempo. Os resultados são apresentados como as vezes de aumento em relação a 0 h. B, Efeito de baixas concentrações de metformina sobre a proporção de CD133 células
+. células AsPC-1 e SW1990 foram incubadas com 0,2 mM ou 0,1 mM de metformina, respectivamente, e a proporção de CD133
+ células foi determinada em cada ponto de tempo. A proporção de CD133
+ células diminuiu gradualmente. C, curvas de crescimento para CD133
+ e CD133
– pancreáticas células cancerosas tratadas com baixas concentrações de metformina. O número total de células de cancro do pâncreas e as proporções de CD133
+ e CD133
– células foram determinadas em cada ponto de tempo. Os resultados são apresentados como as vezes de aumento em relação a 0 h. A proliferação de CD133
+ células foi inibida selectivamente. As barras de erro representam o desvio padrão.
A, Efeito de baixas concentrações de metformina sobre a apoptose em câncer pancreático. células AsPC-1 e SW1990 foram incubadas com 0,2 mM ou 0,1 mM de metformina, respectivamente, durante 72 h, e as proporções de células apoptóticas foram determinados por citometria de fluxo. Não foram observadas diferenças significativas entre as células e os controlos tratados. B, Efeitos de baixas concentrações de metformina sobre o ciclo celular no cancro pancreático. células AsPC-1 e SW1990 foram incubadas com 0,2 mM ou 0,1 mM de metformina, respectivamente, durante 72 h, e as proporções de células em cada fase do ciclo celular foi determinada por citometria de fluxo. A diminuição do total de células de fase S e um aumento de fase G0 /G1 sugerem /S prisão G1 em CD133
+ células. Barras de erro representam o desvio padrão.
*
P
. 0,05
Baixas concentrações de metformina inibiram a invasão de células de câncer de pâncreas
ensaio A Transwell foi realizado para examinar o efeito de baixas concentrações de metformina sobre a invasão de células do cancro do pâncreas. O tratamento com metformina (0,2 mM para AsPC-1, 0,1 mM durante SW1990) diminuiu o número de células que invadiram para o lado oposto da membrana da câmara de Transwell em comparação com células que não receberam metformina (Fig. 5B), o que sugere que a baixa concentração de metformina inibe a capacidade invasiva de células de cancro do pâncreas.
Efeito de baixas concentrações de metformina sobre a invasão no câncer de pâncreas. células AsPC-1 e SW1990 foram incubadas com 0,2 mM ou 0,1 mM de metformina, respectivamente, durante 72 h e a invasão de células foi determinado pelo ensaio Transwell. Baixas concentrações de metformina reduz a invasão das células cancerígenas pancreáticas. Barras de erro representam o desvio padrão.
*
P
. 0,05
A administração oral de metformina inibiram o crescimento de xenoenxerto de cancro pancreático in vivo
Para investigar o efeito da baixa metformina dose no câncer de pâncreas
in vivo
, experimentos de xenotransplante utilizando
nu
/
nu
ratos foram conduzidos. Para ratinhos tratados com metformina, a quantidade de droga diluída na água de beber era equivalente a uma dose humana de 20 mg /kg por normalização de área de superfície; a concentração de plasma de metformina em ratos foi cerca de 0,02 mM. Os ratinhos foram sacrificados 18 (células ASPC-1) ou 24 (células SW1990) dias depois de terem sido injectados com células de cancro do pâncreas (5 × 10
6 para células ASPC-1, 1 × 10
7 para células SW1990) . O crescimento de xenoenxertos de cancro do pâncreas foi significativamente inibida pelo tratamento com metformina (Fig. 6).
A, Xenoenxerto no sacrifício. Oitocentos miligramas por litro de metformina foi diluído em água potável de
nu
/
nu
ratos 72 h antes da injeção de células de câncer de pâncreas. Os ratinhos foram sacrificados 18 ou 24 dias após a implantação. Os xenoenxertos de ratinhos tratados com metformina por via oral foram muito menores do que aqueles a partir de ratinhos não tratados. B, efeito da administração oral de metformina sobre o crescimento de xenoenxertos. Oitocentos miligramas por litro de metformina foi diluído em água potável de
nu
/
nu
ratos 72 h antes da injeção de células de câncer de pâncreas. Os tumores foram medidos a cada 3 dias após a injecção e o volume do tumor (V) foi calculado de acordo com V = (comprimento x largura
2) /2. crescimento de xenoenxerto foi significativamente inibido pela administração oral de metformina. Barras de erro representam o desvio padrão.
*
P
. 0,05
Baixas concentrações de metformina inibiram a fosforilação de mTOR independente da Akt e AMPK fosforilação em CD133
+ células
Para identificar possíveis determinantes moleculares dos efeitos da metformina sobre CD133
+, avaliou-se a activação de AMPK, Erk, Akt e – três quinases que podem estar envolvidos nestes efeitos. mTOR, que é fosforilada pela AMPK, Erk, e AKT, também foi avaliada. Após o tratamento com metformina durante 4 h (0,2 mm para AsPC-1, 0,1 mM durante SW1990), reduções de fosfo-Erk e fosfo-mTOR foram observadas em CD133
+ células, sugerindo um requisito para a inibição de Erk e mTOR pela da acção anti-proliferação de metformina. Não se observou qualquer alteração significativa do fosfo-AMPKα, ao passo que a fosfo-Akt aumentado após o tratamento com metformina, o que sugere que o efeito inibitório de metformina em mTOR era independente da AMPK e fosforilação de Akt (Fig. 7).
pâncreas células cancerosas foram tratados com metformina durante 4 h (0,2 mM para AsPC-1, 0,1 mM para SW1990) e CD133
+ células foram ordenados por citometria de fluxo. Expressão de AMPKα, Akt, ERK1 /2, e mTOR e fosforilação de CD133
+ células foram avaliadas por transferência de Western e os resultados foram quantificados utilizando o ImageJ V.1.46r (National Institutes of Health). Diminuições significativas de fosfo-ERK1 /2 e a expressão de fosfo-mTOR e um aumento significativo da expressão de fosfo-Akt foram observadas nas células tratadas metformina. Barras de erro representam o desvio padrão.
*
P
. 0,05
Discussão
A metformina reduz a produção hepática de glicose e aumenta a sensibilidade à insulina e utilização de glicose pelos músculos e adipócitos, resultando em diminuiu insulinemia e melhora de sensibilidade à insulina em pacientes diabéticos. É o antidiabético mais prescrito para diabetes tipo II [15] e também é usado para outras doenças que apresentam resistência à insulina, incluindo a síndrome do ovário policístico [16], doença hepática gordurosa não alcoólica [17] e puberdade precoce [18] . Recentemente, ele ganhou atenção para a sua eficácia potencial como fármaco anti-cancro. Em trabalho pioneiro, Evans et al. demonstrou pela primeira vez em 2005, que o tratamento com metformina pode estar associada com um risco reduzido de cancro em pacientes com diabetes tipo II [19]. Em 2009, um estudo de caso-controle incidindo sobre o efeito das terapias anti-diabéticos sobre o risco de câncer de pâncreas foi publicado por Li et al. e demonstrou que a metformina reduziu significativamente o risco de câncer de pâncreas, com odds ratio de 0,38 [9]. A eficiência da metformina na redução da incidência de câncer de pâncreas tem sido apoiado por outros estudos epidemiológicos e animais [8], [10] proteína quinase.
Embora mecanismo antidiabético de metformina de ação permanece incerto, a ativação da AMP-ativada (AMPK) tem sido amplamente aceito como um possível mecanismo. AMPK é uma enzima importante envolvida na sinalização de insulina, o metabolismo da glicose e gorduras, e a produção de glicose pelas células do fígado. Muitos estudos celulares concentraram-se em AMPK e moléculas relacionadas e têm revelado uma ação anticancerígena de metformina
in vitro
[12], [20], [21]. Um estudo recente demonstrou também a acção antitumoral da metformina sobre as células estaminais do cancro pancreático [13]. De nota, a maioria destas experiências usadas concentrações de metformina (tipicamente 5-30 mM) que são muito mais elevadas do que as doses terapêuticas recomendadas para uso clínico. Quando as concentrações foram reduzidas para a mesma ordem de grandeza que a encontrada no plasma e tecidos de indivíduos que recebem doses terapêuticas, não foi observada inibição da proliferação celular. Os nossos dados mostram que a proliferação de células de cancro do pâncreas não é inibido pela metformina inferior a 0,5 mM
A maioria dos tumores, incluindo cancro do pâncreas, são heterogéneas.; isto é, que compreendem células de diferentes características fenotípicas e biológicas. A hipótese de células estaminais cancro sugere que apenas uma pequena subpopulação de células, definido como cancro de células estaminais, tem a capacidade de dar origem a todos os tipos de células encontradas numa amostra de cancro particular. células-tronco cancerosas têm um papel chave na tumorigênese, crescimento, invasão, metástase, recorrência e resistência à terapia adjuvante do câncer [22], [23]. Portanto, nós suspeitamos que baixas concentrações de metformina pode afetar as células estaminais do cancro do pâncreas e células cancerosas não estaminais de forma diferente, o que poderia explicar a droga da
in vivo
ação anticancerígena e a inconsistência de
in vitro
e
in vivo
resultados. Porque CD133
+ e CD24
+ CD44
+ ESA
+ células foram documentados para ser células-tronco cancerosas pancreáticas [24], [25], [26], determinou-se o efeito da baixa concentrações de metformina sobre estas subpopulações, demonstrando uma proporção menor de CD133
+ células. Considerando o pequeno efeito de baixas concentrações de metformina sobre a proliferação de células de cancro do pâncreas, em geral, pode-se inferir que a proliferação de CD133
+ células, mas não de CD24
+, CD44
+, ESA
+ ou CD24
+ CD44
+ ESA
+ células, foi inibida de forma seletiva. Hermann et ai. demonstrou que CD133
+ e CD24
+ CD44
+ ESA
+ células sobrepostas mas não eram idênticas em células L3.6pl derivados de COLO 357 células de câncer pancreático [25]. Nossos resultados mostraram que CD133
+ células, mas não CD24
+ CD44
+ ESA
+ células são detectáveis entre as células AsPC-1. Quanto às células SW1990, CD24
+ CD44
+ ESA
+ células, o que representou 5,46% de todas as células, eram insensíveis à metformina, sugerindo que as características biológicas de CD133
+ e CD24
+ CD44
+ ESA
+ células diferentes. Determinou-se ainda mais a proporção de CD133
+ células a cada 24 h durante 5 dias após o tratamento de células de cancro do pâncreas com baixas concentrações de metformina e curvas de crescimento produzidos por tanto CD133
+ e CD133
– células. A inibição seletiva de CD133
+ células era clara. Acumulando
in vitro
evidência sugere que altas concentrações de metformina pode exercer um efeito anti-tumoral através da indução de apoptose e /ou paragem do ciclo celular, mas há poucos dados publicados para baixas concentrações. Assim, também investigamos o efeito da baixa concentração de metformina sobre a apoptose e o ciclo celular. A apoptose, que tem sido documentada como sendo importantes na acção antitumoral da metformina, foi induzida em nenhum CD133
+ nem CD133
– células. prisão G1 /S foi induzida em CD133
+ mas não em CD133
– células. G1 /S prisão podem, portanto, desempenhar um papel fundamental na inibição seletiva de CD133
+ células.
Em seguida, conduzido
in vitro
in vivo
experimentos para Comprar e verificar a ação anticancerígena de baixas concentrações de metformina no câncer pancreático. células de cancro do pâncreas tratados com metformina durante 72 h foram usadas para ensaios de invasão celular, porque o tratamento diminuiu a proporção de CD133
+ células por meia. A metformina foi diluída na água de beber de
nu
/
nu
ratinhos 72 h antes do experimento de xenoenxerto para alcançar uma concentração plasmática em estado estacionário de acordo com a farmacocinética da metformina [27]. Tanto o ensaio de invasão in vitro e no ensaio de xenoenxerto in vivo apoia a acção anticancerígena de baixa concentração de metformina. As diferenças de volumes tumorais SW1990 xenoenxerto não foram estatisticamente significativas no dia 21 (
P
= 0,062) ou o dia 24 (
P
= 0,055). Isto pode ser devido ao pequeno tamanho da amostra. Considerando o pequeno efeito da metformina sobre a proliferação de CD133
– células e o papel-chave de células-tronco cancerosas na progressão tumoral, invasão e metástase [28], [29], tentaremos sugerem que a inibição seletiva de CD133
+ contribui significativamente para o in vitro e in vivo de efeito anticancerígeno metformina.
próxima avaliada a expressão de moléculas que podem determinar a acção anti-cancro da metformina sobre CD133
+ células de cancro do pâncreas. A activação de mTOR é regulada por factores de crescimento e nutrientes, e que regula o crescimento celular através do controlo da tradução do mRNA, biogénese ribossoma, autofagia, e metabolismo [30]. Muitos alvos de mTOR quinase são sobre-expressos ou mutado no cancro, que se correlaciona com a progressão do cancro, o prognóstico negativo, e a resistência à quimioterapia [31]. Nos últimos anos, foi encontrado mTOR a desempenhar papéis importantes na manutenção de células estaminais do cancro, [33] [32]. Portanto, a mTOR tem sido considerado como sendo um alvo terapêutico no cancro que pode ser alvo de metformina [34], [35]. Um efeito inibidor da metformina sobre a fosforilação de mTOR, que foi avaliado em células de cancro, incluindo os de cancro pancreático [36], [37], foi observada em células CD133
+ células cancerígenas pancreáticas neste estudo. Embora a metformina tem sido documentada para induzir activação de AMPK em células de cancro do pâncreas, que não se observou este fenómeno, o que pode ser devido à baixa concentração de metformina é utilizada neste estudo [36]. Erk e Akt são dois outros mediadores de mTOR em células cancerosas. A mutação de K-Ras, a mutação predominante no cancro pancreático, conduz à activação aberrante de Erk em células de cancro do pâncreas, o que por sua vez leva à activação de mTOR [38]. Nós demonstramos concordância da atividade inibitória da metformina sobre a Erk e mTOR no CD133
+ células, o que nos leva a sugerir que a revogação dependente Erk da ativação do mTOR desempenha um papel importante na ação anticancerígena de metformina. Recentemente, um efeito inibidor selectivo semelhante de metformina em CD133
+ células cancerosas devido à metformina inibição induzida de Akt foi documentada no glioblastoma [39]. Em contraste, os nossos resultados demonstram que a metformina activação induzida de Akt em CD133
+ células de cancro do pâncreas. Nós tentativamente sugerem que dois mecanismos podem contribuir para a activação de Akt em CD133
+ células de cancro do pâncreas. Em primeiro lugar, a metformina induz a re-expressão de miR-200 no cancro pancreático [13]. FOG2 reprime PI3K pela ligação da subunidade p85α e miR-200 ativa o PI3K /Akt via de sinalização mediante a anulação do FOG2 [40]. Em segundo lugar, Erk inibição dependente da mTOR pode mediar um loop de feedback que aumenta a fosforilação da Akt [41].
Em conclusão, nossos resultados revelam que baixas concentrações de metformina, da mesma ordem como os medidos no plasma e tecidos dos indivíduos que receberam uma dose terapêutica recomendada de metformina, inibe selectivamente a proliferação de CD133
+ células de cancro do pâncreas e tem uma ação anticancerígena ambos
in vitro
e
in vivo
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